Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux

Résumé

Ce protocole vise à tester la capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain périvasculaire se différencier en plusieurs lignées cellulaires. La différenciation a été comparée à des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine, qui est appelée à se différencier en adipocytes et ostéocytaires chondrocyte lignées.

Résumé

Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire, lignées chondrogéniques et. La différenciation adipocytaire de cellules progénitrices est un mécanisme important de conduire l’expansion du tissu adipeux et la dysfonction en réponse à l’obésité. Modifications de compréhension pour le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) est donc cliniquement pertinentes dans les maladies métaboliques. Cependant, des études antérieures ont été principalement effectuée chez la souris et autre animaux modèles. Ce protocole utilise des échantillons TVAP thoraciques humains prélevés sur les patients subissant une coronaropathie pontage aorto-coronarien greffon. Le tissu adipeux de l’aorte ascendante a été collecté et utilisé pour l’explantation de la fraction stroma vasculaire. Nous avons déjà confirmé la présence de cellules progénitrices adipeuse dans TVAP humaine ayant la capacité de se différencier en contenant des lipides adipocytes. Dans cette étude, nous avons analysé plus loin le potentiel de différenciation des cellules de la fraction vasculaire stromale, contenant probablement des cellules progénitrices multi-puissant. Nous avons comparé les cellules TVAP dérivées de la moelle osseuse humaine MSC pour une différenciation adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques lignages. Après 14 jours de la différenciation, des colorants spécifiques ont été utilisés pour détecter l’accumulation de lipides dans les adipocytes (huile rouge O), des dépôts calcifiées en cellules ostéogéniques (alizarine rouge), ou de glycosaminoglycanes et de collagène dans les cellules chondrogéniques (Trichrome de Masson). Alors que la moelle osseuse MSC distingue efficacement tous les trois lignées, cellules dérivées de TVAP avaient adipocytaire et chondrogéniques potentielle, mais n’avait pas de potentiel ostéogénique robuste.

Introduction

Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques lignages¹. Ce tissu se développe à travers une hypertrophie des adipocytes matures et de différenciation de novo du SMC résident aux adipocytes. Le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) entoure les vaisseaux sanguins et régule la fonction vasculaire^2,3. Expansion de TVAP induites par l’obésité aggrave des pathologies cardiovasculaires. Alors que le potentiel multipotent du SMC de dépôts adipeux sous-cutané humaines ont été bien étudié^4,5, aucune étude ont explantées et évalué la capacité de différenciation des humains dérivés TVAP progénitrices, probables due à le pouvoir envahissant des marchés. Ainsi, l’objectif de ce travail est de fournir une méthodologie d’explantation et propager des cellules progénitrices de humaine TVAP aortique chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires et de tester leur propension à se différencier à ostéogénique, chondrogéniques et adipocytaire lignées. Notre source de TVAP est sur le site de l’anastomose de la greffe de pontage sur l’aorte des patients obèses devant subir une chirurgie de greffe pontage artère coronaire ascendante. TVAP fraîchement isolées est enzymatiquement dissociées et la fraction stroma vasculaire est isolée et propagée in vitro, ce qui nous permet de tester pour la première fois la capacité de différenciation des cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine.

Utilisant primaire culture humaine TVAP stroma vasculaire fraction, nous avons testé trois tests conçus pour induire les cellules souches/progénitrices vers adipocytaire, ostéogénique, ou chondrogéniques lignages. Notre étude préalable identifié une population de CD73 +, CD105 + et PDGFRa + (CD140a) des cellules qui peuvent se différencier robuste en adipocytes⁶, bien que leur multipotentialité n’a pas été testée. TVAP régule directement de ton et l’inflammation vasculaire⁷. La raison d’être pour tester le potentiel de différenciation de cette population de cellules nouvelles doit commencer à comprendre l’influence spécialisé de TVAP sur la fonction vasculaire et les mécanismes d’expansion TVAP au cours de l’obésité. Cette méthode améliore notre compréhension des fonctions des cellules progénitrices dérivées de tissus adipeux et nous permet d’identifier et de comparer les similitudes et les différences des cellules progénitrices de sources de tissus différents. Nous inspirer des approches établies et validées pour isoler et de différencier les MSC vers différentes lignées et optimiser les procédures afin de maximiser la viabilité de cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine. Ces techniques ont des applications larges dans le domaine des souches et progénitrices cellule recherche et le tissu adipeux de développement.

Protocole

L’utilisation de tissus humains dans cette étude a été évaluée et approuvée par l’institutionnel Review Board de Maine Medical Center, et tout le personnel a reçu une formation appropriée avant l’expérimentation.

1. les préparatifs

1. Faire le tampon de dissociation en reconstituant 50μg collagénase/a animal-libre j’ai mélange solution 1 ml de solution de travail nanopure H₂O. Prepare 1 mg/mL en ajoutant 49 mL d’hyperglycémie DMEM contenant 1 % w/v BSA à la collagénase reconstitué / solution de l’a. Stocker les aliquotes de travail de 5 mL à-20 ° C et chaud à 37 ° C à l’aide d’un avant de bain d’eau à utiliser.
2. Faire une solution antibiotique en ajoutant 1 mL de solution antibiotique/antimycosiques x 100 (concentration finale est 200 unités/mL de pénicilline, 200 unités/mL de streptomycine et 0,5 µg/mL fungizone) à 49 mL de HBSS et stocker sur la glace.
3. Préparer la solution de gélatine (0,2 % p/v) de dissoudre la gélatine de 200 mg de peau bovine dans 100 mL de nanopure H₂O. Autoclave la solution pendant 20 min et conserver à 4 ° C.
4. Préparer 500 mL de milieu de culture de TVAP : hyperglycémie DMEM/F12 avec supplément de glutamine, pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, additionné de 10 % FBS et agent antimicrobien de 100 µg/mL (voir Table des matières).
5. Préparer 50 mL de milieu d’induction adipocytaire : hyperglycémie 40,8 mL DMEM, additionné de 7,5 mL de milieu de croissance TVAP, 500 µL de 100 x solution antibiotique/antimycosique (concentration finale est de 100 unités/mL de pénicilline, 100 unités/mL de streptomycine et fungizone 0,25 µg/mL), 0,5 mM IBMX (stock de 500 mM dans NaOH 0,1 M), 1 dexaméthasone µM (stock de 1 mM dans l’éthanol), 5 µM rosiglitazone (stock 5 mM dans le DMSO), 33 biotine µM (stock 66 mM dans le DMSO), 100 nM d’insuline (200 stock µM dans l’acide acétique 0,1 %) et Acide pantothénique de 20 µM (stock 100 mM H₂ O).
6. Préparer 50 mL de médias induction contrôle la lignée adipocytaire : hyperglycémie 40,8 mL DMEM supplémenté avec 7,5 mL de milieu de croissance TVAP et 500 µL de strep-stylo (stock de x 100).
7. Préparer 50 mL de milieu de maintenance adipocytaire : hyperglycémie 41,5 mL DMEM additionné de 7,5 mL TVAP milieux de croissance de l’étape 1.3, 500 µL strep-stylo (stock de x 100), dexaméthasone 1 µM (stock 1 mM EtOH), 33 biotine µM (stock 66 mM dans le DMSO), 100 d’insuline nM (stock 200 µM dans 0,1 % ac ETIC acide) et 20 µM d’acide pantothénique (stock 100 mM H₂O).
8. Préparer 500 mL de milieu de culture pour les lignées ostéogéniques et chondrogéniques : supplément de FBS, 1 glutamine x αMEM de forte concentration de glucose additionné de 10 % (voir la Table des matières) et 5 mL de strep-stylo (stock de x 100).
9. Préparer 50 mL de médias de l’induction pour la lignée ostéogénique : 50 mL de milieux de croissance MSC moelle osseuse additionné de 10 dexaméthasone nM et β-glycérophosphate de 10 mM.
10. Préparer 50 mL de médias de l’induction pour la lignée de chondrogéniques : 50 mL de milieux de croissance MSC moelle osseuse additionné de 100 nM dexaméthasone, 50 µg/mL sodium ascorbate-2-phosphate et 10 ng/mL TGFβ1. Pour les conditions ostéogéniques et chondrogéniques, les milieux de croissance basale de la moelle osseuse MSC servira les médias non-induction.

2. protocole 1 : Culture TVAP humain cellules de la Fraction stroma vasculaire

Remarque : TVAP est réséqué à partir du site de l’anastomose du greffon sur l’aorte ascendante des patients anesthésiés coronarienne bypass graft interventions. TVAP aortique est placé dans un 15 mL conique contenant 10 mL glace froide hyperglycémie DMEM F12 et transféré de la salle d’opération au laboratoire dans les 2 h de résection. TVAP aortique est mis au rebut des tissus au cours de la procédure de contournement et a été considérée comme la recherche de sujets non humains par la Commission d’examen interne du Maine Medical Center.

1. Ce protocole est un morceau de ~ 500 mg de TVAP humaine (environ 3 x 1 x 0,5 cm³). Transfert TVAP humain frais de DMEM dans un tube conique de 50 mL contenant 25 mL de solution antibiotique. Incuber à bascule pour 20 min à 4 ° C. Lorsque la TVAP est une solution antibiotique, décongeler une partie aliquote de tampon de dissociation à 37 ° C.
2. Ajouter 50 µL de solution antibiotique/antimycosiques 100 x dans 5 mL de tampon de dissociation et stériliser à l’aide d’une seringue-filtre de 0,22 µm. Ajouter 1 mL de solution de gélatine à 1 bien sur une plaque 24 puits. Dans une hotte à flux laminaire, utiliser une pince stérile et ciseaux transférer TVAP de la solution antibiotique à une boîte de Petri stérile. Ajouter 1 mL de tampon de dissociation préchauffé au tissu et Émincer finement les tissus ensemble dans une boue (pas de morceaux plus de ~ 2 x 2 mm²) à l’aide de la pince stérile et ciseaux de dissection.
3. Transférer la pâte de 1 mL à 4 mL de tampon de dissociation et incuber le tube sur le côté dans un agitateur orbital préchauffé 37 ° C à 200 tr/min pendant 1 h. Après 1 h, aucune pièce de tissus visibles ne seront présents, et la solution apparaîtra comme une suspension de cellules nuageuses.
4. Filtrer la solution à travers un tamis de cellule 70 µm placé sur un tube conique de 50 mL. Rincer le filtre avec une solution antibiotique supplémentaire 10 mL de capturer autant de cellules que possible. Pas presser de la crépine.
5. Les cellules pendant 12 min à 300 x g dans une centrifugeuse de seau se balançant à pellets.
   Remarque : Après centrifugation, le tube est séparé en une couche supérieure grasse des adipocytes, une interphase et un culot. Le culot est la fraction vasculaire stroma contenant des cellules endothéliales, les cellules immunitaires, cellules sanguines et des cellules progénitrices.
6. Resuspendre le culot dans 10 mL de HBSS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages en HBSS. Après le lavage final, ne pas lyser les globules rouges. Des tentatives répétées avec plusieurs tampons disponibles sur le marché et les durées d’incubation ont conduit à des réductions marquées dans la fixation des cellules progénitrices et viabilité.
7. Aspirer la gélatine de la plaque 24 puits. Laver délicatement le bien 1 x avec HBSS pour supprimer la gélatine non lié.
8. Resuspendre stroma vasculaire fraction culot avec intact de globules rouges dans 1 mL de milieux de culture et de la graine sur l’enduit de gélatine bien. Ajouter FGF2 humaine (remis en suspension dans du PBS additionné de BSA 0,01 % p/v) à une concentration finale de 25 ng/mL dans le milieu de culture. Incuber 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
9. Le lendemain, milieux de culture d’enlever et laver puits 5 x avec HBSS pour éliminer les globules rouges et les cellules mortes. Ajouter 1 ml de milieux de culture fraîche additionnée de 25 ng/mL FGF2.
10. Modifier les médias toutes les 48 h, en veillant à compléter avec 25 ng/mL FGF2 frais chaque fois.
11. Cellules atteignent généralement 100 % confluence 7-10 jours après l’explant ; cellules de passage puis :
    1. Aspirer la monocouche de médias et lavage de croissance 2 x 1 ml HBSS. Aspirer toutes les HBSS provenant des puits et ajouter quelques gouttes de solution de dissociation cellulaire.
    2. TAP et agiter la plaque plusieurs fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO₂ pendant 5 à 7 min de lever les cellules. Ajouter environ 1 mL de milieu de culture frais aux cellules individuelles et distribuer 500 µL sur 2 puits d’une plaque 24 puits, chaque conteneur milieux de croissance de 500 µL et 25 ng FGF2.
12. Continuer à élargir les cellules humaines dérivées de TVAP comme indiqué dans l’étape précédente. Chaque passage doit être pas supérieure à une scission de 1:2. Les cellules sont repiquées 5 à 7 fois avant d’allouer pour des dosages de différenciation.

3. protocole 2 : Culture la moelle osseuse humaine MSC Colonies

Remarque : La moelle osseuse humaine MSC sont isolés comme décrit⁸ et stockés en tant que passage début congelés les stocks en geler médias (70 % BF 20 % basal DMEM et 10 % DMSO) à ~ 100 000 cellules/mL dans le liquide N₂.

1. Rapidement décongeler un flacon de la moelle osseuse MSC de la liquide N₂ dans un bain-marie à 37 ° C et la plaque à un puits d’une plaque de 6 puits culture contenant 3 mL de milieux de culture de MSC et incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. Le lendemain, aspirer les milieux de culture MSC et laver les cellules 3 x dans 2 mL de HBSS. Au confluent de 100 %, aspirer les milieux de culture et laver les cellules 3 x dans 2 mL de HBSS. Ajouter 500 µL/puits cellule détachement solution et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 5 min. robinet la plaque pour s’assurer que toutes les cellules sont délogés et répartir le contenu de 2 puits d’une plaque de 6 puits contenant des milieux de culture pour le MSC 2 mL.
3. Développez la moelle osseuse humaine et dérivés TVAP MSC en parallèle pour environ 5 à 7 passages, ou jusqu'à ce que des quantités suffisantes pour les tests ont été réalisés.

4. Protocole n° 3 : Plaque et induire adipocytaire, ostéogénique et des lignées de Chondrogéniques

1. Réplique les numéros appropriés de la plaque de la moelle osseuse et de cellules dérivées de TVAP / puits d’une plaque de 12 puits et approprié pour chaque condition expérimentale. Pour adipocytaire et conditions ostéogéniques, ~ 200, 000 – 225 000 cellules/puits est nécessaires, pour des conditions chondrogéniques, 150 000 à 175 000 cellules/puits sont nécessaires.
   Remarque : Nous avons couru un minimum de N = 3 puits répétées pour contrôle et induit des conditions pour chaque lignée expérimentale pilotée par un total de 2 indépendants (N = totales 6 répétitions).
2. Dissocier les cellules à la fois la population de cellules progénitrices TVAP humaine et la population de MSC de la moelle osseuse humaine en utilisant la solution de détachement cellulaire et l’incubation à 37 ° C et 5 % de CO₂ pour les populations de piscine 5 min. dans deux flacons distincts 15 mL conique. Tourner le flacon vers le bas à 500 x g pendant 7 min granuler les cellules. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS et un hémocytomètre permet d’estimer le nombre de cellules.
3. Les cellules dans les plats de 12 puits de la plaque comme indiqué au point 4.1. Prévoir des plats séparés induit et non induite adipocytaire, ostéogénique et conditions afin que la condition non induite peut être fixée à un stade antérieur de temps sans interruption de poursuivre la culture de l’état induit.
4. Ajouter 1,5 mL d’adipocytaire et médias induction ostéogénique dans chaque loge de la condition induite. Ajouter 1,5 mL d’adipocytaire et ostéogéniques non induction médias dans chaque loge de la condition de non induite. Commencer l’incubation de l’adipocytaire et les populations de cellules ostéogéniques d’induits et non induite à 37 ° C et 5 % de CO₂.
5. Tournez en bas le volume restant des cellules progénitrices TVAP humaines et de la moelle osseuse humaine MSCs pendant 7 min à 500 x g.
6. Déterminer le volume nécessaire pour remettre en suspension les restants de la moelle épinière et granules cellulaires dérivées TVAP pour atteindre une densité de 100 000 cellules/10 µL (10⁶ cellules/mL). Remettre en suspension les boulettes du volume calculé des milieux de culture MSC pour l’induction de lignage chondrogéniques. Déplacez doucement le volume des cellules et descendre à l’aide d’une pipette pour assurer une répartition homogène.
7. Pipetter une goutte de 10 µL de la solution de cellules concentrées dans le centre de chaque puits pour former un micromass de 100 000 cellules. Placer 1 mL stérile H₂O dans le puits adjacent pour éviter l’évaporation. Incuber les cultures micromass pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO₂ pour permettre la micromass à agréger.
8. Après 2 heures, ajouter avec précaution les médias de différenciation chondrogéniques additionné de 10 ng/mL TGFβ1 humaine à chacun des puits induite-condition. Ajouter avec précaution 1,5 mL des médias non induction (milieux de culture MSC de la moelle osseuse) dans les puits de condition non induite. Utiliser les plaques séparées de 12 puits pour les conditions induites ou non induite afin que la condition non induite peut être fixée à un stade antérieur de temps.

5. protocole 4 : Culture adipocytaire, ostéogénique et des lignées de Chondrogéniques pendant 14 jours

1. Les conditions induites ou non induite de tous les trois lignées de la culture pendant 4 jours à 37 ° C et 5 % CO₂, rafraîchissant médias tous les 2 jours. Jour 4, changer la condition de lignée d’adipocytaire induite de médias d’induction aux médias d’entretien pour le reste de l’essai.
2. Difficulté les conditions non induite dans du formol 10 % pendant 12 h. Dispose de formol et laver tous les fixes puits 2 x dans du PBS pour éliminer toute trace de formol. Stocker les plaques dans du PBS à 4 ° C jusqu’au traitement.
3. Les conditions induites pour un total de 14 jours, rafraîchissant médias tous les 2 jours de culture. Ajouter TGFβ1 fraîches à 10 ng/mL concentration finale avec chaque rafraîchissement des médias chondrogéniques induction. Continuer à la culture de la lignée adipocytaire dans l’adipocytaire entretien médias et lignée ostéogénique induction, actualiser tous les 2 jours. Au jour 14, fixer des conditions tout induites pendant 12 h dans du formol 10 % pour la coloration.
4. Grattez ou verser le micromass dans la condition chondrogéniques induit dans une cassette pour l’enrobage. Déshydrater les micromass dans une série de bains d’alcool de plus en plus concentrés pendant 5 min, commençant à 70 %, puis à 80 %, deux fois plus de 95 % et deux fois plus dans l’alcool absolu. Placez la cassette dans un agent de la désalcoolisation et ensuite enfin incorporer la cassette en cire de paraffine pour coupes et coloration.

6. protocole 5 : Coloration adipocytaire Condition avec de l’huile rouge O

1. Préparer la solution mère Oil Red O en dissolvant 350 mg d’huile rouge O dans 100 mL d’isopropanol 100 %. Mélanger pendant 2 h avec une barre de remuer et vide à travers un filtre de 0,2 µm. Solution mère peut être stockée dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 an.
2. Préparer l’huile rouge O solution de travail en mélangeant 3 parties de solution mère à 2 parties diH₂0 (par exemple 60 mL de solution mère à 40 mL diH₂0). La concentration finale de Oil Red O dans la solution de travail est de 2,1 mg/mL.
3. Retirez tout fluide de puits. Laver chaque fois bien 2 avec 60 % isopropanol, en veillant à enlever toute l’eau sur les côtés des puits. Aspirer les 60 % isopropanol et ajouter rapidement la solution de travail Oil Red O sans toucher les parois des puits pour recouvrir le fond. Il est essentiel que cette étape se faite rapidement afin de ne pas faire sécher les puits.
4. Une fois l’huile rouge O est ajouté, incuber pendant 10 min à température ambiante avec le doux balancement.
5. Supprimer tous les Oil Red O et ajouter immédiatement distillée H₂O. Wash avec distillée H₂O pour 10 m commencer à supprimer non lié o d’huile rouge. Après 10 min, aspirer l’huile rouge O et répéter la procédure de lavage 3 x.
6. Une fois que le lavage est terminé, ajoutez PBS et les cellules de l’image. Stocker des cellules colorées dans du PBS à 4 ° C.

7. Protocole n° 6 : Coloration ostéogénique Condition d’alizarine rouge

1. Retirez tous les fluides de chaque puits. Ajouter un volume approprié de solution à 2 % alizarine rouge tache dans chaque cupule (1,5 mL / puits d’une plaque de 12 puits) et incliner délicatement la plaque à côté jusqu'à ce que la solution couvre entièrement le fond du puits.
2. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Enlever alizarine rouge provenant des puits. Rincer doucement chaque puits quatre fois avec distillée H₂O, en veillant à ne pas déloger les cristaux de calcium. Laisser pour sécher.

8. protocole 7 : Coloration Chondrogéniques Condition avec Masson Trichrome

1. Cuire au four de diapositives dans un four sec à 60 ° C pendant 30 min. des sections Deparaffinize et hydrate à l’eau distillée.
   1. Pour réhydrater, placer les lames dans trois des incubations 5 min avec des agents de désalcoolisation, suivies des incubations de 5 min en descendant des concentrations d’alcool comme suit : deux à 100 % (éthanol absolu), deux à 95 % d’alcool, deux à 80 %, 2 à 70 % et enfin deux en eau distillée H₂O. glisse peut rester en H₂O et fixateur de Bouin est prête.
2. Place 40 mL de fixateur de Bouin dans un pot en plastique micro-ondable coplin (non couvert). Micro-ondes à puissance maximale de porter temp à 55 ° C. Placez la lame dans une solution chauffée pendant 20 min ; laisser reposer sur le comptoir couvert. Laver à l’eau courante pendant 10 min ou jusqu'à ce que toutes les couleurs jaune disparaît.
3. Tacher les sections dans l’hématoxyline de Weigert pendant 10 min. Lavez à l’eau courante pendant 10 min.
4. Tacher les sections dans la solution de fuchsine acide écarlate de Beibrich pendant environ 10 minutes pour laver 3 x 10 min dans l’eau du robinet. Mordant les lames dans une solution d’acide phosphotungstique/phosphomolybdique pendant 10 min. Ne pas rincer.
5. Placer les lames directement dans une solution bleue aniline pendant 10 min. rincer avec deux trempettes brièvement dans l’eau du robinet.
6. Placer les lames dans une solution d’acide acétique à 1 % pour 3 à 5 min. laver à l’eau du robinet pendant 1 min. Place dans l’éthanol à 95 % pendant 1 min. Dehydrate comme indiqué dans l’étape 5.4 et monter avec résine synthétique.

Résultats

Isolation de stroma vasculaire fraction de TVAP humaine

Figure 1 a montre une représentation schématique de la région anatomique où la TVAP recouvrant l’aorte ascendante a été obtenue. Nous avons décrit précédemment les populations de patients subissant le pontage coronarien d'où ces échantillons ont été dérivées⁶. Figure...

Discussion

Adipeuse progéniteurs de différents dépôts varient largement en phénotype et différenciation potentiels⁹. Culture des progéniteurs TVAP dérivés provenant d’un donneur unique patient à induction simultanée vers le bas de trois lignées différentes, adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques, permet une étude bien contrôlée des capacités pluripotentes de ce roman population de cellules progénitrices. La méthodologie décrite dans le présent rapport peut être utilisée pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G