التنبؤ في فيفو حمولات التسليم استخدام ورم-حاجز دم في الدماغ في صحن

Summary

المخدرات تستهدف لاورام الجهاز العصبي المركزي يشكل تحديا رئيسيا. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتنتج تقليد في المختبر الدم في الدماغ الورم-الحاجز باستخدام خلايا موريني و/أو البشرية ومناقشة أهميتها بالنسبة للقدرة على التنبؤ بورم في استهداف المجراة في الجهاز العصبي المركزي.

Abstract

انتقائية للغاية في طبيعتها، حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) أمر ضروري للتوازن الدماغ في الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، في سياق الإصابة بأورام الدماغ، انتقائية BBB الجزيئية أيضا الدروع الخلايا الورمية بحظر تسليم تشيموثيرابيس تدار التبرعات محيطيا. تطوير أدوية جديدة (بما في ذلك جسيمات نانوية) استهداف أورام الدماغ الخبيثة مثالي يتطلب استخدام نماذج حيوانية الإكلينيكية لدراسة ترانسسيتوسيس على المخدرات وفعالية انتيتومور. بغية الامتثال لمبدأ 3R (صقل والحد واستبدالها) الحد من عدد الحيوانات المختبرية في الإعداد التجريبي وإجراء الفرز الفائق لمكتبة كبيرة من وكلاء انتيتومور، قمنا بتطوير إنسان في المختبر استنساخه و مورين من تقليد الدم في الدماغ الورم-الجدار (بتب) استخدام الثقافات ذات الطبقات الثلاث خلايا بطانية، أستروسيتيس، ومجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض. لأعلى من قابلية وإمكانية تكرار نتائج، استخدمت خطوط تجارية الخلية أو الخلايا مخلدة في ظروف مصممة خصيصا للسماح بتشكيل حاجز تشبه BBB الفعلية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للحصول على تقليد بتب باستزراع خلايا بطانية على اتصال astrocytes كثافة الخلية المحددة على إدراج. يمكن استخدام هذا تقليد بتب، على سبيل المثال، للقياس الكمي وتصوير [كنفوكل] المرور نانوحبيبات عبر الحواجز بطانية وأستروسيتيك، بالإضافة إلى التقييم لاستهداف خلية الورم داخل الإنزيم نفسه. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها للتنبؤ بسلوك الجسيمات النانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية. من منظور أوسع نطاقا، هذا النموذج في المختبر يمكن تكييفها لسائر أمراض الأعصاب لتحديد مرور جزيئات علاجية جديدة من خلال BBB و/أو استكمالها مع أورجانويدس الدماغ تقييم الفعالية مباشرة المخدرات.

Introduction

وتتكون وحدة neurovascular الخلايا العصبية، أستروسيتيس وبي بي بي، شكلتها اتصالات معقدة بين بيريسيتيس، أستروسيتيس، وخلايا بطانية والغشاء الطابق السفلي يرتبط تشكيل ميكروفاسكولاتوري الدماغ¹. وينظم هذا الجدار الخلوي ضيق يتكون من سفن المستمر، نونفينيستراتيد ناعما حركة الأيونات والجزيئات (بما في ذلك الهرمونات أو المواد الغذائية أو الأدوية) ولكن أيضا تعميم خلايا¹. ترانسسيتوسيس المنخفضة لا سيما من خلال BBB الجزيئات عالية الوزن الجزيئي، مثل الأجسام المضادة العلاجية، ويصرف المخدرات، أو نانوكومبوندس، كبير يقيد التقدم في اكتشاف الأدوية للأمراض العصبية، بما في ذلك الخبيث gliomas². وفي الواقع، تشيموثيرابيس المسلمة شفويا أو عن طريق الوريد تصل إلى حمة الدماغ غالباً في تركيزات منخفضة على نحو كاف للحث على تأثير انتيتومور أو هي ببساطة غير قادر على عبور بتب للوصول إلى الخلايا الورمية³. العديد من الدراسات السريرية والاكلينيكية لم تعالج مسألة الاختراق بتب لكن حاولوا عرقلة بتب عابر، على سبيل المثال باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة^4،5، أو التحايل عليه بالمباشرة في الموقع تسليم المخدرات⁶. ولكن أيا من هذه التقنيات كانت قادرة على التصدي لتوسع الورم لا مفر منه أو الانتكاس. لذلك، عند تطوير العلاجات أنتيجليوما الرواية، ينبغي النظر نشرها من خلال بتب كأحد الجوانب الحاسمة للنجاح في إيصال العوامل العلاجية⁷.

نظراً لطبيعة التفاعلات الخلية داخل بتب معقدة للغاية، والدراسات المجراة في الحيوانات المختبرية يبدو أن الاختيار الواضح عند دراسة مرور جزيئات من الدم للدماغ. بيد عالية النطاق المجراة في أساليب معقدة نسبيا لإنشاء، وعليه، لا تسمح للفرز الفائق للجزيئات في فترة زمنية معقولة بتكلفة معقولة. بل الأهم من ذلك، الحيوان اختبار قد اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية 3R يعرف ط) صقل، ثانيا) الحد، وذات الصلة بالسياق الحالي، ثالثا) استبدال عن طريق بروتوكولات بديلة (على سبيل المثال، في طرق المختبر في السيليكون). ولذلك، إعادة بتب في المختبر يظهر كإمكانية مثيرة للاهتمام وجذابة، ولكن كما أنه يشكل مهمة معقدة تحدي القيود المختلفة. العديد من المحاولات لإعادة هذه المقصورة معقد مع الخلايا الأولية مثقف أو خطوط الخلايا من الكلاب البوليسية، الخنزير، وقد نشرت مورين، وحتى البشرية المنشأ (كما استعرضها الرحمن et al.⁸ و⁹من قانون هيلمز et al.). وتشمل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد موائع جزيئية نظم¹⁰، بي بي بي على رقاقة^11،12، والجموع من المتغيرات استناداً إلى ثقافات المشارك الكلاسيكية في إدراج النظم. ومع ذلك، نظم موائع جزيئية والرقائق الحالية أما غير مناسبة للمخدرات السريعة، الفائق--التحقق من صحة الدراسات^13،14 أو هي حاليا غير متوافق مع دراسات لإيصال الأدوية إلى أورام الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، استعراض نماذج منشورة 155 استخدام الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي (اللجنة التوجيهية) أو خطوط الخلايا التجارية إدراج مثقف شارك في جميع أظهرت اتجاها للتناقض إينتيرستودي في تلك القياسات و/أو استنتاجات⁸. يمكن أن يرتبط هذا النقص في إمكانية تكرار نتائج اينترلبورتوري مع شروط الثقافة ط) نونورماليزيد، على سبيل المثال مع الطلاء الاختياري مع الغشاء مصفوفة البروتينات في خلية ثقافة السفينة، ثانيا) عدد متزايد من ثقافة فرعية والاستخدام التي تحتوي على مصل وسائط الإعلام، وكلا المحركات الرئيسية للتعديلات الوراثية والمظهرية ل خطوط الخلية¹⁵، أو الثالث) صعوبة لتكاثر إعادة التوازن الصحيح بين أستروجليال ومكونات غشائي في طبق. على الرغم من أن استخدام تجاري خلية أو خلايا مخلدة الخطوط لإنشاء نموذج BBB في المختبر تفتقر إلى بعض خصائص مقارنة بنماذج مماثلة فقط استخدام الخلايا الأولية، في وصف الأسلوب نظهر أن الحق في الجمع بين خلايا معارض جداً الأداء مقارنة بنشر دراسات في نماذج أخرى من مرجع^16،17. في نهاية المطاف، عدم وجود نموذج قوي واستنساخه لدراسة مرور المركبات العلاجية استهداف أورام الدماغ عن طريق بتب دفعتنا إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا.

نظراً لأن الهدف لاستخدام النموذج التنبؤ المجراة في إيصال جسيمات نانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية، نحن أولاً التحقق من صحة النموذج بتب باستخدام إدراج تحتوي على خلايا بطانية مورين على اتصال astrocytes مورين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا الأمثل نموذج لاستخدام بعض خطوط الخلايا البشرية. تستقر، يتم تحويل الحواجز الخلية للثقافات مع مجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض أو خطوط الخلايا الدبقي التجارية. وبعد ذلك، يمكن تصور بالفحص المجهري [كنفوكل] ترانسسيتوسيس جسيمات نانوية واستهداف خلية الورم وكمياً بجمع العينات على مر الزمن. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام يقلد بتب يمكن موثوق بها التنبؤ بسلوك جسيمات نانوية المجراة، دعم استخدام مسبقة تقليد بتب التحقق من الصحة السريرية.

Protocol

التجارب على الحيوانات بموافقة اللجنة "إجراء التجارب على الحيوانات" من مقاطعة فنلندا الجنوبية (ESAVI/6285/04.10.07/2014).

1-إنشاء يقلد بتب

ملاحظة: خلية الثقافة المتوسطة والمكملات الغذائية هي مفصلة في الجدول للمواد.

1. إعداد أستروسيتيس
   ملاحظة: وحدات التخزين التالية تصلح لطبق بيتري 10 سم أو قارورة ثقافة الخليوي T75.
   1. تحت غطاء ثقافة خلية عقيمة، تغسل بعناية astrocytes مثقف مع 5 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). تجاهل برنامج تلفزيوني استخدام مضخة فراغ بلطف وإضافة 2 مل الكاشف تفكك خلية لمدة 5 دقائق (في 37 درجةمئوية، انظر الجدول للمواد) لفصل الخلايا. تحقق من مفرزة الخلية تحت المجهر. لا تتجاوز 5 دقائق من الحضانة إلى الحد من الضغط على الخلايا.
   2. إضافة 10 مل من أستروسيتي كاملة العقيمة خلية الثقافة المتوسطة (القذائف التسيارية +) إلى السفينة لكبح نشاط الكاشف تفكك الخلية. استخدام بيبيت مصلية عقيمة لنقل الخلايا المنفصلة من السفينة إلى أنبوب عقيم 15 مل. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 3 دقيقة في إطار التعاون الإقليمي 250 (تسارع: 9 rcf/s، والتباطؤ: 5 التعاون الإقليمي/s) في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. ومن ناحية أخرى، يعد إدراج (انظر الجدول للمواد): استخدام الملقط العقيمة، مكان إدراج مع الجانب الدماغ الأعلى (الشكل 1A) على غطاء لوحة 6-جيدا العقيمة (الشكل 1B). التحقق مسبقاً أنه يمكن وضع اللوحة رأسا على إدراج دون لمس أو الانتقال إدراج أثناء العملية.
      ملاحظة: الموضع الصحيح من إدراج يسمح فخ تعليق astrocyte الفترات الفاصلة بين الغشاء وأسفل البئر.
   4. بمجرد فصل، بعناية تجاهل المادة طافية من تعليق خلية؛ ريسوسبيند بيليه astrocyte في 1 مل من القذائف التسيارية + بلطف ريسوسبيندينج بيليه على أنبوب'الجدار s x تصل إلى 5. تجنب بيبيتينج المفرط للخلايا إلى الحد من الضغط على الخلايا. عد الخلايا وضبط كثافة تعليق خلية إلى 1.5 × 10⁵ خلايا في 400 ميليلتر من القذائف التسيارية + إدراج.
   5. وضع تعليق خلية في وسط الدماغ جانب إدراج's غشاء (الشكل 1B) وانتشر بعناية فائقة، باستخدام قوة الشعرية مع تلميح بيبيت عقيمة. تجنب الاتصال المباشر الغشاء هش خاصة.
   6. مع الجانب الدماغ من إدراج ما زال، ضع لوحة 6-جيدا مرة أخرى على إدراج. وهذا ما يضمن أن تعليق خلية عالقة بين الغشاء والفعلية أسفل البئر (الشكل 1). تجنب فقاعات الهواء في تعليق خلية، كما أنه سيتم منع انتشار أستروسيتيس على الغشاء متجانسة.
   7. وضع لوحة وإدراج، مع الجانب الدماغ، في الحاضنة (في 37 درجةمئوية مع 5% شركة₂) للسماح للالتصاق خلية لحد أدنى من ح 2 (astrocytes مخلدة مورين) وما يصل إلى 6 ح (astrocytes الأولية البشرية).
      ملاحظة: كما يتم الاحتفاظ إدراج رأسا على عقب، تصور التصاق الخلية لا يمكن تحت مجهر. لذلك، من المستحسن للبذور سفينة ثقافة خلية عادية منفصلة والتحكم التصاق الخلية في السفينة مع مرور الوقت. التلاعب حذراً من الغشاء يجب أن النتائج سوف تكون غير موثوقة عند تلف الأغشية.
   8. في نهاية فترة الحضانة، تحقق من عدم وجود تسربات تعليق خلية خارج منطقة البذر، وتجاهل إدراج إذا كانوا راشح. تعود اللوحة 6-جيدا لموقفها العادية، مع إدراج الآن سيكون الجانب الدم حتى (الشكل 1A). إضافة مل 2.6 من القذائف التسيارية + لكل بئر. صب 2.5 مل متوسطة astrocyte كاملة في كل إدراج ووضع اللوحة في الحاضنة (في 37 درجةمئوية مع 5% شركة₂).
2. إعداد خلايا بطانية
   ملاحظة: مورين microvascular بطانية خلايا المخ (bEND3)، يجب أن تصل إلى الخلايا التقاء 100% لضمان الاتصالات القصوى خلية-خلية تحريك التعبير البروتين مفرق ضيق المثلى في يوم التجربة. وهذا لا ينطبق على الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (HuAR2T) وجود astrocytes مطلوب لتعبير بروتين مفرق ضيق لهذه الخلايا.
   1. المضي قدما كما تم وصفه سابقا ل astrocytes (الخطوات 1.1.1 و 1.1.2.). بمجرد فصل، بعناية تجاهل المادة طافية؛ ريسوسبيند بيليه الخلية البطانية في 1 مل مستنبت الخلية البطانية كاملة (EBM +) ببطء بيبيتينج تعليق خلية في أنبوب'الجدار s x تصل إلى 5. تجنب بيبيتينج المفرط للخلايا إلى الحد من الضغط على الخلايا. عد الخلايا وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 2 × 10⁵ خلايا في 2.5 مل/إدراج متوسطة الثقافة غشائي خلية خالية من المصل (EBM-) وعامل نمو غشائي الأوعية الدموية-(فيجف-A).
   2. إخراج اللوحة التي تحتوي على يدرج، بعناية تجاهل المتوسطة من جانب الدم، واستبدله ب 2.5 مل تعليق خلية بطانية. العودة اللوحة للحاضنة (في 37 درجةمئوية مع 5% شركة₂) وترك الأمر بين عشية وضحاها لخلايا بطانية على التمسك بالغشاء.
   3. في اليوم التالي، إعداد لوحة 6-جيدا عقيمة بنقل 3 مل متوسطة بريوارميد أستروسيتي خالية من مصل الدم (القذائف التسيارية-) لكل بئر. بالتعامل مع تدرج مع الملقط عقيمة، بعناية تجاهل المتوسطة كاملة غشائي من الجانب الدم ووضع الإدراج في لوحة جديدة تحتوي على القذائف التسيارية-، وإضافة 2.5 مل من EBM-.
      ملاحظة: استخدام EBM-أمر حاسم بالنسبة لإقامة حاجز غشائي (الرجاء الرجوع إلى قسم النقاش).
   4. اترك تدرج في الحاضنة (في 37 درجةمئوية مع 5% شركة₂) مع الحد الأدنى الاضطرابات البدنية وتغيرات درجة الحرارة لمدة 5 أيام، مما يتيح إنتاج الغشاء الطابق السفلي بطانية، astrocyte اتصالات مع خلايا بطانية، وفي نهاية المطاف، تشكيل تقليد بتب. استبدال المتوسطة اليوم لنقل الثقافات الخلية الدبقي (يرجى الرجوع إلى الفرع 1-4).
3. قياس النفاذية بتب تقليد (اختيارية)
   
   1. يسمح نشر السلبية لصبغة الفلورسنت الصغيرة الوزن الجزيئي فلوريسسين الصوديوم (Na-فلوريدا) على مر الزمن من الدم إلى جانب الدماغ من إدراج حساب قيم النفاذية ووفقا للصيغة التالية:
      هنا، هو مدافع_جيدالأسفار القيمة المقاسة في البئر في نقطة معينة وقت مطروحاً منها قيمة أوتوفلوريسسينسي مستنبت الخلية، dT هو الوقت بالثواني، هو سطح الحاجز في سنتيمتر مربع، و مدافع_إدراج تقاس قيمة الأسفار في الإدراج في نفس الوقت نقطة ناقص القيمة المتوسطة أوتوفلوريسسينسي).
   2. جمع 100 ميليلتر من المتوسط من كل من جانبي المخ من تقليد بتب والدم ونقل كل واحد منهم إلى لوحة 96-جيدا مغلوطاً، أسود منفصلة للقياسات الأسفار اللاحقة. استخدام وسائط عادي الفارغة لتصحيح أوتوفلوريسسينسي.
   3. إعداد 2.5 مل كل من Na-Fl جيدا (50 ميكرومتر) في EBM-. بريوارم الحل نا-فلوريدا إلى 37 درجة مئوية. استبدال وسائط الإعلام من جانب الدم من إدراج مع وسائل الإعلام التي تحتوي على سائلة Na "بدء" جهاز ضبط وقت حالما يتم استبدال المتوسطة.
   4. جمع 100 ميليلتر لوسائل الإعلام بعناية من الدم والجانب الدماغ من إدراج الساعة 5، 30، 60، ونقل 120 دقيقة كل عينة لفصل الآبار السوداء لوحة 96-جيدا.
   5. وبناء على ذلك، استبدال الوسائط التي تم جمعها من إدراج للحفاظ على توازن حجم بين الجانبين. ضع تدرج مرة أخرى في الحاضنة بين كل جمع العينات لتقليل الاختلافات في درجة الحرارة.
   6. التحديد الكمي للأسفار من العينات التي تم جمعها، باستخدام قارئ لوحة مع عامل التصفية على 480/560 نانومتر (الإثارة والانبعاثات، على التوالي).
      ملاحظة: الأسفار من جانب الدماغ لا يمكن الكشف عنها تقريبا عند النقطة الزمنية دقيقة 5. قيم مرتفعة مقارنة بالفراغ الإشارة إلى تسرب أو الأضرار التي لحقت إدراج's الغشاء أو الحاجز؛ ولذلك تستبعد هذه من مزيد من التحليلات. يجب أن تكون القيم نفاذية نا-فلوريدا المتوقعة بتب في 10^-5 إلى 10^-6 سم/s مجموعة (الجدول 1).
4. إعداد الخلايا الدبقي
   ملاحظة: على الرغم من أن يتم استخدام المجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض هنا، والبروتوكول التالي يمكن تكييفها بسهولة للخلايا جليوبلاستوما ملتصقة، المتاحة تجارياً مثل يو-87 ملغ.
   1. بشكل اختياري، لتصوير الفلورة، مكان يصل إلى أربعة البورسليكات العقيمة جولة كوفيرسليبس (ø 0.9 سم) كل بئر في لوحة 6-البئر الذي يحتوي على 2 مل من بولي-د-يسين (0.01 ٪). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   2. ومن ناحية أخرى، نقل بعناية مجالات الورم من السفينة ثقافة الخلية إلى أنبوب عقيم 15 مل باستخدام بيبيت مصلية عقيمة. الطرد المركزي في المجالات الورم لمدة 3 دقيقة على 250 إطار التعاون الإقليمي.
   3. تجاهل المادة طافية ولطف ريسوسبيند المجالات في 1 مل من بفجف/لو--الحرة (GBM) الدبقي الخلية المتوسطة وعد الخلايا. ضبط كثافة الخلية إلى حوالي 10⁴ مجالات مليلتر (⁵ 10 خلايا/مل) في الخليج للحاسبات الآلية-.
   4. تجاهل بولي-د-يسين من الآبار وشطف لهم x 3 مع PBS العقيمة. البذور اللوحة مع 3 مل/جيدا لتعليق كروي الورم ونقل إدراج مع تقليد BBB في تعليق خلية الورم.
   5. تبني بين عشية وضحاها (في 37 درجةمئوية مع 5% شركة₂) للسماح للتوازن بين الدم والدماغ جانبي الورم الفحص. في اليوم التالي، تحل محل وسائل الإعلام في الجانب الدم مع EBM-تستكمل مع الجزيئات/المخدرات/nanoparticles الاهتمام. يتم جمع عينات على مر الزمن للقياس الكمي المباشر كما هو موضح في المقطع السابق. خلايا ثابتة عند نقطة دقيقة من وقت لتصوير الفلورية (يرجى الرجوع إلى القسمين 2-1 و 2، 2).

2-عالية الدقة تصوير [كنفوكل] بتب

ملاحظة: 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين ودرجة الحموضة 7.4، 6 مل في تكرار بتب) مستعدة دائماً جديدة في برنامج تلفزيوني. يبقيه على الجليد.

تنبيه: منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان. استخدام قفازات النتريل إلى التعامل مع منهاج عمل بيجين، ويعد الحل تحت غطاء الأبخرة كيميائية.

1. التعبير بتب غشائي البروتينات مفرق ضيق
   1. شطف كلا الجانبين من الغشاء مع برنامج تلفزيوني المثلج (3 x 5 دقيقة، 2.5 مل/إدراج، 3 مل/جيد). تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل و 2.5 مل من المثلج 4% منهاج عمل بيجين في البئر وفي الإدراج، على التوالي. تبني على الجليد لأدنى 10 تجاهل منهاج عمل بيجين (وفقا لمؤسسة's تصريف المواد الكيميائية الخطرة) وشطف x 3 مع برنامج تلفزيوني في الرايت (2.5 مل/إدراج، 3 مل/جيد).
      ملاحظة: مرة واحدة ثابتة، يمكن تخزين العينات في برنامج تلفزيوني (2.5 مل/إدراج، 3 مل/حسنا) في 4 درجةمئوية لمدة أسبوع.
   2. استخدام مسحه القطن لمسح الجانب الدماغ من الإدراج وإزالة في أستروسيتيس. باستخدام مشرط حاد، بعناية قطع الغشاء إلى أربعة أجزاء متساوية بإجراء تخفيضات عمودي اثنين، تشكيل صليب. المقبل، إدراج دون مشرط في النقطة حيث هو الغشاء تعلق على الحائط إدراج وتدوير الإدراج باليد الأخرى لتحرير العينات الأربع. استخدام الملقط غرامة، بعناية بنقل كل عينة إلى لوحة 24-كذلك تحتوي على 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني/حسنا، مع الجانب الدم حتى في كل بئر.
   3. كتلة الأغشية مع 10% مصل البقر الجنين في برنامج تلفزيوني (مدة 30 دقيقة في الرايت، 200 ميليلتر/جيد). إعداد الحل جسم 1° إيمونوستينينج مفرق ضيق البروتينات (الشكل 1) (زونولا أوككلودينس-1، كلودين-5؛ يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) في 200 ميليلتر من عرقلة الحل/جيدا. بشكل اختياري، يتم التحقق من هوية الخلية البطانية بإضافة جسم مضاد المثارة ضد جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية (PECAM1 أو CD31؛ يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) لكل حل جسم مفرق ضيق. تجاهل حل حظر واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية' O/N في 4 °C.
   4. في اليوم التالي، تجاهل الأجسام المضادة الأولية وشطف لهم مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (x 3 لمدة 5 دقائق في RT). احتضان لهم مع المناسبة إبلاغها مترافق fluorophore الثانوي الأجسام المضادة (تخفيف 1: 500، 200 ميليلتر/حسنا، تضعف في عرقلة الحل؛ يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) على ح 2 في الرايت
   5. تجاهل الأجسام المضادة الثانوية، شطف مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (x 3 لمدة 5 دقائق في RT). قم بإزالة برنامج تلفزيوني وكونتيرستين نواة الخلية باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحل نهائي بتركيز 1 μغ/مل في النقي المقطر ح₂س (dH₂س؛ 200 ميليلتر/حسنا؛ الرجاء الرجوع إلى "الجدول للمواد" ). احتضان لمدة 7 دقائق في إزالة الرايت DAPI وغسل الأغشية 3 x مع dH₂س (200 ميليلتر في البئر).
   6. ضع قطره من المتوسط التركيب (انظر الجدول للمواد) على شريحة الميكروسكوب زجاجية. استخدام الملقط غرامة، بعناية إخراج الغشاء من البئر، والحفاظ التوجه، إزالة الفائض من dH₂س ووضعه على قطره المتوسطة المتصاعدة. إضافة آخر قطره من تصاعد المتوسطة أعلى الغشاء وتغطية ذلك بعناية مع زجاج البورسليكات غطاء. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء فخ. تخزين العينات في 4 درجةمئوية وبعيدا عن الضوء حتى ملاحظات مجهرية [كنفوكل].
      ملاحظة: تلوين astrocyte يمكن تنفيذها بواسطة وضع القطع الأغشية في لوحة 24-جيدا مع الجانب الدماغ الأعلى، ومع استخدام الأجسام المضادة astrocyte محددة مختارة (مثلاً، موجهة ضد البروتين حمض فيبريلاري الدبقية [توصيني]) (الشكل 1E ).
2. الأسفار بتب تلطيخ للكشف عن ترانسسيتوسيس نانوحبيبات
   1. أداء يحلول خلية يعيش وضع العلامات (مثلاً، استخدام الفلورية يسبر [انظر الجدول للمواد]). تمييع صبغة الفلورسنت يحلول في تركيز عمل من 50 نانومتر في EBM بريوارميد-(2.5 مل في إدراج) أو من عيار 75 ملم بالقذائف بريوارميد-(3 مل/أيضا) يحلول وسم من خلايا بطانية وأستروسيتيس، على التوالي. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة (37 درجةمئوية بنسبة 5% في شركة₂)؛ ثم شطف x 3 مع برنامج تلفزيوني المثلج (2.5 مل/إدراج، 3 مل/جيد).
   2. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل و 2.5 مل من المثلج 4% منهاج عمل بيجين للبئر والإدراج، على التوالي. احتضان لهم على الجليد لأدنى 10 تجاهل منهاج عمل بيجين وشطف الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني (في الرايت، 2.5 مل/إدراج، 3 مل/جيد).
      ملاحظة: مرة واحدة ثابتة، يمكن تخزين العينات في برنامج تلفزيوني (2.5 مل/إدراج، 3 مل/حسنا) في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع.
   3. قم بإزالة برنامج تلفزيوني وكونتيرستين نواة الخلية باستخدام حل DAPI بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل في dH₂س (1 مل/إدراج، 1 مل/جيد). احتضان لهم لمدة 7 دقائق في إزالة الرايت DAPI وغسل الأغشية 3 x مع dH₂س (2.5 مل/إدراج، 3 مل/جيد).
   4. قص الغشاء بعناية وإزالة الفائض من dH₂س ووضعه على قطره من تصاعد المتوسطة (انظر الجدول للمواد) على شريحة الميكروسكوب زجاجية. إضافة آخر قطره من المتوسطة متزايدة على الجانب الآخر من الغشاء وتغطية ذلك بعناية مع زجاج البورسليكات غطاء. تجنب فقاعات الهواء فخ. تخزين العينات في 4 °C وإبقائهم في محمية من الضوء حتى تصوير مجهرية [كنفوكل].
3. الأسفار تلطيخ الخلايا السرطانية
   1. باستخدام الملقط غرامة، نقل بعناية كوفيرسليبس الجولة التي تحتوي على مجالات الورم إلى لوحة 24-بئر مليئة ببرنامج تلفزيوني المثلج. المضي قدما في خلية يعيش يحلول العلامات باستخدام المسابر يحلول الفلورسنت في 75 نانومتر في بريوارميد GBM-(200 ميليلتر في البئر). احتضان هذه العينات لمدة 45 دقيقة؛ ثم شطف لهم x 3 مع برنامج تلفزيوني المثلج (200 ميليلتر في البئر).
   2. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميليلتر من منهاج عمل بيجين المثلج كل بئر. احتضان على الجليد لأدنى 10 تجاهل منهاج عمل بيجين وشطف العينات 3 x مع برنامج تلفزيوني (في RT).
      ملاحظة: مرة واحدة ثابتة، يمكن تخزين العينات في برنامج تلفزيوني (200 ميليلتر) عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع.
   3. قم بإزالة برنامج تلفزيوني وكونتيرستين نواة الخلية باستخدام حل DAPI بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل في dH₂س (200 ميليلتر في البئر). احتضان لهم لمدة 7 دقائق في إزالة الرايت DAPI وتغسل كوفيرسليبس 3 x مع dH₂س (200 ميليلتر في البئر).
   4. استخدام الملقط غرامة، أخرج ساترة وإزالة الفائض من dH₂س ووضعه على قطره من تصاعد المتوسطة (انظر الجدول للمواد) على شريحة الميكروسكوب زجاجية. تجنب entrapping أي فقاعات الهواء. تخزين العينات في 4 °C وإبقائهم في محمية من الضوء حتى ملاحظات مجهرية [كنفوكل].

3-في فيفو دراسة مقارنة

1. التسجيل في الموقع لنشر فلوريسسين الصوديوم عن طريق بي بي بي
   1. إعداد 150 ميليلتر 50 نانومتر نا-فلوريدا الحل في حل فسيولوجية. يبقى الحل في 37 درجةمئوية عند التسليم عن طريق الحقن الوريدي.
   2. تخدير ماوس مع حقن داخل الكيتامين/xylazine كوكتيل (300 ميليلتر من 100 مغ/كغ xylazine الكيتامين و 10 مغ/كغ في برنامج تلفزيوني). حالما يتم إنشاء التخدير العميق، وضع الحيوان على وسادة تدفئة الاحتفاظ درجة حرارة الجسم.
      ملاحظة: وقد استخدمت عمرها عشر الأسبوع معهد البحوث الطبية البحرية (الرنين) عارية الإناث الفئران المناعة للحصول على البيانات المعروضة في الشكل 2. بيد أن هذا البروتوكول لا تتكيف مع كل الأشخاص والمناعة من الفئران. أسلوب التخدير/التسكين في عالم's السلطة التقديرية. ومع ذلك، لا ينصح بالتخدير استنشاق مثل إيسوفلوراني كما أنه يزيد بشكل كبير في نفاذية BBB¹⁸.
   3. ضع الماوس على إطار ستيريوتاكسيك (انظر الجدول للمواد) وإجراء شق طولي لفروة الرأس مع مقص جيد، تليها ديلاسيريشنز رقيقة من النسيج الضام، استخدام الملقط غرامة، للكشف عن الجمجمة. استخدام حركات دائرية مع ميكرودريل ما يرام، إزالة قطعة دائرية 0.3 ملم ø الجمجمة من العظم الجداري الأيمن أو الأيسر. المضي قدما بحذر شديد أثناء الحفر وإزالة قطعة الجمجمة لتجنب إصابة الأنسجة سحائي الكامنة والأوعية الدموية.
   4. ضع قطره حل الفسيولوجية على أنسجة مكشوفة. باستخدام اثنين من أزواج من الملقط غرامة، بعناية إزالة الأنسجة سحائي الوصول إلى قشرة الدماغ. أنسجة المخ ينبغي ابدأ في اتصال مباشر مع الهواء.
      ملاحظة: يمكن إيقاف نزيف طفيف من إصابة سحائي استخدام الأسفنج الدموية (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد).
   5. حالما تتم إزالة الأنسجة سحائي والقشرة يتعرض لها تماما، إيقاع قطره حل الفسيولوجية بين القشرة وساترة البورسليكات 0.5 ملم ø. تأمين منطقة المراقبة مع قطره الصمغ cyanoacrylate (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) ينتشر ساترة بإبرة. اسمحوا الغراء جافة لمدة 1 دقيقة.
   6. إعداد القسطرة القابلة للغرس لحقن الوريد الذيل (الشكل 2A). كسر غيض من إبرة ز 25 استخدام الملقط روتشستر-Ochsner وإدراج التلميح في أنبوب البولي PE20 سم طوله 10 (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) (الشكل 2 أ).
   7. أدخل القسطرة في هذا السياق الذيل الأفقي من الماوس، استخدام المشابك لدغ للتلاعب بالقسطرة والإدراج (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) (الشكل 2). تأمين الإبرة المدرجة مع قطره الصمغ cyanoacrylate. اسمحوا الغراء الجاف 20 ثانية قبل إزالة المشبك لدغ. الاتصال بعناية على الطرف الآخر من القسطرة ز 25 إبرة متصلة بحقنه تحتوي على الحل نا-فلوريدا (الشكل 2).
   8. ملاحظة: لا المشبك الذيل مع المشبك لدغ؛ أنه يستخدم فقط للتعامل مع القسطرة الدقيقة. يمكن تأكيد الإدراج القسطرة المناسبة بارتداد الدم في أنابيب شفافة.
   9. وضع الحيوان تحت ستيريوميكروسكوبي (انظر الجدول للمواد). استخدام أوتوفلوريسسينسي ذات المستوى المنخفض في قناة الأخضر (480 نانومتر)، التركيز على منطقة التي تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة نسبيا (ظهورها أكثر قتامة بسبب امتصاص الهيموغلوبين للضوء في هذا الطول الموجي) وأصغر الشعيرات الدموية (الشكل 2). بدء اكتساب الوقت الفاصل بين بإيجاز قبل الحقن صبغة الفلورسنت للحصول على قياس fluorescence الخلفية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن صور لقطة من T0 تسجيل الوقت الفاصل بين ومن أي دولة أخرى محددة مسبقاً النقاط الزمنية.
   10. حقن الحل بوتيرة بطيئة ومستمرة، أو بدلاً من ذلك، استخدم نظام ضخ الآلي. الأسفار نا-فلوريدا الكشف في الدم ينبغي أن تظل مستقرة (نصف العمر في الدم: 286 دقيقة)، الذي يسمح تسجيل لنشر BBB من خلال نافذة الجمجمة لعدة دقائق. بمجرد اكتمال الحصول، بعناية إزالة القسطرة و euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم.
2. في تحديد نفاذية BBB فيفو
   ملاحظة: يتم الحصول على قيم من أي برنامج معالجة الصور، مثل إيماجيج، مما يسمح بقياس كثافة إشارة الأسفار داخل منطقة مخصصة للفائدة (العائد على الاستثمار).
   1. باستخدام أداة التعليق التوضيحي، رسم عائد على شكل مستطيل خارج الأوعية الدموية، في أنسجة المخ، وفي حوالي 5 ميكرومتر مليئة المسافة من أي الأوعية الدموية مرئية مع "ملاحظة" نا-فلوريدا. أبعاد العائد على الاستثمار وكثافة fluorescence المقاسة في T0 في عائدات هذا الاستثمار، الذي وتستخدم فارغة للأنسجة'أوتوفلوريسسينسي s. دون أن تحل محل العائد على الاستثمار، سريع إلى الأمام إلى نقطة وقت بوستينجيكشن (مثلاً، إلى الإطار مسجل آخر عند قد تم حقن على حل كامل للحيوان) ولاحظ قيم الوقت والأسفار دقة قياس داخل العائد على الاستثمار (الشكل 2).
   2. نقل عائدات الاستثمار في الأوعية الدموية مرئية (الشكل 2) ولاحظ قيمة أوتوفلوريسسينسي T0 من الدم. دون أن تحل محل العائد على الاستثمار، سريع إلى الأمام إلى نفس النقطة الزمنية المحددة في الخطوة 3.2.1. والمذكرة التي تقاس قيمة الأسفار داخل العائد على الاستثمار (الشكل 2).
      
   3. استخدام الصيغة التالية (مقتبس من الفرع 1-3) لتحديد نفاذية بي بي بي:
   4. هنا، مدافع_الدماغ هو قيمة الكثافة fluorescence مطروحاً منها قيمة T0 فارغة في الدماغ، dT هو نقطة اقتناء الوقت بالثواني، هو مساحة السطح السفينة التقريبي، اتخذت كمنطقة دوروا سنتيمتر مربع، و مدافع _الدم هو قيمة الكثافة fluorescence مطروحاً منها قيمة T0 فارغة في الدم.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون قيم النفاذية المتوقعة ل BBB في نطاق 10^-6 سم/s (الجدول 1).
3. الأنسجة المعالجة للكشف عن جسيمات نانوية مضيئة في الدماغ مورين
   1. زرع المجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض (5 × 10⁴ خلايا في 5 ميليلتر من PBS العقيمة) في تخديره عمرها 6 الأسبوع الإناث الرنين عارية الفئران في كالوسوم الإحضار. تحديد موقع هذه المنطقة الدماغ عند الإحداثيات ستيريوتاكسيك التالية، بدءاً بريجما: الصورة + 0.5 مم، اليسار إلى اليمين + 2.5 مم، دورسوفينترال + 3 مم. السماح لورم الدماغ أن تنمو لمدة أسبوعين.
   2. حقن جسيمات نانوية الوريد (100 ميكروغرام في 100 ميليلتر من حل الفسيولوجية عقيمة) والسماح لهم بتعميم ل 8 h. حقن الفئران التحكم عن طريق الوريد مع 100 ميليلتر من حل الفسيولوجية العقيمة.
   3. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم وجمع العقول سريعاً لتجميد المفاجئة في إيسوبينتاني الحفاظ على الثلج الجاف (1 دقيقة في-50 درجةمئوية). تخزين العقل المدبر في-80 درجةمئوية حتى تجهيز الأنسجة.
   4. قص الأجزاء الدماغ الاكليلية مع كريوميكروتومي. تحديد موقع غرس داخل الجمجمة بندبة تشكلت في القشرة، وقطع 9 أقسام ميكرومتر سميكة من تلك المنطقة على الشرائح مجهر المناسبة (انظر الجدول للمواد).
   5. تزج أقسام الدماغ التي هي معطلة على الشرائح في برنامج تلفزيوني المثلج (x 2 لمدة 5 دقائق)، وإصلاحها، ثم في المثلج 4% منهاج العمل (لمدة 5 دقائق). يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني (x 3 لمدة 5 دقائق في RT). ضع الشرائح أفقياً والفروع بيبيت عرقلة الحل التي تحتوي على 10% الجنين البقري المصل في برنامج تلفزيوني على الأنسجة تغطي كامل السطح (من أجل 1 ح في الرايت، 500 ميليلتر/الشريحة). إعداد جسم CD31 (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد) في 250 ميليلتر من عرقلة الحل/الشريحة. استبدال الحل حظر الجسم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °مئوية في دائرة هوميديفيد.
   6. في اليوم التالي، تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني (x 3 لمدة 5 دقائق في RT) واحتضانها لهم مع المقابلة مترافق fluorophore الثانوية جسم (1: 500 في 250 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني عن ح 2 في RT). شطف 3 x في برنامج تلفزيوني (في RT) وكونتيرستاين نواة الخلية باستخدام حل DAPI بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل في dH₂س (250 ميليلتر في الشريحة). احتضان هذه العينات لمدة 7 دقائق في الرايت إزالة الحل DAPI ويغسل الشرائح 3 x مع dH₂o.
   7. في كل قسم الأنسجة، أضف قطره واحدة من تصاعد المتوسطة (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد)، وتأمين العينات مع ساترة. تجنب entrapping فقاعات الهواء. تخزين العينات في 4 °C وإبقائهم في محمية من الضوء حتى ملاحظات مجهرية [كنفوكل].

النتائج

ويظهر تصوير [كنفوكل] من تقليد بتب مورين التعبير والتعريب الخلوية مفرق ضيق البروتينات زونولا أوككلودينس-1 (زوي-1) وكلودين-5 في bEND3. الاتصالات بين خلايا بطانية و astrocytes وضوح فعل نقل زوي-1 و 5-كلودين غشائي خلية-خلية الاتصالات مقارنة بالزراعات الأحادية bEND3 (الشكل 1). استخدام الفلورة تلطيخ لتصور astrocytes معربا عن توصيني على الدماغ-جانب الغشاء، فمن الممكن مراقبة ودراسة عمليات أستروسيتيك ونهاية-أقدام الاتصال بخلايا بطانية عبر الغشاء (الشكل 1E ). جهات الاتصال astrocyte غشائي خلية معروفة لتعزيز واستقرار تشديد الجدار الخلوي وترتبط مع انخفاض قيم النفاذية BBB¹⁹. ووفقا لذلك، لاحظنا انخفاضا كبيرا في نفاذية تقليد بتب الماوس لفلوريدا نا من 27.63 (± 3.45) × 10^-6 سم/ثانية في حالة الزراعات الأحادية إلى 6.74 (± 3.01) × 10^-6 سم/ثانية عند مثقف يشترك مع نقص إيندوسيبلي عامل ضرب astrocytes (هيفكو) (الجدول 1). HuAR2T مخلدة تشكل الحواجز الخلوية نفاذية عالية (104.92 ± 27.1 x 10^-6 سم/ثانية، الجدول 1). مشابهة لطراز مورين، قمنا بقياس نفاذية أقل بكثير من بتب أن نا-فلوريدا، إلا وهي 47.4 (± 14.32) × 10^-6 سم/ثانية، عندما كانت الخلايا HuAR2T مثقف يشترك مع astrocytes الأولية البشرية (الجدول 1).

في يقلد بتب مورين والبشرية على السواء، التي يسببها وجود مجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض زيادة طفيفة في قيم النفاذية مقارنة بثقافات المشارك astrocyte خلية غشائي وحدها (الجدول 1). ويلاحظ هذه الظاهرة مع عدة ولكن ليس كل من الدبقي المريض المجال نماذج. قد يكون هذا بسبب فيجف-أ التي تفرزها بعض هذه الخلايا المستمدة من المريض.

لمقارنة قيم النفاذية يقلد بتب في المختبر مع BBB في الحية، نحن تصويرها نشر نا-فلوريدا من خلال نافذة الجمجمة مزروع في الفئران عارية في الوقت الحقيقي. استخدام ستيريوميكروسكوبي الأسفار، ونشر نا-فلوريدا من الشعيرات الدموية الأوعية الدموية المستمدة من الأوعية الدموية بيال الرئيسية سجلت قبل وأثناء وبعد الحقن النظمية للتحقيق (الشكل 2). قياسات للقيم fluorescence التفاضلية من حمة القشرية تعميم الدم والدماغ على مر الزمن سمح لنا لحساب قيم تقريبية نفاذية الماوس عارية's BBB لفلوريدا Na (5.57 ± 2.19 x 10^-6 سم/s، الجدول 1).

لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا تقليد بتب للتصور لمرور المركبات من الجانب الدم إلى جانب الدماغ، قارنا ترانسسيتوسيس ø 110 شمال البحر الأبيض المتوسط (NP110) و ø 350 نانومتر (NP350) جسيمات نانوية استهداف جليوبلاستوما المستمدة من المريض المجالات. الحصول على نتائج في المختبر ثم تم مقارنة ترانسسيتوسيس المجراة في. في المثال المقدم، جسيمات نانوية المغلفة بالسطح مع استهداف الورم الببتيد قن²⁰ ومحملة بصبغة الفلورسنت (فيتك) لتسهيل التصور. ونحن المسماة الخلايا باستخدام الصبغة الليزوزومية وكونتيرستينيد مع DAPI 24 ساعة بعد إضافة nanoparticles فيتك في الدم-جانب بتب تحاكي واكتسب [كنفوكل] ميكروجرافس على مستويات مختلفة (مثلاً، إلى جانب الدم، الغشاء، الجانب الدماغ، وفي المجالات جليوبلاستوما المريض) (الشكل 3A). إشارة الفلورسنت المرتبطة NP110 كولوكاليزيد مع ليسوسوميس في خلايا بطانية، أستروسيتيس، وورم الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، تم NP110s تم الكشف عنها في الفترات الفاصلة بين الخلايا البطانية و astrocytes، تمر من خلال مسام الغشاء insert (الشكل 3A).

وكان كمياً مرور NP110s عن طريق قياس الأسفار من عينات جمعت من جانب كل من الدم والدماغ. هذه القيم ذات نفاذية كانت مقارنة بتلك التي تحدد لجسيمات نانوية من ø 350 نانومتر (NP350). وتبين النتائج أن NP110 فقط كانت قادرة على عبور يقلد بتب (الشكل 3B). وظل NP350 على جانب الدم من تقليد بتب، مما أدى إلى انخفاض قيم النفاذية لهذه الجسيمات النانوية.

لتسليط الضوء على مدى أهمية يقلد بتب مقارنة النماذج الحية في، تم حقن الفئران عارية عن طريق الوريد مع جسيمات نانوية NP110 أو NP350 مغلفة باستهداف الورم الببتيد قن ومترافق مع الصبغ الأحمر نيون (تريتك) للكشف عن. الأنسجة التي تم جمعها في عدة نقاط زمنية كشفت أن بعد ح 8، وقد اكسترافاساتيد بي بي بي-نفاذية جسيمات نانوية إلى حمة الدماغ، في حين نونبيرميابل تلك التي بقيت في التداول أزيلت أساسا من الدوران الجهازي المجراة. ولذلك جمعت العقول وكمياً عدد جسيمات نانوية كل بوستينجيكتيون ح 8 ملليمتر مربعة. ووفقا للنتائج في المختبر، NP110، ولكن لا NP350 بنجاح اكسترافاساتيد إلى حمة الدماغ (الشكل 3). تصوير عالية التكبير من موقع نانوحبيبات في الدماغ أظهرت أن NP110 البلوتينيوم الموزعة في حمة الدماغ خارج الشعيرات الدموية والمخزن بنجاح إلى الخلايا جليوبلاستوما مزروع (3D الشكل). على الرغم من العارضة الورم نفسه استهداف مجموعة (قن)، NP350 كان غير قادر على اكسترافاساتي في حمة الدماغ واكتشفت فقط داخل الجانب لومينال الدماغ الأوعية الدموية (الشكل 3E)، مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها في المختبر.

رقم 1: وصف نموذج الورم-حاجز (بتب) الدم في الدماغ- (أ) التمثيل التخطيطي لمواقع أنواع مختلفة من الخلايا. (ب) توضيح لموضع إدراج على غطاء لوحة 6-جيدا وتقنيات البذر أستروسيتيس على الجانب الدماغ من إدراج'الغشاء s. (ج) رسم توضيحي لوضع لوحة 6-كذلك السماح بانضمام astrocyte. (د) ميكروجرافس الفلورة مفرق ضيق البروتينات زونولا أوككلودينس-1 (الصف العلوي، وزوى--1، الأحمر) وكلاودين-5 (الصف السفلي، الخضراء). تتم مقارنة التعبير البروتين مورين microvascular بطانية خلايا المخ (bEND3) مثقف الجانب الدم من بتب وحدها كأحادية (العمود الأيمن) أو مع مورين astrocytes هيفكو مخلدة (العمود الأيمن). نواة الخلية هي كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). (ه) صورة مجهرية الفلورة لائحة البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني، الأحمر) في astrocytes هيفكو مثقف إلى جانب الدماغ بتب. صورة عالية التكبير تظهر عمليات astrocyte ونهاية-أقدام (الأسهم) الاتصال بخلايا بطانية عبر الغشاء المسام (اللوحة اليمنى). تم التحقق من هوية astrocytes هيفكو تلطيخ الفلورة الفيروس القردي 40 كبيرة تي للمستضد (SV40 الكبير T، الأخضر) المستخدمة لتخليد للخلايا. خلايا بطانية الإعراب عن توصيني لا تي كبيرة SV40 و، ولذلك يمكن جزئيا ملاحظتها من خلال الشفافية، مقابل الجانب من الغشاء كخلايا الملون DAPI فقط (خطوط متقطعة). نواة الخلية هي كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تحديد الماوس نفاذية BBB يعيش إينترافيتال. (أ) إعداد قسطرة الوريد والذيلية القابلة للغرس. (1) الأدوات والمعدات ما يلي: () PE20 الأنبوب البولي إثيلين (ب) هما 25 ز الإبر الملقط (ج) روتشستر-أوتشسنير، والمشبك لدغ (د) صغيرة. تتم إزالة الإبرة (2) 25 ألف ز قبل عدة تورسيونس بعناية باستخدام الملقط و (3) إدراج في الأنبوبة. (4) الجانب الآخر من الأنبوب متصل بآخر ز 25 إبرة. (ب) التوجيه لغرس القسطرة وتحديد المواقع لبث الحل fluorescein الصوديوم عن طريق الوريد ذيل الماوس. المنطقة تحليقا يشير إلى مجال حيث يتم وضع قطره الصمغ cyanoacrylate لتأمين القسطرة. تستخدم للتعامل مع القسطرة المشبك لدغ وإزالتها حالما يتم تأمين القسطرة. (ج) ممثل التصوير والتقدير الكمي أسلوب لتحديد قيم النفاذية فلوريسسين الصوديوم. قبل ضخ الصوديوم-فلوريسسين (العمود الأيمن)، يتم قياس أوتوفلوريسسينسي/الفارغة داخل طقة فائدة (ROI) على الدماغ (مستطيل أعلى اللوحة، الأبيض) ومجالات الأوعية الدموية (أسفل لوحة، أحمر مستطيل). أثناء ضخ الصوديوم-فلوريسسين (العمود الأيمن)، يتم قياس شدة الأسفار في رويس على حد سواء، مما يتيح حساب نفاذية BBB. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: التنبؤ ترانسسيتوسيس إينتراسيريبرال من جسيمات نانوية من خلال BBB المجراة باستخدام نموذج بتب في المختبر. (أ) التمثيل البياني للمقايسة بتب مع الصور [كنفوكل] التمثيلية التي تم الحصول عليها على مختلف المستويات المشار إليها من طراز بتب مورين. جسيمات نانوية 110 نيوتن متر في القطر (NP110) ويضاف إلى فيتك (الأخضر) وأضيفت للدم كانت المسمى الجانب من "الخلايا بتب" مع المسبار الليزوزومية (الملازم-99، الأحمر).  (1) اندوثيليال الخلايا، ترانسسيتوسيس (2) اندوثيليال لجسيمات نانوية من خلال مسام الغشاء (خط متقطع البيضاء)، أستروسيتيس (3)، ويتم تحديد المجالات جليوبلاستوما المريض (4) في الرسم و ميكروجرافس [كنفوكل] المقابلة (يمين). تغليف الليزوزومية من جسيمات نانوية (الأسهم) تقترح ترانسسيتوسيس النشطة من خلال طبقات بتب بطانية وأستروسيتي. (ب) التحديد الكمي نفاذية نانوحبيبات المشار إليها عن طريق بتب في المختبر (n = 6). (ج) التحديد الكمي لكثافة نانوحبيبات المشار إليها في أنسجة المخ الفروع، ح 8 بعد حقن الوريد والذيلية الفئران عارية (n = 3). (د) ميكروجرافس [كنفوكل] يبين التوزيع ø 110 من جسيمات نانوية نانومتر (NP110، أحمر) في أقسام أنسجة الدماغ مورين المسمى مع ماوس المضادة الأجسام المضادة CD31 (أخضر). ويبرز السهم ترانسسيتوسيس نانوحبيبات (اللوحة اليمنى). جسيمات نانوية المتراكمة حول خلايا ورم المخ (الورم، اللوحة اليمنى) سبب الببتيد استهداف حظيرة عرضت على سطحها. ويلاحظ لا صاروخ موجه كبيرة في أنسجة المخ (الدماغ). (ﻫ) [كنفوكل] ميكروجرافس تبين توزيع ø جسيمات نانوية 350 نانومتر (NP350، أحمر) في المقاطع أنسجة الدماغ مورين المسمى بجسم CD31 المضادة ماوس (أخضر). نقطة رؤوس الأسهم إلى NP350s التي تم الاحتفاظ بها في التجويف الأوعية الدموية ولم يتمكنوا من عبور BBB، ربما بسبب قطرها أكبر مقارنة بنواة خلية NP110s. كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). ف < 0.01. فحسبت القيم باستخدام اختبار مان-ويتني U ثنائي الطرف، nonparametric. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مورين بتب تقليد	bEND3	bEND3 + "هيفكو ك"	bEND3 + جيجابايت	bEND3 + هيفكو ك + جيجابايت	في فيفو
نفاذية (10-6 سم/ثانية)	27.63	6.74	26.8	10.83	5.57
SD (10-6 سم/ثانية)	3.45	3.01	7.99	2.65	2.19
البشرية بتب تقليد	HuAR2T	HuAR2T + اللجنة	HuAR2T + جيجابايت	GB + HuAR2T + اللجنة
نفاذية (10-6 سم/ثانية)	104.92	47.4	89.08	48.24
SD (10-6 سم/ثانية)	27.1	14.32	10، 21	13.07

الجدول 1: قيم النفاذية الصوديوم-فلوريسسين (غ-فلوريدا) (بالسنتيمتر في الثانية الواحدة) تحدد في المختبر في أنظمة الثقافة المشتركة المشار إليها والحية في الفئران عارية الرنين. البيانات المستمدة من تجربة ممثل (n = 3 الفئران).

Discussion

ظهور مفهوم تقلب الورم إينتيرباتينت شبابها البحوث المتعلقة بالسرطان شخصية الطب²¹. هذا التغير أيضا من السمات مميزة للأورام الخبيثة في الجهاز العصبي المركزي. نظراً لعدم إمكانية التنبؤ بالورم، استجابة للعلاج الكيميائي إضافة إلى إيواء أثر بي بي بي لإيصال الأدوية، وتماماً ويشكل تحديات كبيرة في رعاية المرضى²². من أجل تطوير علاجات أكثر فعالية، من الضروري غالباً إلى مكتبات شاشة كبيرة من جزيئات جديدة. لتقييم فعالية انتيتومور وقدرة يؤدي العلاجية الجديدة الوصول إلى موقع الورم، هو أفضل خيار الدراسة السريرية على الخلايا المستمدة من المريض مزروع في فيفو إلى الآلهة المريض موريني. أسباب أخلاقية (مبدأ 3Rs عند استخدام الحيوانات المختبرية) والعملية (المالية والوقت، والإنسان، ومرفق الموارد)، هو تطوير منصة الفحص في المجراة على نطاق واسع غالباً ما تكون غير ممكن، ومن ثم فحوصات يستند إلى الخلية وتظل نموذجا لاختيار²³. والسبب الرئيسي لاختيار إنشاء خطوط الخلايا وتجنب الخلايا الأولية تيسير إمكانية تكرار نتائج والحد من استخدام الحيوانات المختبرية، التي هي المصدر الرئيسي لعزله وإقامة ثقافات مورين الأولية. طرق عرض هنا، اعتقادا راسخا أن تمتثل 3Rs، يمكن تجاهل كفاءة جسيمات نانوية من تحقيق السريري كذلك على المعيار لعجزها عن عبور نموذج بتب. كإثبات لمبدأ، نحن تصف هنا النتائج التي تم الحصول عليها أثناء التطوير والتحقق من بتب. كنا قادرين على تأكيد النتائج المختبرية المجراة، على سبيل المثال عند قياس نشر السلبي من 376 دا فلوريسسين الصوديوم.

البروتوكول الواردة في هذه الورقة وصف إعداد خلايا بطانية كوكولتوريد مع أستروسيتيس لتشكل واجهة ورم تشبه حاجز دم في الدماغ في إعداد في المختبر. حالما يتم إنشاء احتكاك بين هذه الأنواع اثنين من الخلية، يسلك طبقة الخلايا البطانية أوجه التشابه مع بي بي بي (مثلاً خلية سطحية تعبير البروتينات مفرق ضيق وذات نفاذية منخفضة نسبيا). من المثير للاهتمام، يبدو أن تقليد بتب مورين لتوفير قيم النفاذية نا-فلوريدا خاصة مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام الماوس المجراة في BBB نفاذية القياسات²⁴. ولذلك، سيتم ربط أداء يقلد بتب مباشرة باختيار الخلايا المستخدمة لتشكيل الحاجز. خلايا بطانية bEND3 تنشأ من الدماغ ومن المعروف أن النجاح في إقامة حواجز عند كوكولتوريد مع أستروسيتيس²⁵. ومع ذلك، كنا نستخدم astrocytes هيفكو مخلدة²⁶ لتوليد تقليد بتب. نظراً لعدم وجود عامل نقص إيندوسيبلي، لا تنتج هذه astrocytes VEGF-أ، وهو الجوهر في تحقيق الاستقرار لتقليد بتب الموصوفة هنا. وقد حددت astrocytes المغيرون نفاذية BBB، على سبيل المثال عن طريق الإفراج عن فيجف-أ ردا على نيوروينفلاميشن²⁷. تنشيط مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية (فيجفرس) منظم رئيسي من نفاذية بطانية/الأوعية الدموية في المختبر²⁸ و المجراة في²⁹. ولذلك، تنشيط ملاحق VEGF-ألف في المتوسط VEGFR2 في خلايا بطانية، الذي يدفع الفسفرة أدهيرينس مفرق البروتينات مثل هاء-كادهيرين³⁰. فقدان غشائي خلية-خلية الاتصالات يولد درجة عالية من نفاذية الأوعية الدموية. وبالمثل، كل من الخاصية ميتوجينيك قوية والتكوين غير معروف للأمصال البقري الجنينية المستخدمة في فحوصات الثقافة الخلية يسبب القضايا الرئيسية في الحاجز الاستقرار وفحص إمكانية تكرار نتائج.

الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) تستخدم أحياناً لتشكيل BBB في المختبر³¹؛ ومع ذلك، تختلف كثيرا من خلايا الدماغ بطانية microvascular، مثل خط الخلية D3 هكميك/³²، من حيث التعبير الجيني وتشكيل حاجز خصائص. بيد نفاذية أعلى نسبيا مقارنة القيم التي تم الحصول عليها مع الخلايا HuAR2T نمت وحدها bEND3 كانت تقلص إلى حد كبير من كوكولتورينج لهم مع البشرية astrocytes الأولية. على الرغم من أن خلايا بطانية مطلوبة لتشكل الجدار الخلوي، فمن الواضح أن أستروسيتيس دور لا يقل أهمية لتشكيل بتب وتحقيق الاستقرار.

عندما تم إضافة مجالات الدبقي المستمدة من المريض إلى هذه المعادلة، تقليد بتب الماوس لخص بعض الميزات لتكثيفها مورين، مثل انتشار المخدرات عن طريق المفرج الدماغ واستهداف الخلايا السرطانية. على سبيل المثال، أن يقلد بتب مناقشتها هنا كانت ناجحة في النسخ المتطابق المجراة في السلوك عندما نحن فحص عدة جسيمات نانوية بأقطار مختلفة. لتوضيح ذلك التوازي بين النماذج في المختبر وفي الحية، استخدمنا جسيمات نانوية سيليكات ميسوبوروس هو موضح سابقا³³ مع خصائص اختراق الخلية³⁴ مترافق لاستهداف الورم الببتيد قن على بهم surface20. منازل الببتيد استهداف حظيرة لخلايا الورم الغازية عن طريق الربط المحددة لمثبطات النمو المشتقة من الثديية (مدجي). هي عدة أنواع السرطان، بما في ذلك جليوماس، أوفيريكسبريسينج مدجي مقارنة بأنسجة طبيعية³⁵، مما يجعل من مجموعة فعالة جداً استهداف الورم حظيرة قادرة على زيادة إيصال حمولة²⁰. جسيمات نانوية المستخدمة هنا قد ثبت سابقا أن منتشر في المخ حمة (27547955)، وعندما فونكتيوناليزيد مع تاكسول، هذه النانو-الشحنات قد نجحت في الحد من النمو الدبقي في نماذج الإكلينيكية³⁶. إضافة مخلفات البولي إثيلين غليكول (شماعة) على السطح جسيمات نانوية حافظت أيضا على التهمة ثابتة للقيم الإيجابية (حول + 4 mV)، مما يتيح التفاعل الأفضل مع وحدة نيوروفاسكولار³⁷ وأيضا زيادة استقرارها في الدورة الدموية. في البيانات المقدمة، وكان مترافق كاتشين 3 من شماعة ل NP110s، بينما كانت مغطاة NP350s كاتشين 10 من الوتد. ومع ذلك، شماعة زيادة الوزن الجزيئي أيضا أدت إلى زيادة كبيرة في قطر نانوحبيبات، ومن ثم قدراتها المادية لعبور BBB. ولذلك، علينا التحقق ما إذا كان الأبعاد الفيزيائية للجسيمات حالت دون مرورها عبر بتب وعما إذا كانت هذه الملاحظات يمكن أن تكون متطابقة المجراة.

ووفقا للملاحظات التي تم نشرها في السابق، لاحظنا أن NP110s اكسترافاساتيد عن طريق بتب في المختبر وبي بي بي من الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة، بينما NP350s الإبقاء على الجانب لومينال تقليد بتب وفي الأوعية الدموية من الفئران. هذه النتائج مماثلة توحي بقوة أن تنبأ النموذج بتب المجراة في قدرة جسيمات نانوية عبور BBB وتصل إلى الدماغ.

وكثيراً ما تناقش أهمية النماذج الخلوية من بي بي بي، حتى لإيصال المركزية من جسيمات نانوية³⁸. نعرض هنا أن أستروسيتيس الأولية وخلايا بطانية، كلاهما تعتبر أهم الأدوات في المختبر، يمكن الاستعاضة عن الخلايا مخلدة و/أو المتاحة تجارياً، ضمان قابلية أكبر وإمكانية تكرار نتائج. ويمكن تطوير الجيل القادم من يقلد BBB في المختبر بدمج أجهزة موائع جزيئية، السماح للوحدات المشكلة جميل neurovascular تشبه هيكلياً BBB الفعلية^12،14. بيد أن هذه النماذج حاليا غير صالحة للفرز الفائق من الجزيئات التي سلمت إلى جليوماس، بسبب القيود التقنية في المتابعة تسليم¹⁴. من الصعب حقاً التقاط الفسيولوجية تعقيد BBB في طبق، ويمكن أن تهدد إمكانية عدم وجود بعض مستقبلات/البروتينات، والمعروف أن تبديها BBB، تفسير النتائج. حجة أخرى تتعلق تقلبات كبيرة في التعبير الجيني بين ظروف المجراة في وفي المختبر، وكذلك من خط خلية واحدة إلى آخر، خاصة بالنظر إلى خلايا بطانية. ومع ذلك، يمكن القول أن وحدة neurovascular ليست كيانا موحدا داخل المخ³⁹. توصلت البحوث العلمية في مجال البيولوجيا حقبة إنسانية حيث نظرت الرفق بالحيوان، والمسؤولية الأخلاقية، وتكلفة استخدام حياة الحيوان دائماً قبل تصميم تجربة. ولذلك، لدعم استبدال الحيوانات، عدد متزايد من الدراسات التي أجريت مؤخرا تظهر أن الوعي بالقيود المفروضة على النماذج والاختيار الدقيق للنماذج الخلوية إنشاء الجدار العازل – مع تشديد على أستروسيتيس – تبرر المباراة بين النتائج التي تم الحصول عليها في صحن وفي الحيوان النماذج⁴⁰. مع المنهجية الموضحة هنا، نحصل على خطوة واحدة أقرب إلى خفض عدد الحيوانات التجريبية المستخدمة لفحص أغراض ترانسسيتوسيس بي بي بي للمداواة المحتملة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
bEND3	ATCC	CRL-2299	Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin
HIFko immortalized mouse astrocytes	Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab	https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6	Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin
HuAR2T	Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Cultured in: EBM-2 with SupplementMix
normal human primary astrocytes	Lonza	CC-2565	Cultured in: ABM with SingleQuots
Material and reagents
100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350
10 mL serological pipet	ThermoFisher Scientific	170361
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339650
ABM Basal Medium, 500 mL	Lonza	CC-3187	For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS
Accutase Cell Detachment Solution	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors	Lonza	CC-4123
B27 supplement	Gibco	17504-044	for both GBM + and - medium
Basal Medium Eagle	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3506
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham	Gibco	21331-020	Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines
EBM-2 growth Medium SupplementMix	PromoCell	c-39216	EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS
Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)	PromoCell	c-22211	EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	ThermoFisher Scientific	10500056
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)
Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips	Thermo Scientific	10313573
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407
Recombinant Human EGF	Peprotech	GMP100-15	for GBM+ medium
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	100-18B	for GBM+ medium
Immunofluorescence
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
24 mm x 60 mm microscope slide cover glass	ORSAtec	0224601-D
AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies	ThermoFisher Scientific		dilution: 1/500
Anti-Claudin-5 antibody	Abcam	ab15106	dilution: 1/150
Anti-GFAP antibody clone GF5	Abcam	ab10062	dilution: 1/150
Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3	BD Biosciences	550274	dilution 1/800
Anti-SV40 T-antigen antibody	Abcam	ab16879	dilution: 1/150
Anti-Zonula Occludens-1	Abcam	ab96587	dilution: 1/200
DAPI	TOCRIS	5748
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680
LysoTracker Red DND-99	ThermoFisher Scientific	L7528
Animal procedures
10 cm curved dissecting scissors	World Precision Instruments	14394
BD Microlance 25 G needles	Becton Dickinson	300600
Fine Forceps (12.5 cm)	World Precision Instruments	503283	for tissue dissociation
Intramedic Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Ketaminol vet 50 mg/mL	Intervet	Vnr511485	Ketamine
Mains Powered microdrill	World Precision Instruments	503599
Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips	Thermo Scientific	11888372
Micro Bulldog clamp	World Precision Instruments	14119
Physiological saline solution	Mustela	Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class
Rochester-Oschner forceps	World Precision Instruments	501709
Rompun vet 20 mg/mL	Intervet	Vnr148999	Xylazine
Stereotaxic adapter	World Precision Instruments	502063
Sugi Sponge Points	Kettenbach	31603
Equipment
Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope	Carl Zeiss
FLUOstar Omega microplate reader	BMG Labtech
ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera	Hamamatsu Photonics
Universal 320 tabletop centrifuge	Hettich	Cat. No. 1401
ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope	Carl Zeiss