Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في العمليات الخلوية ويتم تنسيقها بإحكام من قبل deubiquitination. العيوب في كل من ردود الفعل تكمن وراء الأمراض البشرية. نحن نقدم بروتوكولات لإجراء رد فعل في كل مكان وdeubiquitination في المختبر باستخدام المكونات النقية.

Abstract

Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في مسارات الإشارات المختلفة ويشارك بشكل ملحوظ في تنسيق وظيفة الكروماتين والعمليات المرتبطة بالحمض النووي. ينطوي هذا التعديل على عمل متسلسل من العديد من الإنزيمات بما في ذلك E1 يوبيكويتين-تفعيل, E2 يوبيكويتين-الاقتران وE3 في كل مكان-ligase وعكس هابيكويتيناسيس (DUBs). في كل مكان يحفز تدهور البروتينات أو تغيير وظيفة البروتين بما في ذلك تعديل النشاط الأنزيمي، والتفاعل بين البروتين والبروتين والتوطين تحت الخلية. خطوة حاسمة في إظهار البروتين في كل مكان أو deubiquitination هو أداء ردود الفعل في المختبر مع المكونات النقية. يمكن أن تتأثر ردود الفعل الفعالة في كل مكان وdeubiquitination إلى حد كبير من قبل المكونات المختلفة المستخدمة، والعوامل المشتركة الإنزيم، وظروف العازلة، وطبيعة الركيزة.  هنا، ونحن نقدم بروتوكولات خطوة بخطوة لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination. نحن نوضح هذه ردود الفعل باستخدام مكونات الحد الأدنى من الماوس مجمع بوليكومب القمعية 1 (PRC1)، BMI1، وRING1B، وهو E3 ubiquitin ligase أن monoubiquitinates histone H2A على يسين 119. يتم تنفيذ ثنائي ة من H2A النيوكليوسومال باستخدام الحد الأدنى من مجمع Deubiquitinase القمعية بوليكومب (PR-DUB) التي شكلتها ثنائية الإنسان BAP1 ومجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) من العامل المشارك ASXL2. ويمكن إجراء هذه الاختبارات في كل مكان / اللوب في سياق إما النيوكليوسوم المؤتلف المعاد تشكيله مع البروتينات المنقاة للبكتيريا أو النيوكليوسومات الأصلية النقية من خلايا الثدييات. ونحن نسلط الضوء على التعقيدات التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على ردود الفعل هذه، ونقترح أن المبادئ العامة لهذه البروتوكولات يمكن تكييفها بسرعة مع غيرها من E3 في كل مكان ligases وdeubiquitinases.

Introduction

Ubiquitination هي واحدة من التعديلات الأكثر حفظا بعد الترجمة وحاسمة لمجموعة واسعة من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والنباتات والفقاريات. يوبيكيتيشن يتكون من مرفق التكافؤ من يوبيكويتين، وهو 76 ببتيد الأحماض الأمينية المحفوظة للغاية، لاستهداف البروتينات ويحدث في ثلاث خطوات متتالية تنطوي على ثلاثة أنزيمات، أي E1-تفعيل، E2-الاقتران وE3 ligase1، 2،3. يلعب هذا التعديل ما بعد الترجمة أدوارًا مركزية في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في الواقع، فإن الأربطة E3، والتي توفر خصوصية رد الفعل، تشكل عائلة عظمى كبيرة من الإنزيمات وهي الإنزيمات الأكثر وفرة من نظام ubiquitin4،5،6. تعتمد الآثار النهائية للبروتين في كل مكان على طبيعة التعديل: أحادية الشبه، ومتعددة أحادية المونوبية، وتعدد الأقطاب الخطي أو المتفرع. نادرا ً ما يرتبط المونوبيكويتين بالتدهور البروتياسومال، ولكن بدلاً من ذلك يشارك هذا التعديل في التوسط في مختلف أحداث الإشارات. [بولوبقويتيتينأيشن] يتضمّن ال [ن-ترمينل] أو اليسين بقايا في [أوبقويقويتين] جزيء نفسه, والمصير من بروتين [بولوبقويتينت] يعتمد على أيّ بقايا يكون تضمّنت في [أوبقويتين] سلسلة إمتداد. ومن المعروف منذ فترة طويلة أن تعدد الحالات المضلع ة بوساطة يسين 48 من يوبيكويتين يسبب تدهور البروتياسومال. على العكس من ذلك، غالباً ما يرتبط تعدد الموبيكتيين عن طريق يسين 63 من أوبكويتين مع تنشيط البروتين7،8،9. على غرار التعديلات الهامة الأخرى بعد الترجمة، في كل مكان هو عكسها ويتم ضمان إزالة ubiquitin من البروتينات من قبل البروتياز محددة تسمى deubiquitinases (DUBs)، والتي ظهرت كجهات تنظيمية هامة للعمليات الخلوية 2 , 10.الأهم من ذلك، العديد من DUBs هي متخصصة للغاية، وتنظيم، من خلال deubiquitination، ركائز محددة، مما يشير إلى أن التوازن الدقيق بين في كل مكان وdeubiquitination أمر بالغ الأهمية لوظيفة البروتين. E3s وDUBs، جنبا إلى جنب مع آلات التحلل بروتياسوم والعوامل التبعي، تشكل نظام البروتياسوم Ubiquitin (UPS، مع > 1200 الجينات) الذي ينظم مسارات الإشارات الرئيسية، والتي يرتبط العديد منها مع نمو الخلايا وانتشارها، تحديد مصير الخلية، والتمايز، وهجرة الخلايا، وموت الخلية. الأهم من ذلك، إلغاء الضوابط التنظيمية من العديد من السلاسل التعاقبية الإشارات التي تنطوي على في كل مكان يعزز تكوين الأورام وأمراض التنضد العصبي5،11،12،13، 14.

يلعب التمركز أدوارًا متفشية في بيولوجيا الكروماتين والعمليات المعتمدة على الحمض النووي15و16و17. على سبيل المثال، المونوبيكيت من الهيستون H2A على يسين 119 (فيما يلي H2A K119ub) هو تعديل ما بعد الترجمة الحرجة المشاركة في القمع النسخي وإصلاح الحمض النووي18،19،20، 21،22. يتم تحفيز H2A K119ub من قبل مجمع بوليكومب القمعي 1 (PRC1)، الذي يلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على المعلومات الوراثية ويتم الحفاظ عليها بشكل كبير من دروسوفيلا إلى الإنسان. يتكون PRC1 الكنسيبشكل خاص من قبل RING1B و BMI1، والتي هي الأساسية E3 مجمع ubiquitin ligase المسؤولة عن الحدث في كل مكان المذكورة أعلاه22،23. في دروسوفيلا، يتم عكس H2A monoubiquitination (H2A K118ub الذي يتوافق مع H2A K119ub في الثدييات) من قبل كاليبسو دوب ، الذي يتفاعل مع مشط الجنس إضافية (ASX) تشكيل مجمع دوب بوليكومب القمعية (PR-DUB)24. وتقويم الثدييات من كاليبسو، BAP1، هو مثبط الورم حذف أو تعطيل في الأورام الخبيثة البشرية المختلفة25،26،27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33.BAP1 ينظم العمليات التي تعتمد على الحمض النووي في النواة والكالسيوم إشارة بوساطة المبرمج في الشبكية endoplasmic33،34،35،36، 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.BAP1 يجمع مجمعات البروتين متعددة الوحدات الفرعية التي تحتوي على المنظمين النسخ لا سيما ASXL1، ASXL2 وASXL3 (ASXLs)، ثلاثة orthologues من ASX38،43. ASXLs استخدام مجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD)، وتسمى أيضا مجال ASXM، لتحفيز نشاط BAP1 DUB35،36،44. وبالتالي، ASXLs تلعب أدوارا هامة في تنسيق نشاط BAP1 DUB في الكروماتين وعلى نطاق أوسع وظيفتها قمع الورم.

توجد عدة طرق لدراسة عمليات التمركز والتجريد من الأويوبية. وتجدر الإشارة إلى أن الاختبارات البيوكيميائية التي تستخدم البروتينات المنقّهة من البكتيريا لا تزال قوية جداً في إظهار الانتشار المباشر لركائز محددة أو إزالة كل شيء منها. ويمكن إجراء هذه التجارب للتحقيق في مجموعة من المعلمات مثل تحديد متطلبات الحد الأدنى من المجمعات، وتحديد ردود الفعل الحركية، وتحديد العلاقات بين الهيكل/ وظيفة، وفهم تأثير المرضية الطفرات الجينية. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination على ركائز الكروماتين مع مكونات تنقية. كنظام نموذجي، يتم تقديم في كل مكان في المختبر وdeubiquitination من بروتين H2A النيوكليوسومال. وتستخدم البروتينات المنقاة للبكتيريا التي يتم تجميعها في الحد الأدنى من المجمعات من RING1B/BMI1 و BAP1/DEUBAD لانتشار أو إلغاء يوبيكويتين من H2A النيوكليوسومال، على التوالي.

Protocol

1. GSH-أغاروز تنقية التقارب من GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 مجمع يوبيكويتين Ligase

  1. استخدام pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) البكتيريا التعبير بناء لتحويل BL21 (DE3) البكتيريا (انظر جدولالمواد)23. يسمح هذا البناء التعبير عن المجال RING1B murine 1-159 تنصهر إلى مجال BMI1 1-109 مع علامة GST في العمود الفقري pGEX-6P-2.
  2. أداء ثقافة كاتب بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح البكتيريا RIL التعبير عن GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109 aa) في 20 مل من LB مرق المتوسطة في وجود 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين و 50 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. الحضانة عن طريق الهز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، أضف ثقافة البداية إلى قارورة 1 لتر تحتوي على 500 مل من مرق LB الطازج المتوسط (1/26 تخفيف) مع أمبيسيلين واحتضان الثقافة في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 4 ساعة.
  3. خلال وقت الحضانة، قياس OD في 600 نانومتر مع مقياس الطيف الضوئي. عندما تصل ثقافة البكتيريا إلى 0.6 وحدة OD في 600 نانومتر، تأخذ aliquot 1 مل في أنبوب 1,5 مل كعينة غير مستحثة. إضافة 400 درجة مئوية من ايزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) إلى ثقافة 1 لتر للحث على التعبير عن البروتين. حضانة البكتيريا في 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعات إلى ليلة وضحاها.
    1. طرد مركزي aliquots 1 مل في 14،000 × ز لمدة 30 ثانية، وتجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 200 درجة مئوية من المخزن المؤقت عينة Laemmli، والحفاظ على SDS-PAGE وCoomassie التحليل الأزرق للتحريض البروتين.
  4. نقل ثقافة البكتيريا المستحثة من قارورة في زجاجة الطرد المركزي نظيفة وتدور إلى أسفل في 3500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. تخلص من الـ supernatant وresuspend بيليه مع 40 مل من PBS الباردة وتدور إلى أسفل في 3500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. تجاهل supernatant وتجميد بيليه في -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية. إذا تم حث البروتينات في الوزن الجزيئي المتوقع، انتقل إلى الخطوة التالية.
  6. إعادة تعليق بيليه البكتيريا في 25 مل من الجليد الباردة lysis العازلة A (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 100 m NaCl, 1 m EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, و 1/100 كوكتيل مضاد للبروتياز يحتوي على AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, and Pepstatin A). تأكد من أن جميع البكتيريا بيليه هو إعادة تعليقها. يجب إضافة كوكتيل PMSF ومضاد البروتياز طازجًا إلى مخزن الليسيا، فقط في وقت الليسي البكتيريا.
    تحذير: احتفظ دائماً بالعينة على الثلج
    ملاحظة: يمكن إضافة Lysozyme في 100 ميكروغرام / مل لتعزيز الليسي البكتيريا.
  7. احتضان البكتيريا lysate على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    تحذير: خلال سونيكيشن، والحفاظ دائما على عينات على الجليد.
  8. خلال وقت الطرد المركزي، واتخاذ 500 درجة مئوية معبأة الخرز GSH-أغاروز (50٪ الطين) في أنبوب 15 مل وإضافة 10 مل من العازلة A دون PMSF ومكافحة البروتياز. يُخلط المزيج لفترة وجيزة ويُدور على حرارة 2500 غرام لمدة 3 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُكرّر خطوة الغسيل هذه مرتين إضافيتين ويُبقي الخرز على الثلج.
  9. بعد التسلّق البكتيري الطرد المركزي، قم بجمع الـ supernatant ونقله إلى أنبوب مخروطي بـ 50 مل. خذ aliquot من 100 درجة مئوية كـ lysate الكلي وإضافة 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE والتحليل الأزرق Coomassie.
  10. قم بتصفية الليسات من خلال فلتر حقنة المسام بـ 0.45 م وامزجه مع حبات GSH. حضانة في 4 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 ح. تدور أسفل الخرز في 2500 × ز لمدة 3 دقائق، وإزالة، وحفظ supernatant كما تدفق من خلال. غسل البروتينات-GSH الخرز ملزمة 6 مرات (5 مل لكل منهما) مع العازلة A التي تحتوي على كوكتيل المضادة للبروتياز وPMSF.
  11. بعد الغسيل الأخير، نقل الخرز جنبا إلى جنب مع 10 مل من العازلة في عمود كروماتوغرافيا فارغة، إضافة 1.5 مل العازلة A التي تحتوي على 25 مل الجلوتاثيون، وجمع الإنعلاق عن طريق الجاذبية في الأنابيب الدقيقة 1.5 مل. كرر إجراء الإلتبيلة 4 مرات.
    ملاحظة: يتم إعداد محلول مخزون الجلوتاثيون في تركيز 200 m في 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5
  12. تأخذ aliquot من 10 درجة مئوية من كل واحد من 4 elutions وإضافة 10 μL من 2X Laemmli عينة العازلة. وسوف تستخدم هذه العينات لتحليل SDS-PAGE وCoomassie الأزرق لتحديد وجود ونقاء البروتينات النقية.
    ملاحظة: بعد الإلتبيلة الأخيرة، والحفاظ على الخرز في المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لإعادة التدوير والاستخدام في المستقبل.
  13. اختيار الكسور المنكسرة التي تظهر كميات معقولة من البروتينات النقية لمزيد من التحليل. جعل aliquots صغيرة من التحضير. تخزين البروتينات النقية في -80 درجة مئوية. عادة، سوف تتراوح تركيز البروتين من 0.5 ميكروغرام إلى 2 ميكروغرام لكل ميكرولتر ويمكن تخزين العينات في هذه الحالة.
  14. اختياري: تركيز العينة أو تغيير العازلة باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي 10K

2 - تنقية مجمع ديوبيكيتيناز BAP1/DEUBAD (ASXL2)

  1. استخدام pET30a + -His-BAP138 و pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 بنية التعبير البكتيري لتحويل BL21 (DE3) البكتيريا RIL لإنتاج له-BAP1 وميغابت في الثانية-DEUBAD على التوالي.
  2. إجراء ثقافتين منفصلتين لبداية الليل عن طريق احتضان His-BAP1 وMBP-DEUBAD (ASXL2) للتعبير عن البكتيريا في 20 مل من مرق LB من أمبيسلين المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول والمضادات الحيوية المقابلة لكل بلازميد، 100 ميكروغرام / مل من كانامايسين أو 100 ميكروغرام / مل من أمبيسيلين على التوالي. مكان على شاكر في 37 درجة مئوية.
  3. تنفيذ الخطوات 1.3-1.6.
  4. إعادة تعليق الكريات البكتيريا في 25 مل من الجليد الباردة lysis العازلة B (50 MM تريس درجة الحموضة 7.3، 500 مل NaCl، 3 mM β-Mercaptoethanol، 0.2٪ تريتون X-100، 1 mM PMSF و 1/100 كوكتيل المضادة للبروتيا). مزيج كميات متساوية من BAP1 His-مع الليسات ميغابت-DEUBAD وحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    1. أثناء الطرد المركزي، إعداد 500 ميكرولتر معبأة ني-NTA الخرز أغاروز (50٪ الطين) عن طريق غسلها ثلاث مرات مع العازلة B دون PMSF وكوكتيل المضادة للبروتياز.
  5. بعد التسلّق البكتيري الطرد المركزي، قم بجمع الـ supernatant ونقله إلى أنبوب مخروطي بـ 50 مل. خذ aliquot من 100 درجة مئوية كـ lysate الكلي وإضافة 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE والتحليل الأزرق Coomassie.
  6. قم بتصفية الليسات من خلال فلتر حقنة المسام بـ 0.45 م وامزجه مع حبات Ni-NTA. الحضانة في 4 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 ح. تدور أسفل الخرز في 2500 × ز لمدة 3 دقائق، وإزالة، وحفظ supernatant كما تدفق من خلال.
    1. غسل الخرز 6 مرات (5 مل لكل منهما) مع العازلة B التي تحتوي على 20 مل 1,3-ديازا-2,4-سيكلوبنتادين (إيميدازول).
      ملاحظة: جعل حل الأسهم من 2 M إيميدازول في الحموضة 7.3.
  7. بعد الغسيل الأخير، نقل الخرز مع 10 مل من العازلة في عمود كروماتوغرافيا فارغة، إضافة 1 مل العازلة B تحتوي على 200 mM إيميدازول وجمع الإلتصاق عن طريق الجاذبية في 1.5 مل الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على 10 ميكرولتر DTT (500 مل) و 2 درجة مئوية بتوقيت البحر المتوسط (500 مل بتوقيت جنوم ، والح موضة: 8). كرر إجراء الإلوتيون 4 مرات. خذ 10 ميكرولتر من كل كسر الإلوتيون وأضف 10 ميكرولتر من 2x Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE والتحليل الأزرق Coomassie. تجمع الكسور المطلوبة.
    ملاحظة: الحفاظ على الخرز في المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لإعادة التدوير والاستخدام في المستقبل.
  8. تمييع مجمع eluted 3 مرات مع العازلة C (50 mM تريس درجة الحموضة 7.3، 300 مل NaCl، 1٪ تريتون X-100، 5 MM DTT، 1 MM EDTA، 1 MM PMSF، و 1/100 كوكتيل مثبط البروتياز) قبل الحضانة مع حبات أغاروز أميلوز.
    1. إعداد حبات amylose agarose (500 درجة مئوية معبأة) عن طريق غسلها 2 مرات مع C العازلة دون إضافة PMSF وكوكتيل المضادة للبروتياز. يُضاف الخرز إلى الإلتواء المخفف والحضانة بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. الطرد المركزي في 2500 × ز لمدة 3 دقائق والحفاظ على تدفق من خلال. اغسل حبات البروتينات مع 5 مل من المخزن المؤقت C (5-6x).
  10. الحفاظ على تنقية له-BAP1 /ميغابت في الثانية-DEUBAD مجمع على حبات أغروس amylose في العازلة D (50 m HePES درجة الحموضة 8.0، 50 مل كلدس، 10٪ الجلسرين، و 1 MM DTT) وتخزينها في -80 درجة مئوية. تأخذ 20 درجة مئوية من جزء الخرز (50٪ محلول الخرز) وإضافة 20 درجة مئوية من 2X Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE وتحليل الأزرق Coomassie.

3. تنقية النيوكليوسومات من خلايا HEK293T

  1. خلايا الثقافة HEK293T في المتوسط النسر المعدلة كاملة دولبكو (DMEM) تستكمل مع 5٪ مصل العجل حديثي الولادة (NBS)، 2 MM L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / العقديات.
  2. لوحة حوالي 12 × 106 خلايا HEK293T في 20 مل من وسائل الإعلام كاملة لكل طبق ثقافة 15 سم قبل يوم واحد من transfection (تم استخدام 10 أطباق). قبل الانعطاف، تغيير متوسط الخلية إلى 12 مل من المصل خالية من المتوسطة وtransfect الخلايا مع 21 ميكروغرام من pCDNA-العلم-H2A باستخدام 63 ميكرولتر من البولي إيثيلينيمين (PEI) في 1 ملغ / مل36. تغيير لإكمال المتوسطة 12 ساعة في وقت لاحق.
  3. ثلاثة أيام بعد الانسياق، وغسل الخلايا مع 15 مل الجليد الباردة PBS (مرتين) وحصادها في 3 مل من الجليد الباردة PBS باستخدام مكشطة الخلية. الطرد المركزي في 2100 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل PBS والمضي قدما إلى خطوة lysis أو تجميد بيليه الخلية في -80 درجة مئوية.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في حوالي 10 أحجام من العازلة E (50 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.3، 420 مل كلوريد رأس كلوريد الضوض، 1٪ NP-40، 1 MM MgCl2،1 mM PMSF، 1/100 كوكتيل مثبطات البروتياز، و 20 مل من N-methylmaleimide (NEM)) وحضانة على الجليد لمدة 20 دقيقة. N-ميثيل ماليميد (NEM) أمر بالغ الأهمية لمنع DUBs التي تشترك في تنقية مع النيوكليوسومات.
  5. بعد الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه الكروماتين في 10 أحجام من العازلة E. مزيج عن طريق انعكاس والطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 5 دقائق.
    1. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت E ومرتين باستخدام المخزن المؤقت F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5 و 100 mM KCl و 2 m M MgCl2و 1 m M CaCl2و 0.3 M السكروز و 0.1% NP-40 و 1 mM PMSF و 1/100 مثبطات البروتياز كوكتيل).
      تحذير: بيليه سوف تطفو خلال عمليات الزرع والطرد المركزي.
  6. إعادة تعليق الكروماتين في 5 مل العازلة F وعلاج بيليه مع نوكالإيجار Micrococcal (MNase) (3 U / مل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد رد الفعل عن طريق خلط باستخدام المجانسة Dounce.
  7. بعد الحضانة، خذ 40 ميكرولتر aliquot من الخليط لتحليل شظايا الحمض النووي النووي. خلط هذا aliquot مع 40 درجة مئوية من الفينول / الكلوروفورم و 20 درجة مئوية من 6X الحمض النووي تحميل العازلة، دوامة، تدور في 18،000 × ز لمدة 2 دقيقة، وتحميل الحمض النووي على هلام أغاروز 2٪.
    1. عندما يكون الحمض النووي في الغالب 147 جزء bp المقابلة لmononucleosomes، ووقف رد الفعل عن طريق إضافة 5 MM EDTA في التركيز النهائي.
  8. بعد الطرد المركزي في 21،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، واحتضان كسر الكروماتين القابلة للذوبان مع الراتنج المضادة للعلم بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. غسل الخرز مع 6X العازلة G (50 M تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.3، 5 MM EDTA، 150 مل NaCl، 1٪ NP-40، 1 mM PMSF، 1 MM DTT، 1/100 مثبطات البروتياز كوكتيل).
  9. نقل الخرز مع 5 مل العازلة G في عمود كروماتوغرافيا فارغة. Elute النيوكليوسومات ملزمة الخرز مع 200 ميكروغرام / مل من الببتيد العلم elution. استخدام المخزن المؤقت elution تتألف من المخزن المؤقت G التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل العلم الببتيدات (انظر جدول المواد)و 1/5 (المجلد: المجلد) 1 M Tris، درجة الحموضة 8.0. Elute النيوكليوسومات 3X مع 260 ميكرولتر العلم elution العازلة (2 ح كل elution).
  10. اختبار elutions 3 عن طريق اتخاذ aliquot لاستخراج الفينول الكلوروفورم وتحميل الحمض النووي في هلام أغاروز 2٪. خذ 10 ميكرولتر من كل كسر الإلوتيون وإضافة 10 ميكرولتر من Laemmli عينة العازلة 2X لتحليل SDS-PAGE وCoomassie الأزرق وتحميل كل الإلتاء للكشف عن لطخة الغربية من H2A في كل مكان. تخزين elution في -80 درجة مئوية. بشكل عام، تنقية من الخلايا البشرية تنتج كمية أقل من البروتينات من تلك التي من البكتيريا، مع تركيزات تتراوح بين 0.1 إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.

4. النيوكليوسوم في كل مكان التبي باستخدام BMI1 /RING1B E3 مجمع يوبيكويتين Ligase

  1. طرد مركزي النيوكليوسومات من خلال 10K المسام 0.5 مل مرشحات الطرد المركزي لتغيير الركيزة من العازلة elution إلى العازلة رد الفعل H (25 MM Tris, pH 7.5; 10 mM MgCl2,و 5 mM ATP). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام النيوكليوسومات المتاحة تجارياً في الفحص.
    ملاحظة: تغيير حل تعليق الركيزة إلى العازلة رد الفعل يضمن استنساخ ويمنع تثبيط الأربطة E3 المحتملة من قبل المركبات الموجودة في خليط elution العلم.
  2. احتضان 1 ميكروغرام من النيوكليوسومات في 40 ميكرولتر الحجم الإجمالي للمخزن الاحتياطي H. إضافة أوب تنشيط الإنزيم (UBE1) (250 نانوغرام)، أوب (50 نانوغرام / كيلولتر) و E2 أوب الاقتران الإنزيمات (672 نانوغرام)، و 1 ميكروغرام من BMI1 / RING1B E3 مجمع الأربطة يوبيكويتين. احتضان رد الفعل لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية مع الهز في بعض الأحيان.
    ملاحظة: ويمكن إجراء العديد من الضوابط في نفس الوقت بما في ذلك حذف، E1، E2، E3، ATP وubiquitin. وهذا يضمن خصوصية رد الفعل في كل مكان.
  3. وقف رد الفعل عن طريق إضافة 40 درجة مئوية من 2X Laemmli عينة العازلة وتحليل الهيستون H2A K119 في كل مكان من قبل SDS-PAGE والنشاف الغربية، وفقا للإجراءات القياسية. استخدام إما المضادة للH2A أو المضادة للH2A K119ub الأجسام المضادة (انظر جدولالمواد).

5. في المختبر النيوكليوسومال H2A DUB فحص باستخدام BAP1 /DEUBAD

  1. استخدام النيوكليوسومات النقية للفحص في المختبر deubiquitination. إعادة تعليق 100-500 نانوغرام من النيوكليوسومات في المخزن المؤقت 1 40 ميكرولتر (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.3، 1 مم كل2،50 مل شمال تشاو، و 1 MM DTT). إضافة 1 ميكروغرام من BAP1 البكتيريا تنقية له-BAP1 وميغابت في الثانية-DEUBAD. تنفيذ رد فعل الديوبكويتينيشن لمدة 3 ح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عرضية.
  2. وقف رد الفعل في المختبر عن طريق إضافة 40 درجة مئوية من 2X Laemmli العازلة وتحليلها عن طريق المناعة.

النتائج

يتم إنتاج بروتينات GST-BMI1 وRING1B بشكل جيد في البكتيريا ويمكن استخراجها بسهولة في الكسر القابل للذوبان. يظهر الشكل 1A تلطيخ الأزرق Coomassie لتنقية نموذجية من مجمع GST-BMI1-RING1B. تهاجر نطاقات GST-BMI1 وRING1B عند الوزن الجزيئي المتوقع، حوالي 45 كيلوداً وحوالي 13 كيلوداً على الت?...

Discussion

هناك العديد من المزايا لإنشاء قوية في المختبر في كل مكان واختبارات ديوبيكيتيشن للبروتينات ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه الاختبارات من أجل: '1' تحديد الظروف المثلى وتحديد الحد الأدنى من المتطلبات لهذه التفاعلات، '2' تحديد الثوابت الحركية والكيميائية الحيوية الأنزيمية، '3' تحديد أدوار العوا...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر ديانا أدجود على المساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (2015-2020)، وجينوم كيبيك (2016-2019) وجينوم كندا (2016-2019) إلى E.B.A. E.B.A. هو باحث كبير في مؤسسة بحوث كيبيك سانتي (FRQ-S). L.M وN.S.K. لديهم منحة الدكتوراه من FRQ-S. حصل سعادة على منحة دكتوراه من وزارة التعليم العالي ومن البحث العلمي في تونس ومؤسسة كول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amylose agarose beadsNew England Biolabs#E8021
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10KSigma-Aldrich#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)Cell Signaling Technology#8240
Anti-Flag-agarose beadsSigma-Aldrich#A4596
Anti-protease cocktailSigma-Aldrich#P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteriaAgilent technologies#230240
DMEMWisent#319-005-CL
Empty chromatography columnBiorad#731-1550
Flag peptideSigma-Aldrich#F3290
GSH-agarose beadsSigma-Aldrich#G4510
HEK293TATCC#CRL-3216
ImidazoleSigma-Aldrich#I5513
Micrococcal nuclease (MNase)Sigma-Aldrich#N3755
Ni-NTA agarose beadsThermoFisher Scientific#88221
N-methylmaleimide (NEM)Bioshop#ETM222
Pore syringe filter 0.45 μmSarstedt#83.1826
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)Addgene#63139
Ub Activating Enzyme (UBE1)Boston Biochem#E-305
UBCH5C (UBE2D3)Boston Biochem#E2-627

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149deubiquitinationE3 ubiquitin ligasePRC1deubiquitinasePR DUBBAP1ASXLBMI1RING1BH2A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved