JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

Abstract

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי, שמנגן תפקידים חשובים במסלולי איתות שונים, והוא מעורב בעיקר בתיאום תפקוד כרומטין ותהליכים הקשורים ל-DNA. שינוי זה כולל פעולה רציפה של אנזימים מספר כולל E1 אוביקוויב-הפעלה, E2 אוביקוויב-מעלה-מעלה ו-E3 אוביקוויב-ligase והוא הפוך על ידי דאוביטיות (DUBs). אוביקווינציה גורמת השפלה של חלבונים או שינוי של פונקציית החלבון כולל אפנון של פעילות אנזימטית, חלבון-חלבון אינטראקציה ולוקליזציה subcellular. צעד קריטי להפגין אוביקוויטיות חלבון או דאובינציה היא לבצע תגובות מחוץ לחומרים עם רכיבים מטוהרים. התגובות אוביקוויטיות יעיל והתגובה הדו יכול להיות מושפע מאוד על ידי רכיבים שונים המשמשים, האנזים שיתוף גורמים, מאגר תנאים, ואת האופי של המצע.  כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לניהול אוביקווינציה ותגובות דאוטיות. אנו ממחישים את התגובות הללו באמצעות רכיבים מינימליים של מתחם העכבר polycomb סרק מורכב 1 (PRC1), BMI1, ו RING1B, E3 אוביקוויב ליגאז לפני שהוא H2A על ליזין 119. דאוביטיות של נוקלאוטיז H2A מבוצע באמצעות מורכבות מינימלית של הפולימסרק (PR-דאב) המורכב על ידי האדם deubiquitinase BAP1 והמתאם הדו (דאובאד) התחום של הגורם המשותף שלה ASXL2. ניתן לנהל את הרקומביננטי האלה בהקשר של מישהו משני הצדדים בחלבונים מטוהרים בחיידקים או בנוקלאוזומים מקומיים מטוהרים מתאי מיונקים. אנו מדגישים את המורכבויות שיכולה להשפיע באופן משמעותי על תגובות אלה ואנו מציעים כי העקרונות הכלליים של הפרוטוקולים הללו יכולים להתאים במהירות ל-E3 אחרים ולליקוויטיות.

Introduction

אוביקווינציה היא אחת השינויים השכיחים ביותר שלאחר ההעברה והיא קריטית עבור מגוון רחב של אורגניזמים כולל שמרים, צמחים ובעלי חוליות. אוביקווינציה מורכבת ההחזקה הקוולנטי של אוביקוויב, 76 שמרו באופן מאוד polypeptide חומצות אמינו, כדי למקד את החלבונים ומתרחשת בשלושה צעדים רציפים מעורבים שלושה אנזימים, כלומר, E1-הפעלה, E2-מעלה מעלה ו E3 ליגאז1, 2,3. השינוי הפוסט-טרנסלייתי הזה ממלא תפקידים מרכזיים בספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים. אכן, E3 ליגסים, אשר לספק את הספציפיות של התגובה, מהווים משפחה גדולה של אנזימים הם האנזימים הנפוצים ביותר של מערכת אוביקוויב4,5,6. השפעות הזרם המורד של אוביקוויטיות בחלבון תלויות באופי השינוי: מונאובינציה, רב-מונאובינציה, ולינארית או מסוpolyubiquitination. לעתים נדירות משויכת השפלה פרוטאספאל, אבל במקום זה שינוי מעורב במדיגדירוג אירועים שונים איתות. Polyubiquitination מערבת את N-מסוף או שאריות ליזין ב-אוביקוויב מולקולה עצמה, ואת גורלו של חלבון polyubiquitinated תלוי שבו שאריות מעורב בשלוחה אוביקוויב שרשרת. זה כבר זמן רב ידוע כי polyubiquitination תיווך על ידי ליזין 48 של אוביקוויב מעורר השפלה פרוטאספאואל. להיפך, polyubiquitination דרך ליזין 63 של אוביקוויבאין קשורה לעתים קרובות עם הפעלת חלבון7,8,9. בדומה שינויים חשובים אחרים לאחר שלאחר ההעברה, אוביקווינציה היא הפיכה ו אוביקוויב הסרת חלבונים מובטחת על ידי פרוטסים ספציפיים כינה דאוביטיות (DUBs), אשר התפתחה כרגולטורים חשובים של תהליכים סלולריים מיכל השני , 10. חשוב, dubs רבים מאוד מתמחה, ו לווסת, באמצעות דאוביציה, מצעים ספציפיים, המציין כי איזון עדין בין אוביקווינציה ו דאוביציה הוא קריטי לתפקוד החלבון. E3s ו DUBs, יחד עם מכונות השפלה פרוטאסדום וגורמי עזר, טופס אוביקוויב פרוטאסאט מערכת (UPS, עם > 1200 גנים) אשר מווסת מסלולים איתות העיקריים, כמה מהם משויכים צמיחת התאים והתפשטות, קביעת גורל התא, בידול, תא הגירה, ומוות תאים. חשוב מכך, רגולציה של מספר אותות מפלים מעורבים אוביקווינציה מקדמת טומגנזה ומחלות נוירוניוון5,11,12,13, . ארבע עשרה

אוביקווינציה ממלאת תפקידים בביולוגיה כרומטין ותהליכים תלויי-DNA15,16,17. למשל, מונביוביטיות של היסטון H2A על ליזין 119 (להלן H2A K119ub) הוא שינוי קריטי שלאחר ההמרה מעורב הדיכוי הטרנססקריפט ותיקון DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub הוא מזרז על ידי מתחם מורכב של פוליקומב דכ1 (PRC1), אשר ממלאת תפקיד מרכזי בתחזוקת מידע אפיגנטי והוא שימור מאוד מ דרוזוהילה לאדם. PRC1 קאנוני הוא היווה בעיקר על ידי RING1B ו BMI1, אשר הם הליבה E3 אוביקוויב ליגאז מורכבים אחראי על האירוע הנ ל אוביקווינציה22,23. ב דרוזוהילה, H2A מונבינציה (H2A K118ub המקבילה H2A K119ub ב מחאלינים) הפוכה על ידי ה-דאב קליפסו, אשר מקיים אינטראקציה עם מסרק סקס נוסף (asx) היוצרים את קומפלקס הפוליקומב הדכאני (PR-דאב)24. משתיק היונקים של קליפסו, BAP1, הוא מדכא הגידול נמחק או מופעל ב ממאירות שונים של בני אדם25,26,27,28, בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33. BAP1 מסדיר את התהליכים התלויים ב-DNA בגרעין ובסידן-איתות-בתיווך ואפופטוזיס ב-הרשת האנדופלזמית33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 מרכיב מערכות מרובות חלבון משנה המכילה ומווסתים שעתוק בעיקר ASXL1, ASXL2 ו ASXL3 (asxls), שלושה orthologues של asxls38,43. Asxls להשתמש במתאם דוסי ביקווינואז (דאובאד) דומיין, גם נקרא תחום asxls, כדי לעורר BAP1 דאב פעילות35,36,44. מכאן, ASXLs לשחק תפקידים חשובים בתיאום פעילות BAP1 דאב ב כרומטין ובאופן כללי יותר פונקציית מדכא הגידול שלה.

מספר שיטות קיימות כדי ללמוד אוביקווינציה ותהליכי דאובינציה. בעיקר, ביוכימיים אומר שימוש בחלבונים מטוהרים מחיידקים להישאר חזק מאוד להפגין אוביקווינציה ישירה של, או הסרת אוביקוויב מ, מצעים ספציפיים. ניתן לערוך ניסויים אלה כדי לחקור מגוון של פרמטרים כגון קביעת הדרישה של מתחמים מינימליים, קביעת מכלול התגובות הקינטיקה, הגדרת יחסי מבנה/תפקוד, והבנת ההשפעה של פתולוגי . מוטציות גנים כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע אוביקווינציה ותגובות דאוטיות על מצעים כרומטין עם רכיבים מטוהרים. כמערכת מודל, בתוך מבחנה אוביקווינציה ו דאוביטיות של החלבון H2A של נוקלאוטיזומיום מוצג. חיידקים מטוהרים חלבונים התאספו במערכות מינימליות של RING1B/BMI1 ו BAP1/דאובאד משמשים עבור אוביקווינציה או דאוביטינציה של נוקלאוטיל H2A, בהתאמה.

Protocol

1. GSH-לטיהור אהדה של GT-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 אוביקוויב לילגאוס קומפלקס

  1. השתמש pGEX6p2rbs-GT-RING1B (1-159 aa)-BMI1 (1-109aa) חיידקים ביטוי לבנות להפוך BL21 (DE3) חיידקים (ראה טבלת חומרים)23. בונה זה מאפשר את הביטוי של מורטין RING1B תחום 1-159 התמזגו BMI1 תחום 1-109 עם תג GT ב pGEX-6P-2 השדרה.
  2. לבצע תרבות התחלתית לילה על ידי הRING1B RIL-בקטריה המבטא GT-(1-159 aa)-BMI1 (1-109 aa) ב 20 מ ל של מדיום מרק LB בנוכחות של 100 μg/mL אמפיצילין ו50 μg/mL כלורמפנול. מודטה על ידי טלטול ב 37 ° c בלילה. ביום למחרת, להוסיף את התרבות הראשונית לבקבוקון 1 L המכיל 500 mL של מדיום ליברות טרי מרק (1/26 דילול) עם אמפיצילין ו מודאת התרבות ב שייקר ב 37 ° צ' עבור 2 כדי 4 h.
  3. בזמן הדגירה, למדוד את ה-OD ב 600 ננומטר עם ספקטרוסקופיה. כאשר החיידקים התרבות מגיע 0.6 OD יחידות ב 600 nm, לקחת 1 מ"ל סדרת מחלקים ב 1, 5 ml שפופרת כמו המדגם לא המושרה. להוסיף 400 μM של איזופרופיל β-D-1-thioגלאוסייד (IPTG) לתרבות 1 L כדי לגרום לביטוי חלבון. חיידקים מבית החיידק ב 25 ° c עבור 6 h כדי ללון.
    1. צנטריפוגה את 1 mL ali, בשעה 14,000 x g עבור 30 s, להיפטר supernatant, להשעות את הגלולה ב 200 μl של מאגר לדוגמה Laemmli, ולשמור על sds-PAGE ו coomassie ניתוח כחול של האינדוקציה חלבון.
  4. להעביר את התרבות חיידקים המושרה מן הבקבוקון לתוך בקבוק צנטריפוגה נקי ספין למטה ב 3,500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 40 mL של ה-PBS קר ו ספין למטה ב 3,500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
  5. השמט את הסופרנטאנט והקפא את הגלולה בשעה-80 ° צלזיוס או המשך לשלב הבא. אם החלבונים מושרה במשקל המולקולרי הצפוי, המשך לשלב הבא.
  6. להשעות מחדש את הגלולה חיידקים 25 מ ל של מאגר לפירוק קרח קר A (50 mM טריס-HCl pH 7.5, 100 מ"מ, 1 מילימטר edta, 1% NP40, 1 מ"מ PMSF, 0.5 MM dtt, ו 1/100 נגד פרוטאז קוקטייל המכיל AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, לוקיטין ו Pepסטטין A). ודא כי כל החיידקים הגלולה הוא מושעה מחדש. PMSF ו אנטי פרוטאז קוקטייל יש להוסיף טרי למאגר לפירוק, רק בזמן של חיידקים הליזה.
    זהירות: . תמיד תשאיר את הדגימה על קרח
    הערה: Lysozyme ב 100 μg/mL ניתן להוסיף כדי לשפר את הליזה חיידקים.
  7. מארג החיידק החיידקים על הקרח עבור 15 דקות. השתמש sonicator החללית ו sonicate ב 70% משרעת הפלט עבור 30 s (4 – 5x), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.
    זהירות: במהלך הsonication, לשמור תמיד את הדגימות על קרח.
  8. במהלך הזמן של צנטריפוגה, לקחת 500 μL ארז GSH-agarose חרוזים (50% להשתהות) ב 15 מ ל שפופרת ולהוסיף 10 מ ל של מאגר a ללא PMSF ו אנטי פרוטסים. מערבבים בקצרה ומסתובבים ב 2,500 g למשך 3 דקות ב -4 ° c, חוזרים על צעד זה פעמיים יותר ולשמור את החרוזים על הקרח.
  9. בעקבות הצנטריפוגה ליפוסט חיידקי, לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינורית חרוט 50 mL. לקחת סדרת מחלקים של 100 μl כולל הכולל ולהוסיף 100 μl של מאגר לדוגמה 2x laemmli עבור sds-עמוד וניתוח כחול coomassie.
  10. לסנן את lysate דרך 0.45 יקרומטר נקבוביות מזרק מסנן ולערבב אותו עם חרוזי gsh. מודלת ב 4 ° c עם טלטול עבור 5 h. לסובב את החרוזים ב 2,500 x g עבור 3 דקות, להסיר, ולשמור את supernatant כמו הזרימה דרך. שטוף את החרוזים מאוגד החלבונים-GSH 6 פעמים (5 מ ל כל אחד) עם מאגר A המכיל קוקטייל אנטי פרוטאז ו PMSF.
  11. לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את החרוזים יחד עם 10 מ ל של מאגר לתוך טור כרומטוגרפיה ריק, להוסיף 1.5 mL מאגר A המכיל 25 מ"מ גלוטתיון, ולאסוף את הימנעות על ידי הכבידה לתוך 1.5 mL מיקרוצינוריות. חזור על הליך הימנעות 4 פעמים.
    הערה: פתרון מלאי גלוטתיון מוכן בריכוז 200 מ"מ ב-50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  12. לקחת סדרת מחלקים של 10 μl מכל אחד 4 שעות ולהוסיף 10 μl של מאגר לדוגמה 2x laemmli. דגימות אלה ישמשו עבור SDS-PAGE ו Coomassie ניתוח כחול כדי לקבוע את הנוכחות ואת הטוהר של חלבונים מטוהרים.
    הערה: לאחר הימנעות האחרונה, לשמור את החרוזים במאגר ב 4 ° צ' למיחזור ושימוש עתידי.
  13. בחר את השברים הללו המראים כמויות סבירות של חלבונים מטוהרים לניתוח נוסף. בצע הכנה מועטה של ההכנה. אחסן את החלבונים הטהרה ב-80 ° c. בדרך כלל, ריכוז חלבונים יהיה נע בין 0.5 μg כדי 2 μg לכל μL ודגימות ניתן לאחסן במצב זה.
  14. אופציונלי: הרכז את המדגם או שנה את המאגר באמצעות יחידת סינון בגודל 10 קאראט

2. טיהור הBAP1/דאובאד (ASXL2) מתחם דאוביקווינואז

  1. השתמש ב-pET30a +-שלו-BAP138 והפוך-MBP-דאורע (ASXL2)35 ביטויים חיידקיים להפוך BL21 (DE3) בקטריה RIL לייצור שלו-BAP1 ו-mbp-דויטש בהתאמה.
  2. לבצע שתי תרבויות נפרדות לילה המתנע ידי דגירה שלו-BAP1 ו MBP-דוסי BAD (ASXL2) הבעת חיידקים 20 מ ל של ליברות ציר של אמפיצילין בינונית המכילה 50 Μg/mL כלוראמאנסול ואת האנטיביוטיקה המתאימה עבור כל פלסטלינה, 100 μg/ mL של kanamycin או 100 μg/mL של אמפיצילין בהתאמה. מניחים על שייקר ב 37 ° c.
  3. בצע את שלבים 1.3 – 1.6.
  4. השהה מחדש את כדורי החיידקים 25 מ ל של מאגר לפירוק קרח קר B (50 mM Tris pH 7.3, 500 mM הנאל, 3 מ"מ β-Mercaptoethanol, 0.2% טריטון X-100, 1 מ"מ PMSF ו-1/100 נגד פרוטאז קוקטייל). מערבבים כרכים שווים של שלו-BAP1 עם MBP-דוסי רע lysates ו-דגירה על הקרח עבור 15 דקות. Sonicate ולאחר מכן צנטריפוגה את ליפוסט כפי שצוין בפרוטוקול 1 (שלב 9).
    1. במהלך הצנטריפוגה, להכין 500 μL ארז בחרוזים Ni-נ. א. ז. (50% להשתהות) על ידי שטיפת אותם שלוש פעמים עם מאגר B ללא PMSF וקוקטייל אנטי פרוטאז.
  5. בעקבות הצנטריפוגה ליפוסט חיידקי, לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינורית חרוט 50 mL. לקחת סדרת מחלקים של 100 μl כולל הכולל ולהוסיף 100 μl של 2x laemmli מאגר לדוגמה עבור sds-עמוד וניתוח כחול coomassie.
  6. לסנן את ליפוסט דרך 0.45 יקרומטר מזרק הנקבוביות הפילטר ולערבב אותו עם חרוזי Ni-נ. א. ת. דגירה ב 4 ° c עם טלטול עבור 5 h. לסובב את החרוזים ב 2,500 x g עבור 3 דקות, להסיר, ולשמור את supernatant כמו הזרימה דרך.
    1. לשטוף את החרוזים 6 פעמים (5 מ ל כל אחד) עם מאגר B המכיל 20 מ"מ 1, 3-diaza-2, 4-ציקלופניטפן (סרזיאזול).
      הערה: הפוך את פתרון המניה של 2 מ ' סרפירון ב-pH 7.3.
  7. לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את החרוזים עם 10 מ ל של מאגר לתוך העמודה כרומטוגרפיה ריקה, להוסיף 1 mL מאגר B המכיל 200 מ"מ ולאסוף את הימנעות על ידי הכבידה לתוך 1.5 mL מיקרוצינורות המכילים 10 ΜL dtt (500 mm) ו-2 ΜL edta (500 mm , pH: 8). חזור על תהליך הימנעות 4 פעמים. לקחת 10 μL של כל שבר ולהוסיף 10 μL של מאגר לדוגמה 2x Laemmli עבור SDS-עמוד וניתוח כחול Coomassie. ברכת את השברים הרצויים.
    הערה: שמרו את החרוזים במאגר ב-4 ° צ' למיחזור ושימוש עתידי.
  8. לדלל את מורכבות שלוש פעמים עם מאגר C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM הנאקל, 1% טריטון X-100, 5 מ"מ DTT, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ PMSF, ו-1/100 מעכב פרוטאז הקוקטייל) לפני הדגירה עם חרוזים העלה.
    1. הכינו את החרוזים האלה (500 μL) על ידי שטיפת הידיים פעמיים עם מאגר C ללא הוספת PMSF וקוקטייל אנטי פרוטאז. להוסיף את החרוזים כדי הימנעות מדולל הדגירה לילה ב 4 ° c.
  9. צנטריפוגה ב 2,500 x g עבור 3 דקות ולשמור את הזרימה דרך. לשטוף את מחרוזות חלבונים בגבולות עם 5 מ ל של מאגר C (5 – 6x).
  10. לשמור על מטוהרים שלו-BAP1/MBP-דאוט מורכבות ב עמיל לאבד חרוזים במאגר D (50 MM Hepes pH 8.0, 50 מ"מ הנאל, 10% גליצרול, ו 1 מ"מ dtt) ולאחסן at-80 ° c. לקחת 20 μL של שבריר חרוזים (50% חרוזים פתרון) ולהוסיף 20 μL של מאגר לדוגמה 2x Laemmli עבור SDS-עמוד וניתוח כחול Coomassie.

3. טיהור הנוקלאוטיזומים מ HEK293T תאים

  1. תרבות HEK293T תאים בשנת מלאה בינונית הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 5% סרום עגל היילוד (NBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. לוחית סביב 12 x 106 HEK293T תאים ב 20 מ ל של מדיה שלמה לכל 15 ס מ התרבות יום אחד לפני הזיהום (10 מנות שימשו). לפני החצייה, לשנות את המדיום של התא ל 12 מ ל של מדיום ללא סרום ו transfection התאים עם 21 μg של pCDNA-דגל-H2A באמצעות 63 μl של פוליאתילן (פיי) ב 1 מ"ג/mL36. שנה להשלמת מדיום 12 שעות מאוחר יותר.
  3. שלושה ימים לאחר ההעברה, לשטוף את התאים עם 15 מ"ל קרח קר PBS (פעמיים) ו לקצור אותם 3 מ ל של הקרח קר PBS באמצעות מגרד התא. צנטריפוגה ב 2,100 x g עבור 8 דקות ב 4 ° c. להיפטר PBS ולהמשיך לשלב הליזה או להקפיא את הגלולה בתא-80 ° c.
  4. השהה מחדש את הגלולה בתוך כ 10 כרכים של מאגר E (50 mm טריס-HCl pH 7.3, 420 Mm הנאקל, 1% NP-40, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ pmsf, ב1/100 מעכבי הפרוטאז, ו 20 מ"מ של N-מתילממיד (NEM)) ו דגירה על קרח 20 דקות. N-מתילמלמיד (NEM) הוא קריטי לעכב DUBs כי לטהר עם נוקלאוטיזומים.
  5. לאחר צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות, למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה כרומטין ב 10 כרכים של מאגר E. Mix על ידי היפוך וצנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות.
    1. חזור על הצעד לשטוף בפעם אחרת באמצעות מאגר E ושתי פעמיים באמצעות מאגר F "mnase מאגר" (20 Mm טריס-HCl PH 7.5, 100 mm Kcl, 2 מ"מ mnase2, 1 מ"מ cacl2, 0.3 M סוכות, 0.1% NP-40, 1 מ"מ pmsf, ו-1/100 מעכבי פרוטאז קוקטייל).
      התראה: גלולה יהיה צף במהלך שוטף וצנטריפוגה.
  6. השהה מחדש את כרומטין ב 5 מ ל מאגר F ולטפל הגלולה עם מmicrococcal נוקלאז (mnase) (3 U/mL עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר).
    הערה: התגובה ניתן לסייע על ידי ערבוב באמצעות מכשיר הומוגנידצר.
  7. לאחר הדגירה, לקחת 40 μL ליטר של התערובת לניתוח של שברי דנ א נוקלאוזומבית. לערבב זה סדרת מחלקים עם 40 μl של פנול/כלורופורם ו 20 μl של מאגר העמסה 6x DNA, מערבולת, ספין ב 18,000 x g עבור 2 דקות, ולטעון את ה-DNA על 2% agarose ג'ל.
    1. כאשר ה-DNA הוא בעיקר קטע 147 bp המתאים מונוונואוזומים, לעצור את התגובה על ידי הוספת 5 מ"מ EDTA בריכוז הסופי.
  8. בעקבות 21,000 צנטריפוגה x g עבור 20 דקות ב 4 ° c, מודתיאת שבר כרומטין מסיסים עם שרף נגד דגל לילה ב 4 ° c. לשטוף את החרוזים עם מאגר 6x G (50 mm טריס-HCl, pH 7.3, 5 מ"מ edta, 150 Mm הנאקל, 1% NP-40, 1 מ"מ PMSF, 1 מ"מ dtt, 1/100 מעכבי הפרוטאז קוקטייל).
  9. להעביר את החרוזים עם 5 מ ל מאגר G לתוך טור כרומטוגרפיה ריק. אליוט החרוזים הקשורים לחרוזי מחרוזות עם 200 μg/mL של פפטיד הדגל. השתמש במאגר המורכב ממאגר G המכיל 200 Μg/ML הדגלים משחררים (ראה טבלת חומרים) ו 1/5 (vol: Vol) 1 M טריס, pH 8.0. אליוט הנוקלאוטיזומים 3x עם 260 μL דגל הימנעות מאגר (2 h כל הימנעות).
  10. בדוק את 3 הפרשות על ידי לקיחת סדרת מחלקים עבור החילוץ פנול-כלורופורם לטעון את ה-DNA ב 2% agarose ג'ל. לקחת 10 μL של כל שבר הפחתה ולהוסיף 10 μL של Laemmli לדוגמה מאגר 2x עבור SDS-עמוד וניתוח כחול Coomassie לטעון כל הימנעות עבור זיהוי כתמי מערביות של H2A. לאחסן את הימנעות ב-80 ° c. באופן כללי, טיהור מתאי האדם מניב פחות כמות של חלבונים מזו של חיידקים, עם ריכוזים החל מ 0.1 אל 0.5 μg/μL.

4. נוקלאוכמה אוביקלינציה באמצעות BMI1/RING1B E3 אוביקוויב מורכבות Ligase

  1. צנטריפוגה את נוקלאוטיזומים דרך הנקבוביות 10K 0.5 mL מסננים צנטריפוגליים כדי לשנות את המצע ממאגר להתחמק מאגר התגובה H (25 מ"מ טריס, pH 7.5; 10 מ"מ MgCl2, ו 5 מ"מ ATP). לחלופין, ניתן להשתמש בנוקלאוטיזומים הזמינים באופן מסחרי עבור המנה.
    הערה: שינוי הבולם המצע הפתרון כדי מאגר התגובה מבטיח משתנה ומונע עיכוב פוטנציאלי E3 ליגאז על ידי תרכובות נוכח בתערובת הדגל הימנעות.
  2. דגירה 1 μg של נוקלאוטיזומים בנפח הכולל של 40 μL של מאגר H. הוספת האנזים הפעלת ורוב (UBE1) (250 ng), ועוד (50 ng/μl) ו-E2 ורוב-אנזימים מבצובי (672 ng), ו-1 μg של BMI1/RING1B E3 מורכב ליגאז. מודדים את התגובה 3 h ב 37 ° c עם רעד מדי פעם.
    הערה: ניתן לנהל כמה בקרים במקביל, כולל השמטת, E1, E2, E3, ATP ו אוביקוויב. זה יבטיח את הספציפיות. לתגובת האוביקוויל
  3. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 40 μl של 2x laemmli לדוגמה מאגר ולנתח היסטון H2A K119 אוביקווינציה על ידי sds-עמוד ובלוק מערבי, על פי נהלים סטנדרטיים. השתמש גם נגד H2A או anti-H2A K119ub נוגדנים (ראה טבלת חומרים).

5. מחוץ לגופית נוקלאוטיזומH2A דאב שימוש בBAP1/דאובאד

  1. השתמש בנוקלאוטיזומים הטהור. לצורך השימוש במבחנה השהה מחדש 100 – 500 ng של נוקלאוטיזומים ב-40 μL מאגר I (50 mm טריס-HCl, pH 7.3, 1 מ"מ MgCl2, 50 מ"מ ו-1 מ"מ dtt). להוסיף 1 μg של BAP1 חיידקים מטוהרים שלו-BAP1 ו-MBP-דאובאד. בצע את תגובת הדאויטיות במשך 3 שעות ב 37 ° c עם טלטול מדי פעם.
  2. להפסיק את תגובת מבחנה על ידי הוספת 40 μL של מאגר 2x Laemmli ולנתח על ידי החיסונית.

תוצאות

GT-BMI1 וחלבונים RING1B מיוצרים היטב בחיידקים ניתן לחלץ בקלות בשבר מסיסים. איור 1A מראה כתמים כחולים coomassie עבור טיהור אופייני של מתחם GT-BMI1-RING1B. GT-BMI1 ו RING1B הלהקות להגר במשקל מולקולרי צפוי, ~ 45 kDa ו ~ 13 kDa בהתאמה. בעיקר מורכבות E3 ליגאז הוא הומוגנית מאוד עם רמות נמוכות מא?...

Discussion

ישנם מספר יתרונות של יצירת עמידות בפני מבחנה אוביקוויטיות ומוסר דאוביסטי לחלבונים של עניין. מאמר זה יכול לשמש ל: (i) לבסס תנאים אופטימליים ולהגדיר דרישה מינימלית לתגובות אלה, (ii) לקבוע הקבועים אנזימטית וביוכימיים (iii) להגדיר את התפקידים של קופנים או מעכבי שיכולים להשפיע על תגובות אלה, (iv) זיה?...

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לדיאנה אדז'נו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (2015-2020), הגנום קוויבק (2016-2019) ו הגנום קנדה (2016-2019) כדי E.B.A. E.B.A. הוא מלומד בכיר של כפות דה לה Recherche du קוויבק-סנטרה (FRQ-S). ל-L. M ו-N.S.K. יש מלגת דוקטורט מ-FRQ-S. ה. ב. הייתה מלגת דוקטורט מהמשרד להשכלה גבוהה וממחקר מדעי של תוניסיה וקרן קול.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amylose agarose beadsNew England Biolabs#E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10KSigma-Aldrich#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)Cell Signaling Technology#8240
Anti-Flag-agarose beadsSigma-Aldrich#A4596
Anti-protease cocktailSigma-Aldrich#P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteriaAgilent technologies#230240
DMEMWisent#319-005-CL
Empty chromatography columnBiorad#731-1550
Flag peptideSigma-Aldrich#F3290
GSH-agarose beadsSigma-Aldrich#G4510
HEK293TATCC#CRL-3216
ImidazoleSigma-Aldrich#I5513
Micrococcal nuclease (MNase)Sigma-Aldrich#N3755
Ni-NTA agarose beadsThermoFisher Scientific#88221
N-methylmaleimide (NEM)Bioshop#ETM222
Pore syringe filter 0.45 μmSarstedt#83.1826
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)Addgene#63139
Ub Activating Enzyme (UBE1)Boston Biochem#E-305
UBCH5C (UBE2D3)Boston Biochem#E2-627

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149E3 ligasePRC1PRBAP1ASXLBMI1RING1BH2A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved