核糖体组蛋白的体外泛化和二次基质测定

摘要

泛化是一种翻译后修饰,在细胞过程中起着重要作用,并且通过二足化进行紧密协调。两种反应的缺陷是人体疾病的基础。我们提供使用纯化成分在体外进行泛化和二次脱体反应的协议。

摘要

泛化是一种翻译后修饰,在各种信号通路中起着重要作用,并特别参与染色质功能和DNA相关过程的协调。这种修饰涉及几种酶的连续作用,包括E1泛基质激活、E2泛基丁结合和E3泛基质-结合酶,由二苯基苯甲醚逆转。泛化诱导蛋白质降解或蛋白质功能改变,包括酶活性调节、蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞定位。证明蛋白质泛化或二丁基化的关键步骤是使用纯化成分进行体外反应。有效的泛化和二次成位反应可能受到所使用的不同成分、酶共因子、缓冲条件和基质性质的影响。 在这里,我们提供用于进行泛化和二分化反应的分步协议。我们使用小鼠聚孔抑制复合物1(PRC1)、BMI1和RING1B(一种E3泛基质结合酶)的最小成分来说明这些反应,这种酶在119上具有单体蛋白H2A的一元组蛋白H2A。核糖体H2A的二次分体化是使用由人类二苯基辛酶BAP1和DEUbiquitinase ADaptor(DEUBAD)共同因子ASXL2的最小聚氨酯抑制双基酶(PR-DUB)复合物进行的。这些泛化/二氧化化测定可以在重组核小体与细菌纯化蛋白质重组或从哺乳动物细胞中纯化的原生核小体进行。我们强调能够对这些反应产生重大影响的复杂性,我们建议这些协议的一般原则可以迅速适应其他E3泛基苯丙酸酶和二苯基酶。

引言

泛化是最保守的翻译后修饰之一,对包括酵母、植物和脊椎动物在内的各种生物体至关重要。泛化包括泛黄蛋白的共价附着,一种高度保守的76个氨基酸多肽,以靶向蛋白质,并发生在三个连续步骤中,涉及三种酶,即E1-激活、E2-结合和E3联苯1, ^2,3.这种翻译后修饰在广泛的生物过程中起着核心作用。事实上,提供反应特异性的E3利气,构成一个超级酶系,是泛性酶系统4、5、6中最丰富的酶。蛋白质泛化的下游影响取决于修饰的性质:单体化、多单体化以及线性或分枝多聚体化。单体基质化很少与蛋白酶体降解相关,但这种修饰涉及调解各种信号事件。多聚体化涉及泛基体分子本身中的N-端或赖塞林残留物,而多聚基蛋白的命运取决于泛化蛋白链延伸中涉及的残留物。人们早就知道,由流酶48的泛性基质介导的多聚体化诱导蛋白酶降解。相反,通过无物的以酶63进行多聚体化通常与蛋白质活化7、8、9相关。与其他重要的转化后修饰类似,泛化是可逆的,从蛋白质中去除泛化物通过称为二苯基苯酶(DUBs)的特定蛋白酶得到保证,这些蛋白酶已成为细胞过程的重要调节器^2,10.重要的是,许多DUB是高度专业化的,并通过二次基质调节特定的基质,表明在泛化与二苯基化之间的良好平衡对蛋白质功能至关重要。E3s 和 DUB,以及蛋白酶体降解机制和附件因素,形成泛素蛋白酶体系统(UPS,具有 >1200 基因),用于调节主要信号通路,其中几个与细胞生长和增殖相关,细胞命运决定、分化、细胞迁移和细胞死亡。重要的是,放松管制的几个信号级联涉及泛化促进肿瘤发生和神经退化疾病^{5,11,12,13,14}.

泛化在染色质生物学和DNA依赖过程15、16、17中起着普遍作用。例如,在以酶119(下文H2A K119ub)上单体化H2A是一种关键的转化后修饰,涉及转录抑制和DNA修复18、19、20 ^21,22.H2A K119ub 由 Polycomb 抑制复合体 1 (PRC1) 催化,在维护表观遗传信息方面发挥着关键作用,并且高度保存从果蝇到人类。规范PRC1是由RING1B和BMI1组成,它们是负责上述泛化^{事件22、23}的核心E3泛基体。在果蝇中,H2A单体素(H2A K118ub,对应于哺乳动物中的H2A K119ub)由DUB Calypso逆转,它与附加性梳子(ASX)相互作用,形成聚氨酯抑制DUB(PR-DUB)复合^体24。calypso的哺乳动物矫形原,BAP1,是一种肿瘤抑制器,在各种人类恶性肿瘤中被删除或灭活,^{25,26,27,28, 29,30,31,32,33}. BAP1调节细胞核中的DNA依赖过程和内质性细胞凋亡33、34、35、36^{37,38,39,40,41,42}. BAP1组装了多亚单位蛋白复合物,其中含有转录调节剂,特别是ASXL1、ASXL2和ASXL3(ASXLs),ASX^38,43的三个正交。ASXL 使用 DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) 域(也称为 ASXM 域)来刺激 BAP1DUB 活动 35、36、44 。因此,ASXL在协调染色质的BAP1 DUB活性和更广泛的肿瘤抑制功能方面发挥着重要作用。

存在几种研究泛化和二分化过程的方法。值得注意的是,使用从细菌中纯化的蛋白质进行生物化学检测在证明特定基质直接普及或去除泛化物方面仍然非常强大。这些实验可以进行,以调查一系列参数,如确定最小复合物的要求,确定反应动力学,定义结构/功能关系,以及了解病理的影响基因突变。在这里,我们提供协议,在染色质基质基材上进行泛化和二甲化反应,具有纯化成分。作为一种模型系统,提出了核糖体H2A蛋白的体外泛化和二次体化。以RING1B/BMI1和BAP1/DEUBAD的最小复合物组装的细菌纯化蛋白分别用于核细胞H2A的泛化或二聚位化。

研究方案

1. GSH-agarose 亲和力纯化 GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 泛基丁利加酶复合物

1. 使用 pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) 细菌表达结构来转化 BL21 (DE3) 细菌 (参见材料表)²³。此构造允许将鼠圈 1B 域 1-159 融合到 BMI1 域 1-109,并在 pGEX-6P-2 主干中带有 GST 标记。
2. 通过在存在 100 μg/mL 阿霉素和 50 μg/mL 氯霉素的情况下,在 20 mL 的 LB 溴介质中接种表达 GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109 aa) 的 RIL 细菌,执行隔夜启动培养。在37°C过夜时通过摇动孵育。第二天,将起动机培养剂加入含有500 mL新鲜LB肉汤介质(1/26稀释)的1L烧瓶中,并在37°C下在摇床中孵育培养2至4小时。
3. 在孵育期间,使用分光光度计测量 600 nm 的 OD。当细菌培养在 600 nm 时达到 0.6 OD 单位时,以 1.5 mL 管中的 1 mL 等分作为非诱导样品。在1L培养物中加入400μM的约丙基β-D-1-硫丙酮(IPTG),以诱导蛋白质表达。在25°C孵育细菌6小时至过夜。
   1. 在 14,000 x g 下将 1 mL 等分分在 14,000 x g下离心 30 s,丢弃上清液,在 200 μL 的 Laemmli 样品缓冲液中重新悬浮颗粒,并保留用于 SDS-PAGE 和 Coomassie 蛋白诱导的蓝色分析。
4. 将诱导细菌培养从烧瓶转移到干净的离心瓶中,在 3,500 x g下旋转 15 分钟,在 4°C 下。丢弃上清液,用40 mL的冷PBS重新悬浮颗粒,在3,500 x g下旋转15分钟,在4°C下。
5. 丢弃上清液,将颗粒冻结在-80°C或继续下一步。如果蛋白质在预期的分子量下诱导,则继续下一步。
6. 在25 mL的冷赖液缓冲液A(50 mM Tris-HCl pH 7.5) 中重新悬浮细菌颗粒, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 和 1/100 抗蛋白酶鸡尾酒,含有 AEBSF、 阿丙汀、 Bestatin、 E-64、Leupeptin 和 Pepstatin A)。确保所有细菌颗粒已重新悬浮。PMSF 和抗蛋白酶鸡尾酒必须新鲜添加到裂解缓冲液中,仅在细菌裂解时。
   警告:始终将样品保存在冰上。
   注:可添加100μg/mL的酶酶,以增强细菌分光。
7. 在冰上孵育细菌解毒15分钟。使用探针声波器,以70%的输出振幅为30s(4-5x),然后在21,000 x g下在4°C下离心20分钟。
   警告:在声波过程中,将样品始终保持在冰上。
8. 在离心期间,在15 mL管中加入500μL包装的GSH-agarose珠子(50%泥浆),并在无PMSF和抗蛋白酶的情况下加入10 mL的缓冲A。在 4°C 下短暂混合,在 2,500 g 下旋转 3 分钟,重复此洗涤步骤两次,并将珠子保持在冰上。
9. 细菌落水离心后,收集上清液并将其转移到50 mL锥形管中。以100μL的等分作为总液沙,并添加100μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。
10. 通过 0.45 μm 孔注射器过滤器过滤掉的赖沙溶液,并将其与 GSH 珠子混合。在4°C下孵育,摇动5小时。在2,500 x g下旋转珠子3分钟,取出并保存上清液。用含有抗蛋白酶鸡尾酒和PMSF的缓冲剂A洗洗6次蛋白-GSH结合珠(每个5 mL)。
11. 上次洗涤后,将珠子连同10 mL的缓冲液转移到空色谱柱中,加入含有25 mM谷胱甘肽的1.5 mL缓冲液A,并通过重力收集洗脱到1.5 mL微管中。重复洗脱过程 4 次。
    注:谷胱甘肽库存溶液在50 mM Tris-HCl,pH 7.5中以200mM浓度制备
12. 从4个洗液中各取10μL的等分,并加入10μL的2x莱姆利样品缓冲液。这些样品将用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析,以确定纯化蛋白质的存在和纯度。
    注:在最后一次洗脱后,将缓冲液中的珠子保持在4°C,以便回收和将来使用。
13. 选择显示合理量纯化蛋白质的洗脱分数,以便进一步分析。做一些小的等分的准备。将纯化蛋白质储存在-80°C中。通常,蛋白质浓度为每μL0.5μg至2μg,样品可储存在这种状态下。
14. 可选:使用 10K 离心滤波器单元浓缩样品或更换缓冲液

2. BAP1/DEUBAD (ASXL2) 二苯基苯甲酶复合物的纯化

1. 使用 pET30a®-His-BAP1³⁸和 pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)³⁵细菌表达结构,分别转换 BL21 (DE3) RIL 细菌,用于生产 His-BAP1 和 MBP-DEUBAD。
2. 通过孵育 He-BAP1 和 MBP-DEUBAD (ASXL2) 在含有 50 μg/mL 氯霉素的 LB 溴和每种质粒的相应抗生素的 LB 溴中表达细菌,执行两种单独的隔夜启动培养物分别为卡那霉素的mL或100μg/mL的阿霉素。置于 37°C 的摇床上。
3. 执行步骤 1.3_1.6。
4. 在25 mL的冷裂解缓冲液B(50 mM Tris pH 7.3, 500 mM NaCl, 3m β-Mercaptoto乙醇, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF 和 1/100 抗蛋白酶鸡尾酒) 中重新悬浮细菌颗粒。将His-BAP1的等量与MBP-DEUBAD解毒混合,在冰上孵育15分钟。 Sonicate,然后按照协议1(步骤9)所示将莱沙发生离心机。
   1. 在离心过程中,用缓冲B洗涤三次,无需PMSF和抗蛋白酶鸡尾酒,制备500μL包装的Ni-NTA抗糖珠(50%浆料)。
5. 细菌落水离心后,收集上清液并将其转移到50 mL锥形管中。以100μL的等分作为总液沙,并添加100μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。
6. 通过 0.45 μm 孔隙注射器过滤器过滤掉的赖沙溶液,并将其与 Ni-NTA 珠子混合。在 4°C 下孵育,摇动 5 小时,在 2,500 x g下旋转珠子 3 分钟,取出并保存上清液。
   1. 用含有 20 mM 1,3-Diaza-2,4-环丙二苯胺(Imidazole)的缓冲液 B清洗珠子 6 次(每个 5 mL)。
      注:在pH 7.3下制作2M imidazole的库存溶液。
7. 上次洗涤后,将具有 10 mL 缓冲液的珠子转移到空色谱柱中,加入含有 200 mM Imidazole 的 1 mL缓冲液B,并通过重力收集洗脱到包含 10 μL DTT (500 mM) 和 2 μL EDTA (500 mM) 的 1.5 mL 微管中,pH:8).重复洗脱程序4次。取每个洗脱分数的10μL,并添加10μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。汇集所需的洗脱分数。
   注:将珠子保存在4°C的缓冲液中,以便回收和将来使用。
8. 在用缓冲液C(50 mM Tris pH 7.3,300 mM NaCl、1% Triton X-100、5 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)孵育之前,用缓冲液 C(50 mM Tris pH 7.3、300 mM NaCl、1% Triton X-100、5 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)稀释洗脱复合物。
   1. 用缓冲液C洗涤2次,无需添加PMSF和抗蛋白酶鸡尾酒,即可制备糖糖糖珠(500μL包装)。将珠子加入稀释的洗脱中,在4°C下孵育过夜。
9. 在 2,500 x g下离心 3 分钟,并保持流量。用5 mL的缓冲C(5~6x)清洗蛋白质边界珠子。
10. 在缓冲D(50mM HEPES pH 8.0、50 mM NaCl、10%甘油和1 mM DTT)的糖角糖珠子上保持纯化的He-BAP1/MBP-DEUBAD复合物,并储存在-80°C。 取20μL的珠子分数(50%珠溶液),并添加20μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。

3. 从HEK293T细胞中纯化核小体

1. 培养HEK293T细胞在完整的Dulbeco的改性鹰的培养基(DMEM)补充5%新生小牛血清(NBS),2mM L-谷氨酰胺,和1%青霉素/链霉素。
2. 在转染前一天,在每15厘米培养皿中,在20 mL的完整介质中,将12 x 10⁶ HEK293T细胞盘在板(10个菜)。在转染前,将细胞的培养基更改为12 mL的无血清培养基,用63μl的聚乙烯胺(PEI)在1mg/mL³⁶下转染21μg的pCDNA-Flag-H2A细胞。更改为 12 小时后完成中等。
3. 转染后三天,用15mL冰冷的PBS(两次)清洗细胞,并用细胞刮刀在3mL的冰冷PBS中收获。在 2,100 x g下在 4°C 下离心 8 分钟。丢弃 PBS 并进入莱沙步骤或将细胞颗粒冻结在 -80°C。
4. 将细胞颗粒悬浮在大约10卷缓冲E(50 mM Tris-HCl pH 7.3,420 mM NaCl,1%NP-40,1 mM MgCl_2,1mMPMSF,1/100蛋白酶抑制剂鸡尾酒和20 mM N-甲基马列米德(NEM)中,并在冰上孵育20分钟。 N-甲基溴酰胺(NEM)对于抑制与核小体共同纯化的DUB至关重要。
5. 在3,000 x g离心5分钟后,丢弃上清液,将染色质颗粒重新悬浮在10卷缓冲液E.通过反转混合,在3,000 x g下离心5分钟。
   1. 使用缓冲液 E再次重复洗涤步骤,两次使用缓冲液F"MNase 缓冲液"(20 mM Tris-HCl pH 7.5,100 mM KCl,2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.3 M 蔗糖, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
      注意:小球在进行处理和离心时会漂浮。
6. 将染色质重新悬浮在 5 mL缓冲液 F中,用微球菌核酸酶 (MNase) 处理颗粒(3 U/mL,在室温下 10 分钟)。
   注:使用大数质器混合可辅助反应。
7. 孵育后,服用40μL等分的混合物,用于核体DNA片段的分析。将此等分与 40 μL 的苯酚/氯仿和 20 μL 的 6x DNA 加载缓冲液、涡旋、在 18,000 x g下旋转 2 分钟,并将 DNA 加载到 2% 的 agarose 凝胶上。
   1. 当DNA主要是一个147bp片段对应于单核糖体,停止反应,在最终浓度时加入5mM EDTA。
8. 在21,000 x g下离心20分钟后,在4°C下,用抗旗树脂孵育可溶性染色质部分,在4°C下孵育。用 6x缓冲液G(50 mM Tris-HCl、pH 7.3、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% NP-40、1 mM PMSF、1 mM DTT、1/100蛋白酶抑制剂鸡尾酒)清洗珠子。
9. 将带 5 mL缓冲液 G的珠子转移到空色谱柱中。用200μg/mL的旗洗脱肽洗脱珠约束核小体。使用由含有200μg/mL标志洗脱肽(见材料表)和1/5(vol:vol)1 M Tris,pH 8.0的缓冲液组成的洗脱缓冲液。使用 260 μL 标志洗脱缓冲液(每个洗脱 2 小时)将核小体 3 倍洗脱。
10. 通过使用等分法提取苯酚氯仿,测试3个洗脱液,并将DNA加载到2%的甘蔗糖凝胶中。取每个洗脱分数的10μL,加入10μL的Laemmli样品缓冲液2x用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析,并加载每个洗脱物,用于西带化H2A检测。将洗脱储存在-80°C。一般来说,从人体细胞中纯化产生的蛋白质量少于细菌的蛋白质含量,其浓度范围为0.1至0.5微克/μL。

4. 使用BMI1/RING1B E3泛素利加酶复合物进行核糖体泛素测定

1. 通过 10K 孔隙 0.5 ml 离心滤波器将核小体离心,将基板从洗脱液液液转移到反应缓冲液H(25 mM Tris,pH 7.5;10 mM MgCl₂和 5 mM ATP)。或者,市售的核小体可用于测定。
   注:将基板悬浮液更改为反应缓冲液可确保可重复性,并防止旗洗脱混合物中存在的化合物对潜在的E3结合抑制。
2. 在40μL的缓冲液H总体积中孵育1μg的核小体。加入 Ub 激活酶 (UBE1) (250 ng)、Ub (50 ng/μL) 和 E2 Ub-结合酶 (672 ng) 和 1 μg BMI1/RING1B E3 泛基辛结合酶复合物。在37°C下孵育反应3小时,偶尔摇动。
   注:多个控制可以并行进行,包括省略、E1、E2、E3、ATP 和泛基丁。这确保了泛化反应的特异性。
3. 根据标准程序,通过加入40 μL的2xLammli样品缓冲液,通过SDS-PAGE和西印分析组蛋白H2A K119的泛化,从而停止反应。使用抗H2A或抗H2A K119ub抗体(见材料表)。

5. 使用 BAP1/DEUBAD 的体外核体内核体 H2A DUB 测定

1. 使用纯化核小体进行体外二核素测定。在 40 μL缓冲液I(50 mM Tris-HCl、pH 7.3、1 mM MgCl 2、50mM NaCl 和 1 mM DTT)中重新悬浮 100-500 ng 的核小体。加入1μg的BAP1细菌纯化His-BAP1和MBP-DEUBAD。在37°C下进行3小时双基反应,偶尔摇动。
2. 通过加入40μL的2x莱姆利缓冲液,停止体外反应,并通过免疫凝固进行分析。

结果

GST-BMI1和RING1B蛋白在细菌中生产良好,可轻易提取为可溶性成分。图 1A显示了用于典型纯化 GST-BMI1-RING1B 复合物的 Coomassie 蓝色染色。GST-BMI1 和 RING1B 波段以预期的分子量迁移,分别为 ±45 kDa 和 +13 kDa。值得注意的是,E3连带复合物高度均匀,细菌蛋白污染物和/或降解产物水平极低。此外,纯化复合物的化学测量是最佳的,因为当摩尔比为1:1时,GST-RING1B蛋白的带...

讨论

建立健壮的体外泛化和二次成体测定对感兴趣的蛋白质有几个优点。这些测定可用于:(i) 建立最佳条件并定义这些反应的最低要求,(ii) 确定酶动力学和生化常数,(iii) 定义可能影响这些反应的辅助因子或抑制剂的作用,(iv)识别相互作用界面,(v) 测试人工或疾病相关突变的影响,(vi) 建立可进一步用于开发高通量化学筛选检测的测定条件。在这里,我们通过描述我们如何在核体基板上执行BMI1/RING1B介导的H2A...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylose agarose beads	New England Biolabs	#E8021
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K	Sigma-Aldrich	#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)	Cell Signaling Technology	#8240
Anti-Flag-agarose beads	Sigma-Aldrich	#A4596
Anti-protease cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria	Agilent technologies	#230240
DMEM	Wisent	#319-005-CL
Empty chromatography column	Biorad	#731-1550
Flag peptide	Sigma-Aldrich	#F3290
GSH-agarose beads	Sigma-Aldrich	#G4510
HEK293T	ATCC	#CRL-3216
Imidazole	Sigma-Aldrich	#I5513
Micrococcal nuclease (MNase)	Sigma-Aldrich	#N3755
Ni-NTA agarose beads	ThermoFisher Scientific	#88221
N-methylmaleimide (NEM)	Bioshop	#ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm	Sarstedt	#83.1826
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences Inc	#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)	Addgene	#63139
Ub Activating Enzyme (UBE1)	Boston Biochem	#E-305
UBCH5C (UBE2D3)	Boston Biochem	#E2-627