Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Özet

Ubiquitination çeşitli sinyalizasyon yolları önemli roller oynar ve özellikle kromatin fonksiyon ve DNA ilişkili süreçlerin koordinasyonunda yer alan bir post-translational modifikasyonudur. Bu modifikasyon E1 Ubiquitin-aktive, E2 Ubiquitin-konjugating ve E3 Ubiquitin-ligaz dahil olmak üzere çeşitli enzimlerin sıralı bir eylem içerir ve deubiquitinases (DUBs) tarafından tersine çevrilir. Ubiquitination proteinlerin bozulması veya enzimatik aktivite, protein-protein etkileşimi ve hücre altı lokalizasyonu modülasyonu dahil protein işlevinin değiştirilmesi indükler. Protein mayası veya deubiquitination gösteren kritik bir adım, arıtılmış bileşenlerle in vitro reaksiyonlar gerçekleştirmek için. Etkili mayası ve deubiquitination reaksiyonlar büyük ölçüde kullanılan farklı bileşenler tarafından etkilenebilir, enzim Co-faktörleri, tampon koşulları, ve substrat doğası.  Burada, biz mayası ve deubiquitination reaksiyonlar yürütmek için adım adım protokoller sağlar. Biz fare polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1), BMI1 ve RING1B, lizin 119 üzerinde histon H2A monoubiquitinates bir E3 Ubiquitin ligaz en az bileşenleri kullanarak bu reaksiyonlar göstermektedir. Nükliosomal H2A deubiquitination, insan deubiquitinase BAP1 ve DEUBiquitinase adaptörü (DEUBAD) tarafından oluşturulan minimal Polycomb baskıcı Deubiquitinase (PR-DUB) kompleksi kullanılarak gerçekleştirilir, onun co-Factor ASXL2 alan. Bu ubiquitination/deubiquitination kuralları bakteriler-arıtılmış proteinler veya memeliler hücrelerinden arındırılmış yerli nükreosomlar ile yeniden rekombinant nüklisomes bağlamında yapılabilir. Bu reaksiyonlar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilecek inceliklerini vurgulıyoruz ve bu protokollerin genel prensiplerinin diğer E3 Ubiquitin ligazları ve deubiquitinases 'e hızlı bir şekilde uyarlanabilir olduğunu öneriyoruz.

Giriş

Ubiquitination en çok kayıtlı post-translational değişikliklerden biridir ve Maya, bitkiler ve omurgalı gibi organizmaların geniş bir yelpazede için önemlidir. Ubiquitination Ubiquitin kovalent eki oluşur, bir son derece koruma 76 amino asit polipeptide, proteinleri hedef ve üç sıralı adımda 3 enzim içeren oluşur, yani, E1-aktive, E2-konjugating ve E3 ligaz1, 2,3. Bu post-translational modifikasyon biyolojik süreçlerin geniş bir spektrumunda merkezi roller oynar. Gerçekten de, reaksiyon özgüllüğü sağlayan E3 Ligas, enzimlerin büyük bir süper ailesi oluşturur ve Ubiquitin sisteminin en bol enzimleri vardır4,5,6. Protein mayası aşağı akım etkileri modifikasyon doğası bağlıdır: monoubiquitination, Multi-monoubiquitination, ve doğrusal veya dallanmış polyubiquitination. Monoubiquitination nadiren proteasomal bozulması ile ilişkilidir, ancak bunun yerine bu değişiklik çeşitli sinyalizasyon olaylarını aracılık yer almaktadır. Polyubiquitination, N-terminali veya Ubiquitin molekülü içinde lizin kalıntıları içerir ve polyubiquitinated protein kaderi hangi kalıntı Ubiquitin zincir uzatma dahil bağlıdır. Uzun süre, Ubiquitin lizin 48 tarafından aracılı polyubiquitination proteasomal bozulması indükler bilinmektedir. Aksine, Ubiquitin lizin 63 ile polyubiquitination genellikle protein aktivasyonu ile ilişkilidir7,8,9. Diğer önemli post-translational değişikliklere benzer şekilde, mayası geri dönüşümlü ve proteinlerden Ubiquitin kaldırılması, hücresel süreçlerin önemli regülatörleri olarak ortaya çıkan deubiquitinases (Dubs) olarak adlandırılan spesifik proteinler tarafından sağlanır 2 , 10. önemlisi, birçok Dubs son derece uzmanlaşmıştır ve düzenleyen, deubiquitination yoluyla, belirli substratlar, mayası ve deubiquitination arasında ince bir denge protein fonksiyonu için kritik olduğunu gösteren. E3s ve Dubs, proteasom bozulma makine ve aksesuar faktörleri ile birlikte, birçok hücre büyümesi ve proliferasyon ile ilişkili olan büyük sinyal yolları düzenleyen Ubiquitin proteozom sistemi (UPS, > 1200 genler ile) formu, hücre kaderi belirlenmesi, farklılaşma, hücre göçü ve hücre ölümü. Önemlisi, mayası içeren çeşitli sinyalizasyon Cascades deregülasyon tümörijenezde ve Nörodejenerasyon hastalıkları teşvik5,11,12,13, 14oldu.

Ubiquitination kromatin biyoloji ve DNA bağımlı süreçlerde yaygın roller oynar15,16,17. Örneğin, lizin 119 (bundan sonra H2A K119ub) histon H2A monoubiquitination transkripsiyon baskı ve DNA onarım dahil kritik bir post-translasyonel modifikasyonudur18,19,20, 21,22. H2A K119ub, epigenetik bilgilerinin bakımını önemli bir rol oynayan ve Drosophila 'dan insana son derece muhafaza edilen Polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1) tarafından katalizlenir. Canonical PRC1 özellikle RING1B ve BMI1, yukarıda belirtilen mayası olay22,23sorumlu çekirdek E3 Ubiquitin ligaz kompleksi tarafından oluşturulur. Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K119ub mammalians KARŞıLıK gelen H2A K118UB) Dub Calypso tarafından tersine, hangi ek seks tarak ile etkileşim (ASX) polycomb-BASKıCı Dub (PR-Dub) kompleksi oluşturan24. Calypso, BAP1, memeli ortoloğundan bir tümör bastırıcı silinmiş veya çeşitli insan malignite içinde inaktive olduğunu25,26,27,28, 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33. BAP1, endoplazmik retikulum33,34,35,36, çekirdek ve kalsiyum sinyalizasyon-aracılı apoptoz DNA bağımlı süreçleri düzenler 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1, özellikle ASXL1, ASXL2 ve ASXL3 (asxls), asx38,43üç ortolog transkripsiyon regülatörleri içeren Multi-subunit protein kompleksler birleştirir. Asxls deubiquitinase adaptörü (Deubad) etki alanı, ayrıca asxm etki alanı, BAP1 Dub aktivite35,36,44uyarmak için kullanın. Bu nedenle, asxls kromatin ve daha geniş tümör bastırıcı fonksiyonu BAP1 Dub aktivite koordine önemli roller oynar.

Çeşitli yöntemler, her yerde ve deubiquitination süreçleri incelemek için mevcut. Özellikle, bakterilerden arındırılmış proteinlerin kullanıldığı biyokimyasal maddeler, belirli substratlar ile doğrudan Ubiquitin veya çıkarılması ile ilgili olarak çok güçlü kalır. Bu deneyler, minimal kompleksleri ihtiyacını belirleme, reaksiyonlar kinetiği belirleme, yapı/fonksiyon ilişkilerini tanımlama ve patolojik etkisinin anlaşılması gibi bir dizi parametreyi araştırmak için yapılabilir. gen mutasyonları. Burada, saflaştırılmış bileşenlerle kromatin substratlar üzerinde her yerde ve deubiquitination reaksiyonları yapmak için protokoller sağlıyoruz. Bir model sistemi olarak, In vitro mayası ve nükliosomal H2A protein deubiquitination sunulmaktadır. RING1B/BMI1 ve BAP1/Deubad minimal kompleksleri içinde toplanan bakteriler-saflaştırılmış proteinler sırasıyla nükmonozomal H2A mayası veya deubiquitination için kullanılır.

Protokol

1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin ligaz kompleksi GSH-agarose yakınlık arıtma

  1. PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakteri ifadesi oluşturmak BL21 (DE3) bakterileri (bkz. malzeme tablosu)23dönüştürmek için kullanın. Bu yapı, pgex-6p-2 omurgasında GST etiketiyle BMI1 etki alanı 1-109 için erimiş RING1B etki alanı 1-159 murine ifadesi sağlar.
  2. 100 μg/ml ampisilin ve 50 μg/ml chloramphenicol varlığı içinde 20 ml lb suyu Orta içinde GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) ifade eden RIS-bakterilerin Birmanya tarafından bir gecede marş kültürü gerçekleştirin. 37 °C ' de bir gecede sallayarak kulyur. Ertesi gün, 1 L Flask için Starter kültürü ekleyin 500 mL taze LB suyu Orta (1/26 seyreltme) ile ampisilin ve, 2 ila 4 h için 37 °C ' de Shaker kültür inküye.
  3. Kuluçka süresi boyunca, bir Spektrofotometre ile 600 Nm 'de OD ölçmek. Ne zaman bakteri kültürü ulaşır 0,6 od birimleri 600 Nm, bir 1 ml Kısım 1, 5 ml tüp olarak non-indüklenmiş örnek. Protein ifadesini teşvik etmek için 1 L kültürüne 400 μM Isopropresl β-D-1-thiogalactopyranoside (ıPTG) ekleyin. Bakterileri 25 °C ' de 6 saat için geceleyin.
    1. 30 s için 14.000 x g at 1 ml plakaya Santrifüjü, supernatant atın, nemmli numune tampon 200 μL içinde Pelet pelletini, ve SDS-sayfa ve Coomassie mavi analiz protein indüksiyon için tutun.
  4. İndüklenen bakteri kültürünü Flask 'dan temiz bir santrifüjleme şişesine aktarın ve 3.500 x g 'de 4 °c ' de 15 dakika aşağı döndürün. Süpernatant atın ve 40 ml soğuk PBS ile Pelet pelletini ve 4 °c ' de 15 dakika için 3.500 x g aşağı spin.
  5. Süpernatant atın ve-80 °c ' de Pelet dondurmak veya bir sonraki adıma geçin. Proteinler beklenen moleküler ağırlıkta indüklenmiş ise, bir sonraki adıma geçin.
  6. Buz-soğuk lizis Tampon A (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 25 ml bakteri Pelet resuspend, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40 mm pmsf, 0,5 mm DTT, ve 1/100 anti-proteaz kokteyl içeren AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, ve pepstatin A). Tüm bakteri Pelet resuspended emin olun. PMSF ve anti-proteaz kokteyli, sadece bakteri lizisi sırasında lizis tampona taze olarak eklenmelidir.
    Dikkat: Numuneyi her zaman buzda tutun.
    Not: 100 μg/mL 'de lysozyme bakteriler liziz geliştirmek için eklenebilir.
  7. 15 dakika boyunca buzda lysate bakterileri kuluçk. bir prob sonicator kullanın ve 30 s (4 – 5x) için 70% çıkış amplitüd de sonikat ve sonra 4 °C ' de 20 dakika için 21.000 x g Santrifüjü.
    Dikkat: Sonication sırasında, her zaman buz üzerinde örnekleri tutun.
  8. Santrifüjleme sırasında, 15 mL 'Lik bir tüpte 500 μL paketlenmiş GSH-agarose boncuk (% 50 Bulamaç) alın ve PMSF ve anti-proteazlar olmadan 10 mL Tampon a ekleyin. Mix kısaca ve 4 °C ' de 3 dakika 2.500 g spin, bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve buz üzerinde boncuk tutmak.
  9. Bakteriyel lysate santrifüjleme sonrasında, süpernatant toplamak ve bir 50 ml konik tüp içine aktarmak. Toplam lysate olarak 100 μL bir kısım alın ve sds-page ve Coomassie mavi analizi için 100 μL 2x laemmli örnek tampon ekleyin.
  10. 0,45 μm gözenek şırınga filtresi ile lysate filtre ve GSH boncuklar ile karıştırın. 5 h için sallayarak 4 °c ' de inkük. 3 dakika 2.500 x g boncuklar aşağı spin, kaldırmak ve akış yoluyla süpernatant kaydedin. Proteinler-GSH bağlı boncuk 6 kez (5 mL her) Tampon A içeren anti-proteaz kokteyl ve PMSF ile yıkayın.
  11. Son yıkama sonra, boş bir kromatografi sütun içine tampon 10 ml ile birlikte boncuklar aktarmak, 1,5 ml arabellek A içeren 25 mm glutatyon eklemek ve 1,5 ml mikrotüpler içine yerçekimi ile elüsyon toplamak. Elüsyon prosedürünü 4 kez tekrarlayın.
    Not: Glutatyon stok solüsyonu 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 200 mM konsantrasyonda hazırlanır
  12. 4 elutions her biri 10 μL bir kısım alın ve 10 μL 2x laemmli örnek tampon ekleyin. Bu numuneler, arıtılmış proteinlerin varlığını ve saflığını belirlemek için SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizinde kullanılacaktır.
    Not: Son elüsyonu takiben, geri dönüşümü ve gelecekteki kullanım için 4 °C ' de tampona boncuk tutun.
  13. Daha fazla analiz için makul miktarlarda arıtılmış proteinleri gösteren elleşmiş fraksiyonları seçin. Hazırlık küçük plakaya olun. Arıtılmış proteinleri-80 °C ' de saklayın. Genellikle, protein konsantrasyonu 0,5 μg ila 2 μg ila μL arasında değişir ve numuneler bu durumda depolanabilir.
  14. Isteğe bağlı: 10K Santrifüjlü filtre ünitesi kullanılarak numune veya değişim tamponunu konsantre etme

2. BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase kompleksi arıtma

  1. Kullanım pET30a +-onun-BAP138 ve PDEST-MBP-Deubad (ASXL2)35 bakteriyel Ifade oluşturur bl21 (de3) RIS bakteri üretimi IÇIN RIS-BAP1 ve MBP-Deubad sırasıyla.
  2. Onun-BAP1 ve MBP-Deubad (ASXL2), 50 μg/ml kloramfenikol içeren ampisilin orta lb suyu ile 20 ml 'de bakteri ifade ederek iki ayrı gecede marş kültürlerini gerçekleştirin ve her bir plazmid için ilgili antibiyotik, 100 μg/ ml kanamisin veya 100 μg/ml ampisilin sırasıyla. 37 °C ' de Shaker üzerine yerleştirin.
  3. 1.3 – 1.6 arasındaki adımları gerçekleştirin.
  4. 25 mL buz-soğuk lizis tampon B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-Mercaptoetanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF ve 1/100 anti-proteaz kokteyl) içinde bakteri Pelet resuspend. MBP-Deubad endoglikozidazları ile onun-BAP1 eşit hacimleri karıştırın ve 15 dakika boyunca buzda inküye ve sonra protokol 1 ' de belirtildiği gibi lysate santrifüjle (adım 9).
    1. Santrifüjleme sırasında 500 μL paketlenmiş ni-NTA agaroz boncukları (% 50 Bulamaç) PMSF ve anti-proteaz kokteyl olmadan B tampon ile üç kez yıkayarak hazırlayın.
  5. Bakteriyel lysate santrifüjleme sonrasında, süpernatant toplamak ve bir 50 ml konik tüp içine aktarmak. Toplam lysate olarak 100 μL bir kısım alın ve sds-page ve Coomassie mavi analiz için 2x laemmli örnek tampon 100 μL ekleyin.
  6. 0,45 μm gözenek şırınga filtresi ile lysate filtre ve ni-NTA boncuklar ile karıştırın. 5 h için sallayarak 4 °c ' de inkük. 3 dakika 2.500 x g boncuklar aşağı spin, kaldırmak ve akış yoluyla süpernatant kaydedin.
    1. 20 mM 1, 3-Diaza-2, 4-cyclopentadiene (Imidazol) içeren Tampon B ile 6 kez (5 ml) boncuk yıkayın.
      Not: pH 7,3 de 2 M imidazol bir stok çözüm olun.
  7. Son yıkamadan sonra, boncukları 10 mL tampon ile boş bir kromatografi sütununa aktarın, 200 mM ımidazol içeren 1 mL Tampon B ekleyin ve 10 ΜL dtt (500 mm) ve 2 ΜL edta (500 mm) Içeren 1,5 ml mikrotüplere yerçekimi ile elüsyonu toplayın , pH: 8). elüsyon prosedürünü 4 kez tekrarlayın. SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 10 μL her bir elüsyon fraksiyonu alın ve 10 μL 2x Laemmli örnek tampon ekleyin. İstenen el kesirleri havuzla.
    Not: Boncukları geri dönüşüm ve gelecekteki kullanım için 4 °C ' de tampon olarak saklayın.
  8. Amiloz agaroz boncuklar ile kuluçtan önce C tampon (50 mm Tris pH 7,3, 300 mm NaCl, 1% Triton X-100, 5 mm DTT, 1 mm EDTA, 1 mm PMSF ve 1/100 proteaz inhibitörü kokteyli) ile 3 kez seyreltilmiş kompleks.
    1. PMSF ve anti-proteaz kokteyli eklemeden 2 kez Tampon C ile yıkayarak Amiloz agaroz boncukları (500 μL paketlenmiş) hazırlayın. Boncukları seyreltilmiş elüsyona ekleyin ve gece 4 °C ' de inküye yapın.
  9. 2.500 x g 'de 3 dakika santrifüjün ve akışına devam edin. Proteinleri-Bounds boncuk 5 mL Tampon C (5 – 6x) ile yıkayın.
  10. (50 mm HEPES pH 8,0, 50 mm NaCl,% 10 gliserol ve 1 mm DTT) Tampon D 'de Amiloz agaroz boncuklar üzerinde arıtılmış onun-BAP1/MBP-Deubad kompleksi tutun ve-80 °c saklayın. Boncuk fraksiyonunun 20 μL 'ini alın (% 50 boncuk çözeltisi) ve SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 20 μL 2x Laemmli örnek tampon ekleyin.

3. HEK293T hücrelerden Nükenosomların arıtılması

  1. Kültür HEK293T hücreleri tam Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) ile tamamlayıcı 5% yenidoğan buzağı serum (NBS), 2 mM L-glutamin, ve 1% penisilin/streptomisin.
  2. Transfeksiyondan bir gün önce 15 cm kültür yemeği başına 20 mL 'Lik tam medyada 12 x 106 HEK293T hücre etrafında plaka (10 yemek kullanılmıştır). Transfeksiyondan önce, hücrenin orta-12 mL 'yi serum-serbest orta olarak değiştirin ve 1 mg/mL3663 μL polilenimine (PEI) kullanarak 21 μg pCDNA-Flag-H2A ile hücreleri transfekt. Tamamlamak için Değiştir orta 12 saat sonra.
  3. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreleri 15 mL buz soğuk PBS (iki kez) ile yıkayın ve bir hücre sıyırıcı kullanarak 3 mL buz-soğuk PBS içinde hasat edin. 2.100 x g 'de 4 °c ' de 8 dk Santrifüjü. PBS 'i atın ve lizis adımına geçin veya-80 °c ' de hücre peleti dondurabilirsiniz.
  4. Yaklaşık 10 hacim Tampon E (50 mm Tris-HCl pH 7,3, hücre Pelet resuspend, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm PMSF, 1/100 proteaz inhibitörü kokteyli ve 20 mm N-metilmaleimide (nem)) ve 20 dakika boyunca buzun üzerine inkulat N-metilmaleimid (NEM) nükle ile birlikte arındırılmış DUBs inhibe etmek için önemlidir.
  5. 5 dk için 3.000 x g santrifüjleme sonra, süpernatant atın ve tampon E. Mix 10 hacim içinde kromatin Pelet pelletini Inversion ve santrifüj tarafından 3.000 x g için 5 dk.
    1. Tampon F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCL, 2 mm MgCl2, 1 mm cacl2, 0,3 M SUCROSE, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF ve 1/100 proteaz inhibitörü kullanarak tamponu yeniden kullanarak başka bir zaman kokteyl).
      DIKKAT: Pellet yıkanma ve santrifüjleme sırasında yüzen olacaktır.
  6. Kromatin 5 ml Tampon F 'de resuspend ve mikrococcal nükleaz (mnase) ile Pelet Treat (Oda sıcaklığında 10 dakika için 3 U/ml).
    Not: Reaksiyon bir Dons Homogenizer kullanarak karıştırılarak destekli olabilir.
  7. İnkübasyon işleminden sonra, nükkozomal DNA parçacıklarının analizi için 40 bir μL alketi alın. Bu kısım ile karıştırın 40 μL fenol/kloroform ve 20 μl 6x DNA yükleme tamponu, Vortex, spin 18.000 x g için 2 dakika, ve% 2 agaroz jel DNA yükleyin.
    1. DNA ağırlıklı olarak mononükleosomes 'e karşılık gelen bir 147 BP parçası olduğunda, son konsantrasyonda 5 mM EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  8. 21.000 x g 'de 4 °c ' de 20 dakika santrifüjleme sonrasında, 4 °c ' de gece Anti-Flag reçinesi ile çözünür kromatin fraksiyonu inkübasyon yapın. 6 x Tampon G (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 proteaz inhibitörleri kokteyli) ile boncukları yıkayın.
  9. 5 mL Tampon G ile boncukları boş bir kromatografi sütununa aktarın. 200 μg/mL bayrak elüsyon peptid ile boncuk-bağlı nükosomes elute. 200 μg/mL bayrak elüsyon peptitleri (bkz. malzeme tablosu) ve 1/5 (Vol: Vol) 1 M Tris, pH 8,0 Içeren Tampon G 'den oluşan bir elüsyon tamponu kullanın. 260 μL bayrağı elüsyon tampon (2 saat her elüsyon) ile nükselosomes 3x elute.
  10. Fenol-kloroform ekstraksiyon için bir kısım alarak 3 elutions test ve% 2 agaroz jel DNA yükleyin. Her bir elüsyon fraksiyonu için 10 μL alın ve SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 10 μL Laemmli örnek tampon 2x ekleyin Elüsyon-80 °c ' de saklayın. Genel olarak, insan hücrelerinden arıtma bakterilerden daha az miktarda protein verir, 0,1 ila 0,5 μg/μL arasında değişen konsantrasyonlarda.

4. BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligaz kompleksi kullanılarak nükliobazı Ubiquitination assay

  1. Nükstrenosomları 10K gözenek 0,5 mL Santrifüjlü filtreler aracılığıyla Santrifüj filtreleri ile reaksiyonu tampondan H (25 mm Tris, pH 7,5; 10 mm MgCl2ve 5 mm ATP) olarak değiştirin. Alternatif olarak, ticari olarak kullanılabilir nükosomes tahlil için kullanılabilir.
    Not: Substrat süspansiyon çözeltisini reaksiyon tamponunun değiştirilmesi, yeniden Üretilebilirlik sağlar ve Flag erüsyon karışımında bulunan bileşikler tarafından olası E3 ligaz inhibisyonu önler.
  2. 40 μL Tampon Htoplam hacminde 1 μg nüktrinosomların inküyü. UB aktive enzim (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) ve E2 UB-konjugating enzimleri (672 ng) ve 1 μg BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligaz kompleksini ekleyin. Zaman zaman sallama ile 37 °C ' de 3 h için reaksiyonu inküt.
    Not: Birden fazla kontrol, E1, E2, E3, ATP ve Ubiquitin dahil olmak üzere paralel olarak yapılabilir. Bu, en fazla reaksiyon için özgüllüğü sağlar.
  3. Standart prosedürlere göre 40 μL 2x laemmli numune tamponunu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve sds-page ve Western blotting tarafından histon H2A K119 mayası analizini yapın. Anti-H2A veya anti-H2A K119ub antikorları kullanın (bkz. malzeme tablosu).

5. BAP1/DEUBAD kullanarak In vitro Nükmosomal H2A DUB assay

  1. In vitro deubiquitination assay için saflaştırılmış nüklizomleri kullanın. 40 μL Tampon I (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL ve 1 mm DTT) içinde nükstrozların 100 – 500 ng resuspend. 1 μg BAP1 bakteri-BAP1 ve MBP-DEUBAD ekleyin. 37 °C ' de zaman zaman sallayarak 3 h için deubiquitination reaksiyonu gerçekleştirin.
  2. 2x Laemmli tampon 40 μL ekleyerek ve İmmünoblotting ile analiz ederek in vitro reaksiyonu durdurun.

Sonuçlar

GST-BMI1 ve RING1B proteinleri iyi bakterilerde üretilmektedir ve çözünür fraksiyonda kolayca ayıklanabilir. Şekil 1a GST-BMI1-RING1B kompleksi tipik bir arıtma Için bir Coomassie mavi boyama gösterir. GST-BMI1 ve RING1B bantları beklenen moleküler ağırlıkta, ~ 45 kDa ve ~ 13 kDa sırasıyla göç. Özellikle E3 ligaz kompleksi çok düşük düzeyde bakteri proteinlerinin kontaminantları ve/veya bozulma ürünleri ile son derece homojen. Daha...

Tartışmalar

İlgi proteinleri için sağlam In vitro mayası ve deubiquitination asder kurulmasının çeşitli avantajları vardır. Bu göstericiler için kullanılabilir: (i) optimum koşullar kurmak ve bu reaksiyonlar için minimal gereksinimi tanımlamak, (ii) enzimatik kinetik ve biyokimyasal sabitler belirlemek, (iii) bu reaksiyonları etkileyebilir Kofaktörler veya inhibitörlerin rollerini tanımlamak, (iv) etkileşim arayüzlerini tanımlayın, (v) yapay veya hastalıkla ilişkili mutasyonların etkisini test edin ve (vi)...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Teşekkürler

Teknik yardım için Diana Adjaoud 'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) ve Genome Kanada (2016-2019) E.B.A. E.B.A. için hibe tarafından destekleniyordu Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S) üst düzey bir bilim adamı. L. M ve N.S.K., FRQ-S ' d e k i Doktora Bursu. H. B Yüksek Eğitim Bakanlığı ve Tunus bilimsel araştırmalar ve Cole Vakfı 'ndan Doktora Bursu aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amylose agarose beadsNew England Biolabs#E8021
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10KSigma-Aldrich#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)Cell Signaling Technology#8240
Anti-Flag-agarose beadsSigma-Aldrich#A4596
Anti-protease cocktailSigma-Aldrich#P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteriaAgilent technologies#230240
DMEMWisent#319-005-CL
Empty chromatography columnBiorad#731-1550
Flag peptideSigma-Aldrich#F3290
GSH-agarose beadsSigma-Aldrich#G4510
HEK293TATCC#CRL-3216
ImidazoleSigma-Aldrich#I5513
Micrococcal nuclease (MNase)Sigma-Aldrich#N3755
Ni-NTA agarose beadsThermoFisher Scientific#88221
N-methylmaleimide (NEM)Bioshop#ETM222
Pore syringe filter 0.45 μmSarstedt#83.1826
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)Addgene#63139
Ub Activating Enzyme (UBE1)Boston Biochem#E-305
UBCH5C (UBE2D3)Boston Biochem#E2-627

Referanslar

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 149ubiquitinationdeubiquitinationE3 Ubiquitin ligazPRC1deubiquitinasePR DUBkromatinBAP1ASXLBMI1RING1BH2A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır