JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا معياريا لعلم الدهون في الأنسجة وعلم النسخ ، والدهون في البلازما في نماذج فئران الأمراض العصبية التي تستهدف الدهون الكامنة وراء الالتهاب والنشاط العصبي ، والدهون الغشائية ، والرسل في اتجاه المصب ، والإنزيمات / المستقبلات المشفرة للحمض النووي الريبوزي المرسال الكامنة وراء وظيفة الدهون. يتم تحديد إجراءات أخذ العينات ومعالجة العينات واستخراجها وقياسها كميا.

Abstract

تعمل الدهون كواجهة أساسية لإهانات الدماغ أو المحفزات المفضية إلى الأمراض العصبية وهي خزان لتخليق الدهون مع مختلف الإشارات أو وظيفة الرباط التي يمكن أن تؤكد على ظهور الأمراض وتطورها. غالبا ما تتغير الدهون على مستوى الأعراض السابقة ، وهي مصدر ناشئ لأهداف الأدوية والمؤشرات الحيوية. تظهر العديد من الأمراض العصبية التهابا عصبيا وتنكسا عصبيا واستثارة عصبية كسمات مميزة مشتركة ، يتم تعديلها جزئيا بواسطة أنظمة إشارات دهون محددة. إن الاعتماد المتبادل والترابط بين توليف الدهون المختلفة يدفع إلى تحليل متعدد الدهون ومتعدد الإنزيمات والمستقبلات المتعددة من أجل اشتقاق القواسم المشتركة والخصائص للسياقات العصبية والإسراع في كشف الجوانب الميكانيكية لظهور المرض وتطوره. إن إسناد أدوار الدهون إلى مناطق الدماغ المتميزة يعزز تحديد النمط الظاهري الجزيئي الدهني والمورفولوجيا المرتبطة بمرض عصبي.

يظهر هنا بروتوكول معياري مناسب لتحليل الدهون الغشائية وإشارات الدهون في اتجاه المصب جنبا إلى جنب مع mRNA للإنزيمات والوسطاء الكامنة وراء وظائفها ، المستخرجة من مناطق الدماغ المنفصلة ذات الصلة بمرض عصبي معين و / أو حالة عصبية. لضمان التنميط الدهني المقارن الدقيق ، تم تحسين سير العمل ومعايير التشغيل وتوحيدها من أجل: i) أخذ عينات الدماغ وتشريح المناطق ذات الاهتمام ، ii) الاستخراج المشترك لإشارات الدهون المتعددة والدهون الغشائية ، iii) استخراج الدهون المزدوجة / mRNA ، iv) القياس الكمي عن طريق مراقبة التفاعلات المتعددة للكروماتوغرافيا السائلة (LC / MRM) ، و v) التنميط القياسي mRNA. سير العمل هذا قابل للتعاريف لكميات الأنسجة المنخفضة التي يتم الحصول عليها عن طريق أخذ عينات من المناطق الفرعية المنفصلة وظيفيا في الدماغ (أي عن طريق لكم الدماغ) ، وبالتالي منع التحيز في التحليل متعدد الجزيئات بسبب عدم تجانس الأنسجة و / أو التباين الحيواني. للكشف عن العواقب الطرفية للأمراض العصبية وإنشاء قراءات جزيئية انتقالية لحالات الأمراض العصبية ، يتم أيضا متابعة ووصف عينات الأعضاء الطرفية ومعالجتها وتحليلها الدهني اللاحق ، وكذلك الدهون في البلازما. يتم عرض البروتوكول على نموذج فأر الصرع الحاد.

Introduction

التطورات الحديثة في وظيفة الدهون ودورها في ظهور الأمراض العصبية وتطورها تفتح أماكن جديدة للبحث والتطوير لأهداف علاجية جديدة وتوضيح آلية المرض1. الاختلافات الموثقة في تكوين الدهون في مناطق الدماغ المختلفة ، والتي تؤكدها تقنيات التصوير الجزيئي الحديثة مثل التصوير الطيفي الكتلي والتنميط المتقدم لقياس الطيف الكتلي ، تحول نموذج التحقيق في الدهون من الدماغ كله إلى مناطق الدماغ المتميزة وظيفيا والمنفصلة. حقيقة أن تكوين الدهون يختلف في مناطق الدماغ المختلفة يدفع إلى تصور جديد لكل من حساسية الدهون الغشائية وإشارات الدهون في اتجاه المصب استجابة لإهانة الدماغ أو المحفزات عبر مناطق الدماغ المتميزة وظيفيا. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات الدهون تطورات جديدة لمواجهة التحدي المتمثل في انخفاض كميات الأنسجة للكشف عن الدقة المكانية الأعلى وتحديدها كميا ، وفي الوقت نفسه ، تحليل المكونات الدهنية المتعددة لأغشية الخلايا ومسارات الإشارات. أيضا ، يعد تحديد الإنزيمات وروابط الدهون والمستقبلات المشاركة في تنظيم مستوياتها ووظيفتها أمرا بالغ الأهمية لتوضيح مسارات الإشارات المتأثرة بمرض عصبي وتوجيه التحقيقات الميكانيكية الجديدة في سياق فسيولوجي مرضي.

بالإضافة إلى زيادة الدقة المكانية للدماغ ، هناك صعوبتان رئيسيتان تتحديان تطوير مناهج جديدة للدهون العصبية. أولا ، عادة ما تكون جزيئات إشارات الدهون ذات وفرة منخفضة للغاية مقارنة بالدهون المكونة للغشاء. ثانيا ، تظهر القبة الشحمية عدم تجانس هيكلي عال ، يصعب تشريحها باستخدام نهج تحليلي واحد. وبالتالي ، يتم تصميم طرق الاستخراج والتحليل لفئات الدهون المختلفة ويتم إجراؤها عادة في عينات الأنسجة المتميزة.2. طرق البندقية الدهنية3 هي أدوات ممتازة للكشف بسرعة عن ملف تعريف واسع من الدهون الغشائية ، في حين يتم الاستفادة من زيادة الحساسية والانتقائية التي توفرها طرق الاكتشاف المستهدفة والقياس الكمي للطيف الكتلي للتحقيق في الدهون ذات الإشارات المنخفضة بما في ذلك: i) الدهون الالتهابية و ii) الدهون المشاركة في تعديل النشاط العصبي ، مثل endocannabinoids (eCBs) ، والدهون المرتبطة بالأحماض الأمينية ، الخ.4,5. لتشمل تغيرات الدهون على كل من غشاء الخلية ومستوى الإشارات التي تحدث في مناطق الدماغ من نماذج الأمراض العصبية ، عادة ما يتم استخراج الدهون وتحليلها في عينات أنسجة متميزة ، يتم الحصول عليها من دفعات حيوانية متميزة أو من نصفي الكرة الأرضية مختلفين ، أو عن طريق تشريح منطقة نسيج أكبر إلى قطع متعددة. عندما تكون مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال من مستقبلات الإنزيم ذات أهمية أيضا ، فإن تحقيقها يتطلب عادة شراء عينة أنسجة متميزة. على سبيل المثال ، سيتطلب التحقيق في الدهون الغشائية ، والقنب الداخلي ، والحمض النووي الريبي المرسال ثلاث عينات مختلفة من الأنسجة ، (على سبيل المثال ، عينتان لطريقتي استخراج الدهون - دهون الغشاء والدهون المشيرة - وطريقتان لاحقتان لتحليل الدهون - وعينة واحدة لتحليل الحمض النووي الريبي المرسال). يتطلب التحقيق في الدهون الالتهابية والقنب الداخلي عينتين متميزتين من الأنسجة ، طرق الاستخراج ، وطرق التحليل ، على التوالي. مثال آخر هو التحقيق في الحمض النووي الريبوزي المرسال وأي فئة من الدهون في عينة التشريح المجهري للدماغ أو الليزر والتي تتطلب بالتالي حيوانين متميزين لشراء عينتين لكل منطقة دماغية (فرعية). وكثيرا ما يحدث في مثل هذه الحالات قدر كبير من التباين و/أو ضعف تكرار النتائج، وينشأ عن التباين البيولوجي و/أو عدم تجانس الأنسجة. واسترشادا بهذه القيود العملية للتحليل متعدد الجزيئات، الذي يحدث بشكل خاص عند الدقة المكانية العالية في الدماغ، تم تصميم بروتوكول للدهون العصبية المكون من ثلاث وحدات يشمل: 1) الاستخراج المشترك والتحليل المشترك بواسطة LC/MRM للدهون الالتهابية (على سبيل المثال، eicosanoids (eiCs)) والدهون المشاركة في تعديل النشاط العصبي، مثل eCBs2; 2) الاستخراج المشترك للدهون الفوسفاتية (PLs) و eCBs مع LC / MRM متعدد المسح اللاحق وتحليل مسح فقدان السلائف / محايدة2; و 3) الاستخراج المزدوج للدهون الغشائية (الفوسفو) و eCBs وكذلك mRNA ، مع تحليل تسلسل LC / MRM و qPCR أو RNA اللاحق6. اعتمادا على السؤال البيولوجي الذي يجب معالجته في مرض عصبي ومنطقة الدماغ ذات الأهمية ، يمكن تطبيق مزيج من البروتوكول الأول والثاني ، أو البروتوكول الأول والثالث ، على نفس عينة الأنسجة للأنسجة التي تزن حوالي 4 ملغ. يمكن تطبيق البروتوكولين الأول والثالث بشكل مستقل على الأنسجة حوالي 2 ملغ. يمكن تطبيق البروتوكول الثاني على الأنسجة التي تزن أقل من 0.5 ملغ. بغض النظر عن وحدة البروتوكول العصبي الدهني المختارة ، فإن أخذ عينات الأنسجة والمعالجة قبل التحليلية ، وعزل الدماغ وتشريح المنطقة ، بالإضافة إلى إجراء التضحية بالنموذج الحيواني موحدة ومتطابقة لجميع الوحدات الثلاث للبروتوكول. في تحقيقنا في الأمراض العصبية ، يتم دائما جمع وتحليل الأعضاء الطرفية ذات الصلة بالعواقب المرضية للمرض باستخدام هذه البروتوكولات المعيارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أخذ عينات من الدم بانتظام لدهون البلازما لتكون بمثابة أداة قراءة للأمراض العصبية مع عرض التطبيقات الانتقالية المحتملة. بروتوكول الدهون المعياري المعروض هنا متعدد الاستخدامات للغاية: قابل للقياس إلى كميات أكبر من الأنسجة وقابل للتطبيق بسهولة على أي نوع من الأنسجة والأمراض تقريبا. لتطبيق البروتوكول المعياري (الشكل 1) في الأمراض العصبية ، فإن أي نموذج قياسي للقوارض لظهور وتطور الاضطرابات العصبية ، مثل إصابات الدماغ الرضحية أو مرض باركنسون أو مرض الزهايمر أو الصرع يمكن علاجه.

تم تطبيق هذه البروتوكولات على نطاق واسع لدراسة التغيرات في الأنسجة الدهنية و / أو النسخ في المرحلة الحادة من الصرع في نموذج الفأر الناجم عن حمض الكانيك (KA) من الصرع 2,7 ، وهو نموذج يستخدم على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية بسبب التشابه مع صرع الفص الصدغي البشري (TLE) 8,9,10,11. باستخدام هذه البروتوكولات ، تم تقييم الإمكانات العلاجية للعقاقير مثل Palmitoylethanolamide (PEA) 12,13 في نفس نموذج الفأر من الصرع. حددت الدراسة تغيرات الدهون والحمض النووي الريبوزي المرسال بدقة مكانية عالية ومنخفضة في الدماغ والمحيط، في نقطة زمنية من أقصى شدة النوبات الحادة (في 60 دقيقة بعد تحريض النوبة)، وعند العلاج شبه المزمن والحاد مع PEA في أربع نقاط زمنية مختلفة (20 و 60 و 120 و 180 دقيقة) بعد تحريض نوبة KA، وهي نافذة زمنية تغطي المرحلة الحادة من الصرع. تم جمع البلازما والأدمغة والأعضاء الطرفية للفئران غير المعالجة بحقن KA ، والفئران الحادة والمعالجة بشكل مزمن ب PEA ، وكذلك فئران التحكم في المركبات ومركبات PEA ، في كل نقطة زمنية 12,13 ، وتم التحقيق فيها باستخدام هذا التحليل الجزيئي. ارتبطت البيانات الجزيئية بالأنماط الظاهرية السلوكية التي تم الحصول عليها عن طريق تسجيل النوبات ، وكذلك مع البيانات المشتقة من الكيمياء النسيجية المناعية حول العمليات التنكسية العصبية ، من أجل كشف تطور مرحلة الصرع الحاد وإمكانات PEA للتخفيف من حدتها.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا تتوافق مع توجيه مجلس الجماعة الأوروبية المؤرخ 22 سبتمبر 2010 (2010/63EU) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الحيوانات المحلية في ولاية راينلاند بالاتينات ، ألمانيا (مرجع الملف: 23 177-07 / G16-1-075).

1. نموذج حيواني للصرع الحاد والمعالج وقائيا الناجم عن KA

  1. إجراء تحريض النوبات وعلاجها وتسجيلها السلوكي.
    1. الفئران المنفصلة (الحد الأدنى n = 6 الفئران لكل مجموعة) في أقفاص واحدة.
    2. إعداد محلول حقن تحريض النوبات والمركبة المقابلة (انظر الجدول 1) ، وكذلك محلول حقن العلاج والمركبة المقابلة (انظر الجدول 2).
    3. حقن الفئران داخل الصفاق (i.p.) (10 مل / كغم من كتلة جسم الفأر) دون تخدير وفقا لهوية مجموعتها: المرض أو العلاج أو المعالجة بالمركبة (أي KA ، KA المعالجة ب PEA ، ومجموعتي المركبات). انظر الشكل 2 والجدول 1 والجدول 2.
    4. مراقبة وتسجيل السلوك وفقا لمقياس شدة النوبة الموحد التالي: 0 = لا توجد استجابة. 1 = الجمود والتحديق ؛ 2 = الطرف الأمامي و / أو تمديد الذيل ، الموقف الصلب ؛ 3 = الحركات المتكررة ، تمايل الرأس ؛ 4 = التربية والسقوط. 5 = التربية والسقوط المستمرين. 6 = نوبات منشط كلوني شديدة; 7 = الوفاة14,15 (الشكل 3).
  2. إجراء التضحية للتحليل الدهني والنسخي.
    1. في أربع نقاط زمنية (أي 20 و 60 و 120 و 180 دقيقة بعد حقن KA أو السيارة على التوالي) ، ضحى بستة فئران من كل مجموعة من المجموعات التالية: PEA المعالجة ، مركبة الصرع غير المعالجة ب PEA 1 ، والسيارة 2 ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة من IACUC.
    2. بعد عشر ثوان من الوصول إلى كل نقطة زمنية ، قم بتخدير الفئران باستخدام نسيج منقوع بالإيزوفلوران في غرفة زجاجية. تأكد من التخدير عن طريق فقدان منعكس التصحيح ، المشار إليه بعدم القدرة على الحركة أثناء قلب الغرفة الزجاجية ببطء. قطع رؤوس الفئران باستخدام مقص جراحي وجمع البلازما والدماغ والأعضاء الطرفية (انظر الخطوات 2.2.2-2.2).
      تنبيه: تختلف اللوائح الأخلاقية لإجراءات التضحية بين لجان الحيوانات المحلية. تأكد من التحقق من اللوائح الصادرة عن لجنة الحيوانات المحلية واتباعها.
  3. اتبع إجراء التضحية لتحليل الكيمياء النسيجية المناعية.
    1. بالنسبة للتلطيخ الكيميائي النسيجي المناعي13 ، قم بتسجيل ثلاثة فئران سلوكيا من كل مجموعة من المجموعات التالية: PEA المعالج ، والصرع غير المعالج ب PEA ، ومجموعات المركبات ، على مدار الوقت بأكمله (180 دقيقة).
    2. التضحية والفئران perfuse بعد 5 أيام. تخدير الفئران بعمق (انظر الخطوة 1.3.1 لمجموعات الفئران) عن طريق حقن i.p. من البنتوباربيتال (100 ملغ / كغ) والبوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) كعقاقير مخدرة. تأكيد التخدير العميق عن طريق فقدان رد الفعل بين أصابع القدم.
    3. ثبت الماوس على صفيحة البوليسترين وافتح الصدر على الفور باستخدام مقص دقيق وملقط قياسي. ضع الفراشة في بطين القلب الأيسر واقطع الأذين الأيمن باستخدام مقص دقيق.
    4. اضبط سرعة وضغط المضخة على تدفق تمعجي ثابت بمعدل 2-3 مل / دقيقة. تخلص من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) لمدة 5 دقائق تقريبا. إذا لزم الأمر ، استبدل الفراشة.
      ملاحظة: مع التروية المناسبة ، تبدأ الأعضاء الداخلية (باستثناء الطحال) في التبييض في غضون 1-2 دقيقة.
    5. قم بتبديل التروية إلى محلول بارافورمالدهيد (PFA) البارد المثلج لمدة 5 دقائق تقريبا. اعزل الأدمغة الكاملة كما هو موضح في الخطوة 2.2.2 وقم بإصلاحها لمدة 24 ساعة في محلول PFA بنسبة 4٪ عند 4 درجات مئوية.
    6. احتضان الأدمغة في محلول السكروز بنسبة 30٪ لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السكروز المتبقي بورق مناديل جاف وقم بتجميد الأدمغة على صفيحة معدنية (-80 درجة مئوية). قم بتخزين الأدمغة عند -80 درجة مئوية لإجراءات التلطيخ13.

2. إجراءات أخذ العينات لتحليل الدهون / النسخ

  1. الاستعداد لأخذ العينات.
    1. تبريد مسبق لأنابيب EDTA لأخذ عينات البلازما إلى 4 درجات مئوية. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي والدوامة إلى 4 درجات مئوية. قم بتبريد الصفيحة المعدنية المغطاة بورق الألومنيوم (لالتقاط الدماغ المجمد و / أو الأنسجة الأخرى ذات الأهمية) على الثلج الجاف (-80 درجة مئوية). قم بتبريد الأنابيب المصنفة 2 مل و 5 مل على الثلج الجاف (-80 درجة مئوية) لأليكوتات البلازما والأنسجة المجمدة وجمع الدماغ ، على التوالي. استخدم أنابيب العنبر لحماية الجزيئات الحساسة للضوء، مثل eiCs.
    2. قم بتنظيف معدات أخذ عينات الأنسجة وعزلها (المقص الجراحي ، المقص الدقيق الحاد المستقيم ، الملقط القياسي السلس المستقيم ، الملقط الناعم مع الانتهاء من المرآة ، الملقط المنحني والملعقة ، لوحة رغوة البوليسترين ، والإبر للتثبيت) باستخدام مطهر (على سبيل المثال ، 70٪ إيثانول).
  2. بروتوكولات أخذ العينات
    1. تحديد ترتيب أخذ العينات.
      1. جمع الدم مباشرة بعد قطع الرأس في أنابيب EDTA المبردة مسبقا 1 مل (انظر الخطوة 2.2.3).
      2. قم بإزالة الدماغ بالكامل وقم بتجميد المفاجئة مباشرة بعد الإزالة. ستستغرق هذه الخطوة من 1 إلى 2 دقيقة. تخزين الأدمغة المجمدة عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 2.2.2).
      3. قم بإزالة الأعضاء الطرفية ذات الأهمية (مثل الرئة والقلب والكبد) ، في غضون 5 دقائق بعد إزالة الدماغ ، وقم بتجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 2.2.4).
    2. إزالة الدماغ لإجراءات التشريح أو اللكم. يستغرق هذا الإجراء 1-2 دقيقة / الدماغ.
      1. بعد قطع الرأس (انظر الخطوة 1.2) ، ابدأ في إجراء شق خط الوسط في الجلد باستخدام مقص دقيق. حرر الجمجمة عن طريق قلب الجلد فوق العينين. الوصول إلى الجزء العلوي من الجمجمة وإجراء شق ذيلي صغير بدءا من مستوى العظم داخل الجدارية. تجنب قطع الدماغ.
      2. قطع بقوة من خلال الجزء الأمامي من الجمجمة بين العينين لتسهيل إزالة الدماغ. قم بإمالة جانب واحد من العظم الجداري باستخدام ملقط ضيق منحني وقطعه. كرر الخطوة الأخيرة للجانب الآخر.
      3. إزالة السحايا الدماغية. حرك ملعقة تحت الجزء الأمامي من الدماغ (أي المصباح الشمي) وقم بإمالة الدماغ بلطف لأعلى. حرك الملعقة لأسفل لكسر الأعصاب البصرية والأعصاب القحفية الأخرى.
      4. ارفع الدماغ من الجمجمة وقم بتجميد الدماغ بالكامل على الفور على لوحة معدنية مبردة مسبقا (-80 درجة مئوية) مع الجانب البطني المواجه للصفيحة المعدنية (الظهرية لأعلى).
      5. اسمح للأدمغة بالتجميد التام والانتقال إلى أنابيب 5 مل مبردة مسبقا وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تشريح مناطق الدماغ أو إجراء اللكم (انظر الخطوتين 3.1. و 3.2).
    3. إجراء أخذ عينات البلازما.
      1. أنابيب EDTA المبردة مسبقا من Spike مع 10 ميكرولتر من تخفيف الإندوميتاسين المحضر حديثا إلى تركيز مستهدف يبلغ 10 ميكرومتر.
      2. جمع الدم الجذع مباشرة بعد قطع الرأس عن طريق الضغط اللطيف على الجسم في أنابيب EDTA المبردة مسبقا إلى الحد الأقصى لحجم الدم من 1 مل.
        ملاحظة: في حالة ضغط الدم السليم ، لا يلزم الضغط. إذا كان حجم الدم أقل من 1 مل ، فقم بتقليل وقت حضانة الأيزوفلوران لتمكين تدفق الدم السليم.
      3. قم على الفور بطرد أنابيب الدم المركزية عند 2000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بإزالة مرحلة البلازما العليا الناتجة ولغرض تحليل الدهون المتعددة ، حدد أليكوت أحجام البلازما في أنابيب 2 مل المبردة مسبقا على النحو التالي: 50 ميكرولتر لتحليل eCBs / eiCs ، و 30 ميكرولتر لتحليل PLs ، وحجم البلازما المتبقي كعينة احتياطية أو لأنواع أخرى من التحليل.
      5. تخزين عينات البلازما عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخراج (انظر الخطوتين 4-1-2 و4-1-4).
    4. إجراء أخذ عينات من الأعضاء الطرفية.
      ملاحظة: استخدم مراجع تشريح الفئران16 والوثائق المقدمة للدورات الإلزامية (FELASA) التي يحضرها المحققون في الحيوانات لتحديد الأعضاء الفردية وأنسجتها الضامة و / أو الأوعية الدموية.
      1. شل حركة جذع الفأر لتسهيل إزالة الأعضاء باستخدام الإبر. قم بعمل شق بطني في خط الوسط باستخدام مقص حاد مستقيم في ارتفاع العانة. استخدم ملقط قياسي حاد لتثبيت جدار البطن أثناء القطع لفتح تجويف البطن.
      2. شل حركة الجلد للسماح بإزالة أعضاء البطن باستخدام ملقط حاد. لإزالة القلب أو الرئة، استمر في القطع الإنسي في اتجاه كهف الثدي. قم بإزالة الرئة و / أو القلب باستخدام ملقط ناعم.
      3. افتح تجويف الثدي بعناية لتجنب النزيف. قطع الأنسجة الضامة والأوعية الدموية التي ترسو العضو المعني دون قطع العضو.
      4. انقل قطع الأنسجة على الفور على ألواح معدنية مبردة مسبقا (-80 درجة مئوية) واتركها تتجمد تماما. انقل قطع الأنسجة إلى أنابيب مبردة مسبقا وخزنها عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 4.1).

3. معالجة المواد البيولوجية

ملاحظة: للاستخراج المشترك ل eCBs / eiCs ، استخدم أنابيب كهرمان 2 مل كأنابيب استخراج وأضف في كل أنبوب سبع كرات فولاذية مبردة مسبقا. للاستخراج المشترك ل PLs / eCBs وللاستخراج المشترك المزدوج للدهون والحمض النووي الريبي ، استخدم 2 مل من أنابيب الاستخراج الخالية من الحمض النووي الريبي المربوطة بخرز السيراميك (جدول المواد).

  1. إجراء تشريح الدماغ ومعالجة الأعضاء الطرفية.
    ملاحظة: استخدم المصابيح المكبرة لزيادة رؤية الدماغ للتشريح.
    1. نظف الأدوات الجراحية ، بما في ذلك الملقط بأطراف فائقة الدقة ، 2x مع 70٪ من الإيثانول.
    2. انقل الأدمغة المجمدة من -80 درجة مئوية إلى طبق بتري يحتوي على عازل فسيولوجي مبرد مسبقا (درجة الحموضة 5.5) تأكد من أن طبق بتري عند 4 درجات مئوية. اسمح للأدمغة بإلغاء التجميد تماما للسماح بالتشريح. اختبر بعناية باستخدام الملقط.
      تحذير: لا تبقي الأدمغة عند 4 درجات مئوية لفترة أطول مما هو مطلوب للذوبان.
    3. قم بتبريد صفيحة معدنية على الجليد (4 درجات مئوية) وقم بتغطيتها بأنسجة مبللة غارقة في المخزن الفسيولوجي البارد (الرقم الهيدروجيني 5.5) ونقل الدماغ مع الجانب البطني بعناية إلى لوحة معدنية مبردة مسبقا (4 درجات مئوية) على الجليد. قم بتغطيته بأنسجة مبللة غارقة في المخزن الفسيولوجي البارد (الرقم الهيدروجيني 5.5).
    4. تشريح مناطق الدماغ في غضون 5 دقائق كحد أقصى باستخدام ملقط طرف فائق الدقة. ابدأ بمنطقة ما تحت المهاد (HYP) وأدر الجانب الظهري لأعلى للمضي قدما في الجانب الأيمن. عزل الحصين (HCr) وقشرة الفص الجبهي (PFCr) والمخطط (STRr) والقشرة الدماغية (cCTXr). ثم تشريح الجانب الأيسر. عزل الحصين (HCl) وقشرة الفص الجبهي (PFCl) والمخطط (STRl) والقشرة الدماغية (cCTXl). تشريح المخيخ ومنطقة المهاد. استخدم المراجع التشريحية المنشورة16,17 لتحديد منطقة الدماغ.
    5. انقل كل قطعة تشريح مباشرة على لوحة معدنية مغطاة بورق الألمنيوم ومبردة مسبقا (-80 درجة مئوية). السماح بتجميد ونقل مناطق الدماغ المعزولة في أنابيب 2 مل المبردة مسبقا.
    6. سحق قطع الأنسجة باستخدام طاحن الأنسجة (عند -80 درجة مئوية) ، وتجنب ذوبان الأنسجة. في الغرفة الباردة ، مسحوق أنسجة aliquot في أنابيب استخراج ملصقة ومبردة مسبقا تحتوي على حبات السيراميك أو كرات فولاذية. لتحليل الدهون المزدوجة / النسخ ، قم بوزن مسحوق الأنسجة في الغرفة الباردة. لتحليل الدهون فقط ، اختر بين التطبيع إلى وزن الأنسجة أو محتوى البروتين. بالنسبة للأخير ، استمر في ذلك دون وزن الأنسجة.
    7. قطع أنسجة الأعضاء الطرفية في قطع بحد أقصى للوزن 20 ملغ. المضي قدما في سحق الأنسجة كما هو الحال في الخطوة 3.1.6.
    8. تابع استخراج عينات الأنسجة (انظر الخطوات 4.1.1 أو 4.1.3 أو 4.1.5) أو قم بتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لاستخراجها لاحقا.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مصفوفة الدماغ إذا سمح تصميم الدراسة بذلك. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة أكثر ملاءمة لعدد منفصل ومحدود من مناطق الدماغ ، وليس من العملي تشريح وعزل جميع مناطق الدماغ المذكورة أعلاه ضمن الإطار الزمني المحدد.
  2. أداء اللكم الدماغ.
    1. قم بتركيب الأدمغة الكاملة المجمدة على نظام التركيب (جدول المواد) في الكريستات. اضبط السماكة على 50 ميكرومتر وقم بتقطيعها إلى شرائح في وضع القطع بالقرب من المنطقة محل الاهتمام.
    2. شريحة دماغية وصمة عار (18-20 ميكرومتر) باستخدام أزرق تولويدين (0.1٪ −1٪) كمرجع لتوطين المنطقة دون الإقليمية محل الاهتمام. افحص الشرائح الملطخة باستخدام المجهر لتحديد المناطق ذات الأهمية المراد لكمها. استخدم أطلس الفأر كمرجع للعثور على المناطق التشريحية المناسبة للدماغ16. خذ اللكمات بقطر 0.8-1.0 مم باستخدام عينات من اللكمات في أنابيب مبردة مسبقا.
    3. قم بوزن اللكمات المجمدة في الغرفة الباردة في أنابيب استخراج 2 مل مبردة مسبقا تحتوي على حبات خزفية أو كرات فولاذية. استخدم أنابيب العنبر للاستخراج المشترك ل eCBs و eiCs.
    4. ابدأ الاستخراج (راجع الخطوات 4.1.1 أو 4.1.3 أو 4.1.5) أو قم بتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخراج.
  3. إجراء معالجة البلازما.
    1. ضع عينات البلازما المجمدة على الجليد (4 درجات مئوية) واتركها تذوب (~ 20 دقيقة).
    2. تأكد من أن البلازما غير مجمدة تماما قبل البدء في الاستخراج.
    3. تابع إجراء استخراج البلازما (انظر الخطوات 4.1.2 أو 4.1.4).
      ملاحظة: يجب أن تبقى عينات البلازما عند -80 درجة مئوية حتى الاستخراج. تجنب دورات الذوبان وإعادة التجميد.

4. إجراءات الاستخراج

  1. نفذ بروتوكولات الاستخراج المشترك للدهون السائلة السائلة (LLE).
    1. إجراء استخراج مشترك من eCBs و eiCs من قطع الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة.
      ملاحظة: مطلوب سحب دقيق طوال الإجراء.
      1. ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة وسبع كرات فولاذية على الجليد (4 درجات مئوية). أضف 600 ميكرولتر من MTBE المثلج البارد و 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) التي تحتوي على المعايير الداخلية. والتركيز المستهدف للمعايير الداخلية في الحجم النهائي للتحليل (50 ميكرولتر) هو كما يلي: 1 نانوغرام/مل AEA-d4، 125 نانوغرام/مل 2-AG-d5، 3000 نانوغرام/مل AA-d8، 2 نانوغرام/مل OEA-d4؛ PEA-d4 ، 12.5 نانوغرام / مل 1-AG-d5 ، 2.5 نانوغرام / مل PGF2α-d4 و 5 نانوغرام / مل ل PGD2-d4 ؛ PGE2-d9 ؛ 5(S)-HETE-d8; 12 (ق)-HETE-d8; 20-HETE-d6 ، و TXB2-d4 ، على التوالي.
      2. أضف 400 ميكرولتر من 0.1 M من حمض الفورميك وتجانس باستخدام محلل الأنسجة (30 s-1 min). جهاز طرد مركزي المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 5000 × g عند 4 درجات مئوية. اسمح بتجميد المرحلة السفلية المائية لمدة 10 دقائق عند -80 درجة مئوية لتسهيل نقل المرحلة العضوية العليا.
      3. نقل المرحلة العضوية في أنابيب جديدة. تبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية وإعادة تشكيلها في 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) لمزيد من التحليل.
      4. قم بتخزين المرحلة المائية عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمزيد من تحليل محتوى البروتين.
    2. إجراء الاستخراج المشترك ل eCBs و eiCs من عينات البلازما.
      1. إذابة البلازما aliquots عند 4 درجات مئوية. أضف 800 ميكرولتر من MTBE و 50 ميكرولتر من ACN/H2O (1:1؛ v/v) التي تحتوي على المعايير الداخلية (مماثلة لتلك المستخدمة لتحليل الأنسجة، انظر الخطوة 5.1.1). تحسين التركيز القياسي الداخلي للارتفاع باستخدام عينات البلازما المرجعية.
      2. أضف 600 ميكرولتر من 0.1 M من حمض الفورميك وعينات الدوامة عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      3. انقل الطور العضوي إلى أنابيب جديدة ، وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية ، وأعد تشكيله في 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) لتحليل LC / MRM.
        ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا ، تجنب تخزين المستخلصات المجففة من eiCs وانتقل على الفور إلى تحليل LC / MRM. إذا لم يكن من الممكن تجنب التخزين ، فلجأ إلى التخزين لفترة قصيرة لمدة 2-3 أيام فقط عند 4 درجات مئوية مع عينات في مذيب حقن LC.
    3. إجراء استخراج مشترك من PLs و eCBs من مناطق الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة الأخرى.
      1. ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة والخرز الخزفي على الجليد (4 درجات مئوية). أضف 800 ميكرولتر من MTBE/MeOH (10:3؛ v/v) و10 ميكرولتر من MeOH التي تحتوي على المعايير الداخلية. التركيز المستهدف للمعايير الداخلية في المجلد النهائي للتحليل (100 ميكرولتر) هو كما يلي: 150 نانوغرام / مل للكمبيوتر الشخصي 17: 0 / 14: 1 ، PE 17: 0 / 14: 1 ، PA 17: 0 / 14: 1 ، 100 نانوغرام / مل PG 17: 0 / 14: 1 ؛ ع 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18: 1/12: 0,1 نانوغرام / مل AEA-d4 ، 60 نانوغرام / مل 2-AG-d5 ، 4000 نانوغرام / مل AA-d8 ، 2 نانوغرام / مل OEA-d2 و 3 نانوغرام / مل PEA- d4 على التوالي.
      2. أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ من حمض الفورميك الذي يحتوي على 25 ميكرومتر رباعي هيدروليبستاتين / URB597 و 50 ميكروغرام / مل BHT. تجانس مع مجانس الأنسجة (جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
      3. استرجع المرحلة العضوية العليا في أنابيب جديدة وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية. أعد تشكيلها في 90 ميكرولتر من MeOH وإما تخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو المضي قدما في الخطوة التالية.
      4. أضف 10٪ H2O إلى أليكوت من مستخلص الدهون (4.1.3.3) وحقن 10 ميكرولتر في LC / MS لتحليل PLs. لمزيد من تحليل eCB ، تابع الخطوة 4.3.5.
      5. خذ أليكوت من المستخلص (4.1.3.3) ، وتبخر إلى الجفاف وأعد تشكيله في ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v). استخدم 20 ميكرولتر لحقن LC / MS لتحليل eCB.
    4. إجراء استخراج مشترك ل PLs و eCBs من عينات البلازما.
      1. إذابة البلازما aliquots عند 4 درجات مئوية ، إضافة 1000 ميكرولتر من MTBE / الميثانول (10: 3 ؛ v / v) و 10 ميكرولتر MeOH تحتوي على معايير داخلية (مماثلة للخطوة 4.1.3) ودوامة عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.
      2. أضف 250 ميكرولتر من H2O والدوامة لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 5000 × جم و 4 درجات مئوية. استعادة المرحلة العضوية العليا ، والتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية ، وإعادة تشكيل في 90 ميكرولتر من الميثانول لمزيد من تحليل LC / MS. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية.
      3. لتحليل PLs ، أضف 10٪ من الماء إلى أليكوت من مستخلص الدهون (4.1.2.2).
      4. لتحليل eCB ، أضف 10٪ من الماء إلى أليكوت من مستخلص الدهون (انظر 4.1.4.3) ، وتبخر إلى الجفاف ، وأعد تشكيله بنسبة 50٪ ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v).
    5. إجراء استخراج مزدوج للحمض النووي الريبي والدهون (الاستخراج المشترك ل PLs و eCBs) من عينات الأنسجة.
      تنبيه: تأكد من العمل في ظل ظروف خالية من الحمض النووي الريبي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
      1. قم بإذابة مسحوق الأنسجة أو عناقيد الدماغ (عند 4 درجات مئوية) وإضافة 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت RLT الذي يحتوي على 5 ميكرومتر THL / URB597 و 10 ميكروغرام / مل BHT و 1٪ β-mercaptoethanol (للحصول على النسب المئوية للحجم النهائي من المخزن المؤقت للتجانس ، انظر الخطوة 4.1) جنبا إلى جنب مع 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى أنابيب الاستخراج التي تحتوي على لكمات الدماغ المجمدة والخرز الخزفي.
      2. عينات سبايك مع 10 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي للاستخراج المشترك PLs و eCB (انظر الخطوة 4.1.3) وتجانس عبر مجانس الأنسجة (سرعة عالية ، 20 ثانية).
      3. انقل الليزات إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي جديدة وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة و 4 درجات مئوية لتمكين فصل الطور.
      4. استعادة واستخدام المرحلة العليا لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية (جدول المواد). الحمض النووي الريبي اللوت في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وتخزينها في -80 درجة مئوية.
        ملاحظة: العينة في الخطوة 4.1.5.4 قابلة لكل من تسلسل الحمض النووي الريبي و qPCR باستخدام الطرق والأجهزة المناسبة.
      5. استخدم المرحلة السفلية المحتوية على الكلوروفورم لاستخراج الدهون. أضف 800 ميكرولتر من MTBE / الميثانول (10: 3 ؛ v / v) و 200 ميكرولتر من 0.1٪ من حمض الفورميك والدوامة لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استرجع المرحلة العضوية العليا وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية.
      6. إعادة تشكيل في 90 ميكرولتر من الميثانول لمزيد من تحليل LC / MS. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 5.
      7. أضف 10٪ H2O إلى أليكوت من مستخلص الدهون (انظر الخطوة أعلاه 4.1.5.6) وحقن 10 ميكرولتر في LC / MS لتحليل PLs. لمزيد من تحليل eCB ، تابع الخطوة 5.7.
      8. خذ أليكوت من المستخلص (انظر الخطوة أعلاه 4.1.5.6) يتبخر إلى الجفاف ويعاد تشكيله في ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v). استخدم 20 ميكرولتر لحقن LC/MS لتحليل eCB (مماثلة للخطوة 4.3.5).

5. LC / MRM التنميط النوعي والكمي

  1. إعداد أنظمة المذيبات LC وحلول المعايرة وعينات مراقبة الجودة.
    1. بالنسبة ل PLs ، قم بإعداد المرحلة المتنقلة A: الميثانول / الماء (1: 1 ؛ v / v) التي تحتوي على 7.5 mM من تنسيق الأمونيوم و 0.1٪ TEA. تحضير المرحلة المتنقلة B: الميثانول / الأيزوبروبانول (2: 8 ؛ v / v) التي تحتوي على 7.5 mM فورمات الأمونيوم و 0.1 ٪ TEA. تخزين المذيبات في زجاجات LC.
    2. لفصل eCB و eiC ، قم بإعداد مذيبات LC التالية: 0.1٪ حمض الفورميك كمرحلة متنقلة A ، و 100٪ ACN تحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك كمرحلة متنقلة B. تخزين المذيبات في زجاجات LC.
    3. إعداد ضوابط الجودة باستخدام معايير المعايرة والمعايير الداخلية (الجدول 3) بتركيز متساوي الممول أو محدد من قبل المستخدم.
    4. قم بإعداد منحنيات المعايرة بسبع نقاط تركيز. استخدم نفس الدفعة القياسية الداخلية للارتفاع في محلول منحنى المعايرة وفي العينات المراد تحليلها.
  2. استخدم طريقة LC-MRM لتحديد ملامح الدهون النوعية والكمية.
    1. افتح علامة التبويب طريقة اكتساب الإنشاء في البرنامج التجاري (على سبيل المثال، المحلل) وحدد وضع LC/MRM مع تبديل القطبية. حدد في الطريقة التحولات الأيونية (كما هو موضح في الجدول 3) للتنميط الكمي. اضبط وقت الاستقرار على 50 مللي ثانية.
    2. بالنسبة لتوصيف PLs ، قم بتعيين معلمات مصدر الأيونات التالية: غاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة حرارة سخان المصدر = 550 درجة مئوية ؛ جهد الرش الأيوني = -4,500 فولت في وضع الأيونات السالبة و= +5,200 فولت في وضع الأيونات الموجبة.
    3. ولأغراض التحليل المشترك لل eCBs و eiCs، ضع المعلمات التالية: غاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة درجة حرارة سخان المصدر = 550 درجة مئوية ؛ جهد الرش الأيوني = -4,500 فولت في وضع الأيونات السالبة و= +4,500 فولت في وضع الأيونات الموجبة.
    4. لتحليل PL ، اضبط تسخين العمود على 45 درجة مئوية ومعدل التدفق على 200 ميكرولتر / دقيقة واضبط التدرج التالي: min 0 = 40٪ B ؛ الحد الأدنى 3 = 40٪ ب ؛ الحد الأدنى 42 = 90٪ ب ؛ الحد الأدنى 43 = 99٪ ب ؛ الحد الأدنى 50 = 99٪ B ، والحد الأدنى 52 = 40٪ B. تعيين حجم الحقن إلى 10 ميكرولتر.
    5. بالنسبة لتحليل eCBs و eiCs ، اضبط درجة حرارة العمود على درجة حرارة الغرفة واضبط التدرج التالي: min 0 = 20٪ B; الحد الأدنى 1 = 20٪ ب ؛ الحد الأدنى 5 = 50٪ B ، الحد الأدنى 12 = 50٪ B ؛ الحد الأدنى 13 = 90٪ B ، الحد الأدنى 17 = 90٪ B ؛ الحد الأدنى 17.5 = 20٪ B ؛ الحد الأدنى 20 = 20٪ B. تعيين حجم الحقن إلى 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: قد تختلف ظروف MRM بين المنصات المفيدة ، وبالتالي يجب الاستدلال على شروط التجزئة و MRM تجريبيا ويجب اختبار معلمات التأين وتعديلها إذا لزم الأمر من أجل الحصول على أقصى قدر من الحساسية والانتقائية.
  3. إجراء تحليل الدفعات.
    1. افتح دفعة اكتساب الإنشاء واملأ المعلمات المطلوبة لوصف العينة والموقع في حامل عينة أخذ العينات التلقائي وطريقة الاكتساب (تم تعيينها كخطوة 5.2).
    2. قم دائما بتضمين ضوابط الجودة في بداية التحليل ونهايته وضمن الدفعة. بعد كل 25-30 عينة، قم بتضمين ثلاثة منحنيات معايرة على الأقل داخل الدفعة وقم بتضمين خطوة غسيل مع مذيب من اختيارك بعد كل عينة لمراقبة الجودة، ومنحنى المعايرة، وفي نهاية دفعة العينة.
    3. نقل العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4 في قوارير LC/MS. ضع العينات في رفوف التحميل الخاصة بجهاز أخذ العينات التلقائي LC وفقا للموضع المحدد في الدفعة وقم بتحميل حامل العينة في جهاز أخذ العينات التلقائي LC.
    4. إرسال دفعة وبدء تحليل قائمة الانتظار.
  4. تحديد كمية الدهون
    1. استخدم البرمجيات التجارية (مثل المحلل) ووحدة القياس الكمي المضمنة للقياس الكمي ل eCBs و eiCs والبرامج التجارية (على سبيل المثال ، Multiquant) لتحديد كمي PLs.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البرنامج الحاسوبي الثاني في عمليات eCBs و eiCs ، خاصة عندما يتم استخدام معيار داخلي واحد لتحديد كمية التحليلات المتعددة.
    2. افتح طريقة القياس الكمي للبناء واملأ المعلمات الخاصة بالتحليلات والمعايير الداخلية وانتقالات MRM ونسب المعايير الداخلية إلى التحليلات المراد تحديدها كميا (الجدول 3). اضبط الحد الأدنى لارتفاع الذروة على 500 cps.
    3. استخدام المعايير التالية أو الجمع بينها لتحديد هوية الدهون والقياس الكمي اللاحق6: مطابقة وقت الاحتفاظ بالتحليلات الداخلية للدهون مع معايير المعايرة، و/أو المعايير الداخلية المحايدة، حيثما كان ذلك متاحا؛ مطابقة أيون الشظايا عن طريق تجزئة وضع الأيونات الموجبة والسالبة لتحليل معين للدهون m/z لا توجد معايير لها ؛ سلوك الاستخلاص المستنبط من الأدب للدهون في ظل ظروف LC المستخدمة بشكل مماثل لتشريح الهياكل الأيزومرية و / أو متساوي الضغط ؛ وحيثما كان ذلك متاحا، تحليل LC/MS وMS/MS مع قياس الطيف الكتلي عالي الاستبانة، باستخدام ظروف LC مماثلة للتحليل المستهدف (باستخدام LC/MRM)، لتحديد هوية الدهون الداخلية ذات الأهمية وسلوكها بدقة 18,19.
    4. للتحقق من صحة تحليل الدفعات ، استخدم المعايير التالية: دقة القياس الكمي ≤ ±20٪. معامل الانحدار ≥0.97 (من الناحية المثالية ≥0.99).
      ملاحظة: اتبع المبادئ التوجيهية لتطوير طريقة التحليل الحيوي والتحقق من صحتها لضمان تحليل موثوق به وقابل للتكرار للجزيئات المستهدفة.

النتائج

ويمكن الجمع بين مجموعة البروتوكولات الموصوفة على مستويات مختلفة بطريقة محددة الهدف، مثل اختيار النموذج الحيواني، وطريق أخذ العينات، وطريقة الاستخراج، والتنميط (الشكل 1).

من أجل تحديد التغيرات في مستوى الدهون في الدماغ و?...

Discussion

تعد منهجية الخلايا العصبية الشحمية والنسخ الموصوفة هنا وسيلة قابلة للتطبيق للتحقيق في أي مرض أو تطور صحي بدقة مكانية عالية ومنخفضة في الدماغ والأعضاء الطرفية. نظرا لإجراءات أخذ عينات البلازما ومعالجتها المحسنة ، يمكن أيضا إجراء تحليل الدهون في البلازما من نفس الحيوانات التي تم التضحية ب...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نهدي هذه المقالة إلى الدكتورة إرميليندا لومازو. أثناء الانتهاء من هذه المخطوطة، توفيت الدكتورة إرميليندا لومازو. إنها تجسيد للشغف بالعلوم والمشاركة غير الأنانية في العمل الجماعي لتحقيق غرض بحثي ذي مغزى. كانت تحلم دائما بالمساهمة بشكل هادف في تحقيق رفاهية أكبر للبشر. لم تتعرض طبيعتها الطيبة للخطر أبدا بسبب الطرق الشاقة للعلم والحياة. ستبقى لا تقدر بثمن ، وإلى الأبد ، في قلوبنا.

تم تمويل جوليا م. بوست من قبل برنامج التركيز لعلم الأعصاب الانتقالي (FTN) في المركز الطبي الجامعي التابع لجامعة يوهانس غوتنبرغ ماينز ويتم تمويله حاليا من قبل مشروع SPP-2225 EXIT إلى LB. تم تمويل ريسا ليرنر جزئيا من قبل مشروع DZHK 81X2600250 إلى LB و Lipidomics Core Facility. تم توفير تمويل جزئي لهذه الدراسات من قبل المرفق الأساسي Lipidomics ، ومعهد الكيمياء الفسيولوجية ، والأموال الداخلية (إلى LB) من المركز الطبي الجامعي بجامعة يوهانس غوتنبرغ ماينز.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25Lipid Std
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25Lipid Std
1200 series LC SystemAgilentInstrumentation/LCMS
2100 BioanalyzerAgilentInstrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cyclerApplied BiosystemsInstrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma SolvHoneywell9814920Solvent/LCMS
amber eppendorf tubesEppendorfSample Prep.
Analyst 1.6.2 SoftwareAB SCIEX, DarmstadtSoftware
Analytical balanceMettler ToledoInstrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS StandardBiomolCay-10007277Lipid Std
Bessmann Tissue PulverizerSpectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)Instrumentation/Sample prep.
BinoZeissMicroscopy
cleaved Caspase 3 antibodyCellsignaling9661SMicroscopy
Cryostat, Leica CM3050 SLeica BiosystemsInstrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosamplerCTC Analytics AGInstrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7FST11271-30Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)FST11252-00Surgical Tools
EDTA 1000 A RöhrchenKabe Labortechnik078001Sample Prep.
EP-1 EconoPumpBioRAD700BR07757Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror FinishFST11412-11Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharpFST14094-11Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straightFST14568-09Surgical Tools
Iris SpatulaeFST10094-13Surgical Tools
Kainic acidAbcamab120100Epileptic drug
Lipid View softwareAB SCIEX, DarmstadtSoftware
LPC 17:0Avanis Polaris855676PLipid Std
LPC 18:0Avanis Polaris855775PLipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC columnPhenomenex00D-4446-B0Instrumentation/LCMS
Magnifying lampMaul GmbHInstrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%Honeywell9814920Solvent/LCMS
Motic CamaraMoticMicroscopy
MTBEHoneywell34875-1LSolvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software packageAB SCIEX, DarmstadtSoftware
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo ScientificInstrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857PLipid Std
PA 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1404Lipid Std
Palmitoyl EthanolamideBiomolCay90350-100Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5BiomolCay9000573-5Lipid Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004Lipid Std
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757PLipid Std
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104Lipid Std
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457PLipid Std
PG 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1204Lipid Std
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504Lipid Std
Precelleys 24PeqlabInstrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-KügelchenPeqlab91-pcs-ck14pSample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mmPeqlab91-PCS-MK28PSample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mmVWR91-PCS-CK14Sample Prep.
Prostaglandin D2BiomolCay 12010Lipid Std
Prostaglandin D2-d4BiomolCay 312010Lipid Std
Prostaglandin E2BiomolCay10007211-1Lipid Std
Prostaglandin E2-d9BiomolCay10581-50Lipid Std
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MSAB SCIEXAU111609004Instrumentation/LCMS
Real Time PCR SystemAppliert BiosystemInstrumentation/qPCR
Resolvin D1BiomolCay10012554-11Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)Qiagen79254Sample Prep.
Security Guard precolumnPhenomenexInstrumentation/LCMS
Shandon coverplatesThermo Fisher72110017Microscopy
Shandon slide rack and lidThermo Fisher73310017Microscopy
SM 18:0Avanis Polaris860586PLipid Std
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312Lipid Std
Standard Forceps straight SmoothFST11016-17Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard PatternFST14130-17Surgical Tools
T3000 ThermocyclerBiometraInstrumentation/qPCR
Thromboxane B2BiomolCay19030-5Lipid Std
Thromboxane B2-d4BiomolCay319030-25Lipid Std
Tissue Lyser IIQiagen/ Retsch12120240804Instrumentation/Sample prep.
Tissue TekSakura Finetek4583Microscopy
ToluidinblauRoth0300.2Microscopy
VapothermBarkey4004734Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma SolvVWR9814920Solvent/LCMS

References

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved