Lipidomics e Transcriptomics em Doenças Neurológicas

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo modular para lipidômica tecidual e transcriptômica, e lipidomias plasmáticas em modelos de camundongos de doenças neurológicas que visam lipídios subjacentes à inflamação e atividade neuronal, lipídios de membrana, mensageiros a jusante e enzimas/receptores de codificação de mRNA. São delineados procedimentos de amostragem, processamento de amostras, extração e quantificação.

Resumo

Os lipídios servem como a interface primária para insultos cerebrais ou estímulos propícios a doenças neurológicas e são um reservatório para a síntese de lipídios com várias sinalizações ou função de ligantes que podem ressaltar o aparecimento e progressão de doenças. Muitas vezes mudando no nível pré-attomático, lipídios são uma fonte emergente de alvos de drogas e biomarcadores. Muitas doenças neurológicas exibem neuroinflamação, neurodegeneração e excitabilidade neuronal como marcas comuns, parcialmente moduladas por sistemas específicos de sinalização lipídica. A interdependência e inter-relação da síntese de vários lipídios leva a uma análise multilímida, multinzimida e multirreceptora, a fim de derivar as semelhanças e especificidades dos contextos neurológicos e acelerar o desenrolar de aspectos mecanicistas do início e da progressão da doença. Atribuir papéis lipídes a regiões cerebrais distintas avança na determinação do fenótipo molecular lipídeto e da morfologia associados a uma doença neurológica.

Apresentado aqui é um protocolo modular adequado para a análise de lipídios de membrana e sinais lipídes a jusante, juntamente com mRNA de enzimas e mediadores subjacentes à sua funcionalidade, extraídos de regiões cerebrais discretas que são relevantes para uma determinada doença neurológica e/ou condição. Para garantir um perfil lipidômico comparativo preciso, os fluxos de trabalho e os critérios operacionais foram otimizados e padronizados para: i) amostragem cerebral e dissecção de regiões de interesse, ii) co-extração de múltiplos sinais lipídicos e lipídios de membrana, iii) extração lipídica/mRNA dupla, iv) quantificação por monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida (LC/MRM) e v) perfil de mRNA padrão. Este fluxo de trabalho é favorável às baixas quantidades teciduais obtidas pela amostragem das sub-regiões cerebrais funcionalmente discretas (ou seja, por perfuração cerebral), impedindo assim o viés na análise multimolecular devido à heterogeneidade tecidual e/ou variabilidade animal. Revelar consequências periféricas de doenças neurológicas e estabelecer leituras moleculares translacionais de estados de doenças neurológicas, amostragem de órgãos periféricos, processamento e sua análise lipidómica subsequente, bem como lipidómica plasmática, também são perseguidos e descritos. O protocolo é demonstrado em um modelo agudo de camundongos de epilepsia.

Introdução

Avanços recentes na função dos lipídios e seu papel no surgimento e progressão de doenças neurológicas abrem novos locais de pesquisa e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e elucidação de mecanismos de ^doença1. Diferenças documentadas na composição lipídica em diferentes regiões cerebrais, enfatizadas por técnicas modernas de imagem molecular, como imagem de espectrometria de massa e perfil avançado de espectrometria de massa, muda o paradigma da investigação lipídica de todo o cérebro para regiões cerebrais funcionalmente distintas e discretas. O fato de que a composição lipídica varia em diferentes regiões cerebrais leva a nova conceituação tanto da sensibilidade lipídica da membrana quanto da sinalização lipídica a jusante em resposta a um insulto cerebral ou estímulos através das regiões cerebrais funcionalmente distintas. Assim, os protocolos lipídes exigem novos desenvolvimentos para enfrentar o desafio de baixas quantidades teciduais para maior detecção e quantificação de resolução espacial, e, simultaneamente, análise de múltiplos componentes lipídides de membranas celulares e vias de sinalização. Além disso, a determinação de enzimas, ligantes lipídicos e receptores envolvidos na regulação de seus níveis e funções é primordial para elucidar as vias de sinalização afetadas em uma doença neurológica e orientar novas investigações mecanicistas em um contexto fisioterológico.

Além do aumento da resolução espacial cerebral, há duas grandes dificuldades que desafiam o desenvolvimento de novas abordagens neurolipdómicas. Primeiro, as moléculas de sinalização lipídica são tipicamente de baixa abundância em comparação com lipídios constitutivos de membrana. Em segundo lugar, o lipidome apresenta uma alta heterogeneidade estrutural, difícil de dissecar usando uma única abordagem analítica. Assim, os métodos de extração e analítica são adaptados a diferentes categorias lipídicas e comumente realizados em amostras de tecidos distintos². Métodos lipídmicos de espingarda³ são excelentes ferramentas para revelar rapidamente um amplo perfil de lipídios de membrana, enquanto o aumento da sensibilidade e seletividade proporcionados pela descoberta e quantificação de massa spectrométricas são capitalizados para a investigação de lipídios de sinalização de baixa oferta, incluindo: i) lipídios inflamatórios e ii) lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como endocanabinóides (eCBs), lipídios ligados a amino- etc.^4,5. Para abranger alterações lipídicas tanto na membrana celular quanto no nível de sinalização ocorrendo em regiões cerebrais de modelos de doenças neurológicas, tipicamente a extração e análise lipídica são realizadas em amostras de tecidos distintos, obtidas de diferentes lotes animais ou de diferentes hemisférios, ou dissecando uma região de tecido maior em múltiplos pedaços. Quando os níveis de mRNA de receptores enzimáticos também são de interesse, sua investigação normalmente requer a aquisição de uma amostra de tecido distinta. Por exemplo, a investigação de lipídios de membrana, canabinoides endógenos e mRNA exigiria três amostras diferentes de tecido, (por exemplo, duas amostras para os dois métodos de extração lipídica-lipídios-lipídios e lipídios de sinalização - e subsequentes dois métodos de análise lipídica - e uma amostra para análise mRNA). A investigação de lipídios inflamatórios e canabinoides endógenos requerem duas amostras de tecido distintas, métodos de extração e métodos de análise, respectivamente. Outro exemplo é a investigação de mRNA e de qualquer categoria lipídica em uma amostra de perfuração cerebral ou microdissecção a laser que, consequentemente, requer dois animais distintos para obter duas amostras por cérebro (sub)região. Uma extensão substancial de variabilidade e/ou baixa reprodutibilidade dos resultados ocorre frequentemente nesses casos, originária de variabilidade biológica e/ou heterogeneidade tecidual. Guiado por essas limitações práticas da análise multimolecular, ocorrendo particularmente em alta resolução espacial no cérebro, foi projetado um protocolo de neurolipidomia de três módulos englobando: 1) coextração e co-análise por LC/MRM de lipídios inflamatórios (por exemplo, eicosanoides (EI)) e lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como eCBs²; 2) co-extração de fosfolipídios (PLs) e eCBs com análise subsequente de LC/MRM multiscan e análise de varredura de perdas precursoras/neutras²; e 3) extração dupla de membrana (fosfo)lipídios e eCBs, bem como mRNA, com análise subsequente de sequenciamento de LC/MRM e qPCR ou RNA⁶. Dependendo da questão biológica a ser abordada em uma doença neurológica e na região de interesse cerebral, uma combinação do primeiro e do segundo protocolo, ou o primeiro e o terceiro protocolo, podem ser aplicados na mesma amostra de tecido para tecidos que pesam cerca de 4 mg. O primeiro e o terceiro protocolos podem ser aplicados independentemente para tecidos em torno de 2 mgs. O segundo protocolo pode ser aplicado para tecidos pesando apenas 0,5 mgs. Independentemente do módulo de protocolo neurolipdidomático selecionado, a amostragem de tecidos e processamento pré-analítico, o isolamento cerebral e a dissecção da região, bem como o procedimento para o sacrifício do modelo animal são padronizados e idênticos para os três módulos do protocolo. Em nossa investigação de doenças neurológicas, órgãos periféricos relevantes para as consequências patológicas da doença também são sempre coletados e analisados por meio desses protocolos modulares. Além disso, o sangue é regularmente amostrado para lipidomia plasmática para servir como uma ferramenta de leitura de doenças neurológicas com uma visão sobre aplicações translacionais prospectivas. O protocolo de lipidomia modular aqui apresentado é muito versátil: escalável a maiores quantidades de tecido e facilmente aplicável para praticamente qualquer tipo de tecido e doença. Para a aplicação do protocolo modular (Figura 1), em doenças neurológicas, qualquer modelo padronizado de início e progressão de distúrbios neurológicos, como lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou epilepsia são amenáveis.

Esses protocolos têm sido extensivamente aplicados para estudar alterações no lipidome tecidual e/ou transcriptome na fase aguda da epilepsia no modelo de camundongo induzido por ácido kainico (KA) de ^epilepsia2,7, um modelo amplamente utilizado em estudos pré-clínicos devido à semelhança com a epilepsia do lobo temporal humano (TLE)^8,9,10,11. Utilizando esses protocolos, o potencial terapêutico de drogas como Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 foi avaliado no mesmo modelo de camundongos de epilepsia. O estudo identificou alterações lipídicas e mRNA em alta e baixa resolução espacial no cérebro e na periferia, no ponto de tempo de intensidades máximas agudas de convulsão aguda (em 60 min de indução pós-doutorado), e sobre o tratamento subcrônico e agudo com PEA em quatro pontos de tempo diferentes (20, 60, 120 e 180 min) pós-indução de convulsão ka, uma janela de tempo cobrindo a fase aguda de epilepsia. Foram coletados em cada momento os camundongos injetados por KA, camundongos tratados com PEA, agudos e subchamados, bem como camundongos de controle de veículos e veículos pea, coletados em cada ^ponto12,13, e investigados com essa análise molecular. Os dados moleculares foram correlacionados com fenótipos comportamentais obtidos pela pontuação de convulsões, bem como com dados derivados da imunohistoquímica em processos neurodegenerative, a fim de desvendar a progressão da fase aguda de epilepsia e o potencial do PEA para aliviá-lo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais aqui descritos estão de acordo com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 22 de Setembro de 2010 (2010/63EU) e foram aprovados pelo comitê local de animais da Renânia-Palatinado do estado da Alemanha (referência de arquivo: 23 177-07/G16-1-075).

1. Modelo animal de epilepsia induzida por KA aguda e profilaticamente tratada

1. Realizar indução de convulsão, tratamento e pontuação comportamental.
   1. Camundongos separados (n mínimo = 6 ratos por grupo) em gaiolas simples.
   2. Prepare a solução de injeção de indução de convulsão e o veículo correspondente (ver Tabela 1), bem como a solução de injeção de tratamento e o veículo correspondente (ver Tabela 2).
   3. Injete camundongos intraperitoneal (i.p.) (massa corporal de camundongos de 10 mL/kg) sem anestesia de acordo com sua identidade de grupo: doença, tratamento ou veículo tratado (ou seja, KA, KA tratado com PEA e os dois grupos de veículos). Veja Figura 2, Tabela 1 e Tabela 2.
   4. Monitorar e pontuar o comportamento de acordo com a seguinte escala padronizada de intensidade de convulsão: 0 = nenhuma resposta; 1 = imobilidade e olhar; 2 = extensão de membro dianteiro e/ou cauda, postura rígida; 3 = movimentos repetitivos, balançando a cabeça; 4 = criação e queda; 5 = criação contínua e queda; 6 = convulsões clonic-tônicas graves; 7 = ^óbito14,15 (Figura 3).
2. Realizar procedimento de sacrifício para análise lipódica e transcriômica.
   1. Em quatro momentos (ou seja, 20, 60, 120 e 180 min pós ka- ou injeção de veículo, respectivamente), sacrificar seis camundongos de cada um dos seguintes grupos: PEA tratado, veículo epiléptico não tratado de PEA e veículo 2, seguindo protocolos aprovados pela IACUC.
   2. Dez segundos após cada ponto de tempo ser atingido, anestesia os ratos usando um tecido encharcado de isoflurano em uma câmara de vidro. Confirme a anestesia pela perda do reflexo de direito, indicado pela incapacidade de se mover enquanto lentamente derruba a câmara de vidro. Decapitar camundongos usando tesouras cirúrgicas e coletar órgãos plasmádricas, cerebrais e periféricos (ver passos 2.2.2−2.2.4).
      ATENÇÃO: As normas éticas para o sacrifício de procedimentos variam entre os comitês locais de animais. Certifique-se de verificar e seguir as normas emitidas pelo comitê local de animais.
3. Siga o procedimento de sacrifício para análise imunohistoquímica.
   1. Para coloração imunohistoquímica13, escore comportamentalmente três camundongos de cada um dos seguintes grupos: TRATADO COM ERVILHA, epilepsia não tratada de ERVILHA e grupos de veículos, durante todo o curso de tempo (180 min).
   2. Sacrifício e persuso ratos 5 dias depois. Camundongos profundamente anestesiados (ver passo 1.3.1 para os grupos de camundongos) por injeção de i.p. de pentobarbital (100 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) como drogas entorpecentes. Confirme anestesia profunda pela perda de reflexo entre os dedo dos dedo.
   3. Fixar o mouse em uma placa de poliestireno e abra imediatamente o tórax usando tesouras finas e fórceps padrão. Coloque a borboleta no ventrículo do coração esquerdo e corte o átrio direito usando uma tesoura fina.
   4. Ajuste a velocidade e a pressão da bomba para um fluxo peristáltico constante com uma taxa de 2-3 mL/min. Perfuse com salina tamponada de fosfato gelado (PBS) por ~5 min. Se necessário, substitua a borboleta.
      NOTA: Com a perfusão adequada, os órgãos internos (exceto o baço) começam a clarear dentro de 1-2 min.
   5. Troque a perfusão para a solução de paraformaldeído (PFA) por ~5 min. Isole cérebros inteiros como descrito na etapa 2.2.2 e fixe por 24 h em solução PFA de 4% a 4 °C.
   6. Incubar cérebros em solução de sacarose de 30% por 48 h a 4 °C. Remova a sacarose restante com um papel de tecido seco e congele o cérebro em uma placa de metal (-80 °C). Armazene os cérebros a -80 °C para os procedimentos de ^{coloração13}.

2. Procedimentos amostrais para análise lipódica/transcriômica

1. Preparem-se para a amostragem.
   1. Tubos EDTA pré-cozidos para amostragem de plasma a 4 °C. Pré-, pré-cure o aparelho centrífuga e vórtice a 4 °C. Pré-consulte a placa metálica coberta com papel alumínio (para quebrar cérebro congelado e/ou outros tecidos de interesse) em gelo seco (-80 °C). Pré-doença os tubos rotulados de 2 mL e 5 mL em gelo seco (-80 °C) para alíquotas de plasma, tecido congelado e coleta cerebral, respectivamente. Use tubos âmbar para proteger moléculas sensíveis à luz, como os EICs.
   2. Limpe o equipamento de amostragem e isolamento de tecidos (tesoura cirúrgica, tesoura fina e reta, fórceps lisos e lisos, fórceps finos com acabamento espelho, fórceps e espátula curvas, placa de espuma de poliestireno e agulhas para fixação) com um desinfetante (por exemplo, 70% de etanol).
2. Protocolos de amostragem
   1. Determine a ordem de amostragem.
      1. Coletar sangue imediatamente após a decapitação em tubos EDTA pré-cozidos de 1 mL (ver passo 2.2.3).
      2. Remova todo o cérebro e estoize imediatamente após a remoção. Este passo levará 1-2 min. Armazene cérebros congelados a -80 °C para processamento posterior (ver etapa 2.2.2).
      3. Remova órgãos periféricos de interesse (por exemplo, pulmão, coração, fígado), dentro de 5 minutos após a remoção cerebral, e congele e armazene a -80 °C para processamento posterior (ver passo 2.2.4).
   2. Remova o cérebro para dissecção ou procedimentos de perfuração. Este procedimento leva 1-2 min/cérebro.
      1. Após a decapitação (ver passo 1.2), comece a fazer uma incisão midline na pele usando uma tesoura fina. Liberte o crânio virando a pele sobre os olhos. Alcance o topo do crânio e faça uma pequena incisão caudal começando ao nível do osso intraparietal. Evite cortar o cérebro.
      2. Corte firmemente através da parte mais anterior do crânio entre os olhos para facilitar a remoção cerebral. Incline um lado do osso parietal usando fórceps de padrão estreito curvo e roma. Repita o último passo para o outro lado.
      3. Remova as meninges cerebrais. Deslize uma espátula sob a parte anterior do cérebro (ou seja, a lâmpada olfativa) e incline o cérebro suavemente para cima. Deslize a espátula mais para baixo para quebrar a óptica e outros nervos cranianos.
      4. Levante o cérebro do crânio e encaixe congelar todo o cérebro imediatamente em uma placa de metal pré-córquica (-80 °C) com o lado ventral voltado para a placa metálica (dorsal para cima).
      5. Permita que os cérebros congelem completamente e transfiram em tubos pré-cozidos de 5 mL e armazene a -80 °C até a dissecação das regiões cerebrais ou o procedimento de perfuração (ver passos 3.1. e 3.2).
   3. Realize a amostragem de plasma.
      1. Pico pré-cozido EDTA-tubos com 10 μL de indometacina-diluição recém-preparada para uma concentração alvo de 10 μM.
      2. Colete o sangue do tronco imediatamente após a decapitação, apertando suavemente o corpo em tubos EDTA pré-cozidos a um volume máximo de sangue de 1 mL.
         NOTA: Em caso de pressão arterial adequada, não é necessário apertar. Se o volume sanguíneo for inferior a 1 mL, diminua o tempo de incubação de isoflurane para permitir o fluxo sanguíneo adequado.
      3. Imediatamente centrifugar tubos sanguíneos a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
      4. Remova a fase plasmática superior resultante e com a finalidade de análise multilímida aliquot volumes de plasma definidos em tubos pré-cozidos de 2 mL da seguinte forma: 50 μL para análise de eCBs/eiCs, 30 μL para análise de PLs e o volume de plasma restante como a amostra de backup ou para outros tipos de análise.
      5. Armazene as amostras de plasma a -80 °C para extração posterior (ver etapas 4.1.2 e 4.1.4).
   4. Realizar amostragem periférica de órgãos.
      NOTA: Use referências de anatomia do ^camundongo16 e documentação prevista para os cursos obrigatórios (FELASA) com a presença de pesquisadores de animais para identificar os órgãos individuais, seus tecidos conjuntivos e/ou vasos sanguíneos.
      1. Imobilize o tronco do rato para facilitar a remoção dos órgãos usando agulhas. Faça uma incisão de linha média ventral usando uma tesoura afiada na altura do púbis. Use fórceps padrão contundentes para fixar a parede abdominal enquanto corta para abrir a cavidade abdominal.
      2. Imobilize a pele para permitir a remoção de órgãos abdominais usando fórceps contundentes. Para a remoção do coração ou pulmão, continue o corte medial na direção da caverna do peito. Remova o pulmão e/ou o coração usando fórceps finos.
      3. Abra a cavidade do peito cuidadosamente para evitar sangramento. Corte os tecidos conjuntivos e vasos sanguíneos ancorando o respectivo órgão sem cortar através do órgão.
      4. Transfira imediatamente peças de tecido em placas metálicas pré-identificadas (-80 °C) e deixe congelar completamente. Transfira peças de tecido para tubos pré-cozidos e armazene a -80 °C para processamento posterior (ver etapa 4.1).

3. Processamento de material biológico

NOTA: Para a co-extração de eCBs/eiCs use tubos âmbar de 2 mL como tubos de extração e adicione em cada tubo sete bolas de aço pré-cozidos. Para a co-extração de PLs/eCBs e para dupla extração lipídica e RNA, utilize 2 mL de tubos de extração sem RNAse cravados com contas de cerâmica (Tabela de Materiais).

1. Realizar dissecção cerebral e processamento de órgãos periféricos.
   NOTA: Use lâmpadas de ampliação para aumentar a visibilidade do cérebro para dissecção.
   1. Limpe as ferramentas cirúrgicas, incluindo os fórceps com pontas super finas, 2x com 70% de etanol.
   2. Transfira os cérebros congelados de -80 °C para uma placa de Petri contendo tampão fisiológico pré-cozido (pH 5.5) Certifique-se de que a placa de Petri está a 4 °C. Permita que os cérebros descongelem completamente para permitir a dissecção. Teste cuidadosamente usando fórceps.
      ATENÇÃO: Não mantenha os cérebros a 4 °C a mais do que o necessário para descongelar.
   3. Pré-enrole uma placa metálica no gelo (4 °C) e cubra-a com tecidos molhados embebidos em tampão fisiológico gelado (pH 5.5) e transfira o cérebro com o lado ventral para cima cuidadosamente em uma placa de metal pré-cozido (4 °C) no gelo. Cubra-o com tecidos molhados embebidos em tampão fisiológico gelado (pH 5,5).
   4. Disseque regiões cerebrais dentro de um máximo de 5 minutos usando fórceps de ponta super finas. Comece com o hipotálamo (HYP) e gire o lado dorsal para continuar com o lado direito. Isolar o hipocampo (HCr), córtex pré-frontal (PFCr), estriato (STRr) e córtex cerebral (cCTXr). Em seguida, dissecar o lado esquerdo. Isolar o hipocampo (HCl), córtex pré-frontal (PFCl), estriatum (STRl) e córtex cerebral (cCTXl). Disseque o cerebelo e a região talâmica. Uso de referências anatômicas ^{publicadas16,17} para identificação de região cerebral.
   5. Transfira cada peça dissecada diretamente em uma placa metálica pré-identificada coberta de papel alumínio (-80 °C). Permitir o congelamento e transferir as regiões cerebrais isoladas nos tubos de 2 mL pré-cozidos rotulados.
   6. Pulverize os pedaços de tecido usando um pulverizador de tecido (a -80 °C), evitando o descongelamento do tecido. Na sala fria, pó de tecido aliquot em tubos de extração rotulados e pré-cozidos contendo contas de cerâmica ou bolas de aço. Para a análise lipidômica/transcriômica dupla, pese as alíquotas de pó de tecido na sala fria. Para análise apenas lipidômica, escolha entre a normalização até o peso tecidual ou o teor de proteína. Para este último, prossiga ainda mais sem pesagem tecidual.
   7. Corte os tecidos do órgão periférico em pedaços com um peso máximo de 20 mgs. Prossiga com a pulverização tecidual como na etapa 3.1.6.
   8. Prossiga com a extração de amostras de tecido (ver etapas 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou armazenar tubos a -80 °C para extração posterior.
      NOTA: A matriz cerebral também pode ser usada se o projeto do estudo permitir. No entanto, o método é mais adequado para um número discreto e limitado de regiões cerebrais, e não é prático dissecar e isolar todas as regiões cerebrais acima mencionadas dentro do prazo estabelecido.
2. Faça socos cerebrais.
   1. Monte todo o cérebro congelado no sistema de montagem (Tabela de Materiais) no criostat. Ajuste a espessura para 50 μm e corte no modo de corte perto da região de interesse.
   2. Mancha de corte cerebral (18-20 μm) usando azul toluidina (0,1%-1%) como referência para localização da sub-região de interesse. Inspecione as fatias manchadas usando um microscópio para identificar as regiões de interesse a serem perfuradas. Use um atlas de rato como referência para encontrar as regiões anatômicas cerebrais ^{apropriadas16}. Leve socos com um diâmetro de 0,8−1,0 mm usando corers de amostra em tubos pré-cozidos.
   3. Pesar socos congelados na sala fria em tubos de extração de 2 mL pré-cozidos, com contas de cerâmica ou bolas de aço. Use tubos âmbar para eCBs e co-extração de EICs.
   4. Inicie a extração (ver etapas 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou armazene tubos a -80 °C para extração posterior.
3. Realize o processamento de plasma.
   1. Coloque as amostras de plasma congelado no gelo (4 °C) e deixe-as descongelar (~20 min).
   2. Certifique-se de que o plasma está totalmente descongelado antes de iniciar a extração.
   3. Proceda com o procedimento de extração plasmática (ver etapas 4.1.2 ou 4.1.4).
      NOTA: As amostras de plasma devem permanecer a -80 °C até a extração. Evite ciclos de descongelamento e recongelamento.

4. Procedimentos de extração

1. Realize protocolos de co-extração lipídica líquido-líquido (LLE).
   1. Realize a co-extração de eCBs e EICs de pedaços cerebrais, socos ou amostras de pó de tecido.
      NOTA: É necessária uma tubulação precisa durante todo o procedimento.
      1. Coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e sete bolas de aço no gelo (4 °C). Adicione 600 μL de MTBE gelado e 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) contendo as normas internas. A concentração-alvo das normas internas no volume final para análise (50 μL) é a seguinte: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 e 5 ng/mL para PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 e TXB2-d4, respectivamente.
      2. Adicione 400 μL de ácido fórmico de 0,1 M e homogeneize com um liser tecidual (30 s-1 min). Centrifugar o homogeneizar por 15 min a 5.000 x g a 4 °C. Permita o congelamento da fase inferior aquosa por 10 min a -80 °C para facilitar a transferência da fase orgânica superior.
      3. Transfira a fase orgânica em novos tubos. Evaporar sob um fluxo suave de _N2 a 37 °C e reconstituir em 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) para análise posterior.
      4. Armazene a fase aquosa a -20 °C ou -80 °C para análise adicional de teor de proteínas.
   2. Realizar a co-extração de eCBs e EICs a partir de amostras de plasma.
      1. Degelo de alíquotas de plasma a 4 °C. Adicionar 800 μL de MTBE e 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) contendo as normas internas (análogas às utilizadas para análise de tecidos, ver o passo 5.1.1). Otimize a concentração padrão interna para espetar usando amostras de plasma de referência.
      2. Adicione 600 μL de 0,1 M de ácido fórmico e amostras de vórtice a 4 °C por 2 min. Centrífuga amostras a 4.000 x g para 15 min a 4 °C.
      3. Transfira a fase orgânica para novos tubos, evapore sob um fluxo suave de _N2 a 37 °C e reconstitua em 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) para análise LC/MRM.
         NOTA: Se possível, evite o armazenamento de extratos secos de eiCs e prossiga imediatamente para análise LC/MRM. Se o armazenamento não puder ser evitado, recorra ao armazenamento de curto prazo por apenas 2-3 dias a 4° C com amostras em solvente de injeção de LC.
   3. Realizar a co-extração de PLs e ECBs de regiões cerebrais, socos ou outras amostras de pó de tecido.
      1. Coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e as contas cerâmicas no gelo (4 °C). Adicione 800 μL de MTBE/MeOH (10:3; v/v) e 10 μL de MeOH contendo as normas internas. A concentração alvo das normas internas no volume final para análise (100 μL) é a seguinte: 150 ng/mL para PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 e 3 ng/mL PEA-d4, respectivamente.
      2. Adicione 200 μL de ácido fórmico de 0,1% contendo 25 μM tetrahidrolipstatina/URB597 e 50 μg/mL BHT. Homogeneize-se com o homogeneizador de tecido (Tabela de Materiais) e centrífuga a 5.000 x g e 4 °C por 15 min.
      3. Recupere a fase orgânica superior em novos tubos e evapore sob um fluxo suave de _N2 a 37 °C. Reconstitua em 90 μL de MeOH e armazene a -20 °C ou -80 °C ou proceda com o próximo passo.
      4. Adicione 10% de _H2O a uma alíquota de extrato lipídudo (4.1.3.3) e injete 10 μL na LC/MS para análise de PLs. Para posterior análise do ECB proceda com a etapa 4.3.5.
      5. Tome uma alíquota do extrato (4.1.3.3), evaporar até o ressecamento e reconstituir em ACN/_H2O (1:1; v/v). Use 20 μL para injeção de LC/MS para análise de eCB.
   4. Realizar a co-extração de PLs e eCBs a partir de amostras de plasma.
      1. Alíquotas de plasma degelo a 4 °C, adicione 1.000 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) e 10 μL MeOH contendo padrões internos (análogo ao passo 4.1.3) e vórtice a 4 °C por 1 min.
      2. Adicione 250 μL de _H2O e vórtice por 45 min a 4 °C. Amostras centrífugas para 15 min a 5.000 x g e 4 °C. Recupere a fase orgânica superior, evapore sob um fluxo suave de _N2 a 37 °C e reconstitua em 90 μL de metanol para posterior análise de LC/MS. Armazene a -20 °C ou -80 °C ou prossiga para a próxima etapa.
      3. Para análise de PLs, adicione 10% de água a uma alíquota de extrato lipíduo (4.1.2.2).
      4. Para análise do ECB, adicione 10% de água a uma alíquota do extrato lipídico (ver 4.1.4.3), evaporar até o ressecamento e reconstituir em 50% ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Realizar extração dupla de RNA e lipídios (co-extração de PLs e eCBs) a partir de amostras de tecido.
      ATENÇÃO: Certifique-se de trabalhar em condições livres de RNA para evitar a degradação do RNA.
      1. Descongelar alíquotas em pó de tecido ou cachos cerebrais (a 4 °C) e adicionar 600 μL de tampão RLT contendo 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT, e 1% β-mercaptoetanol (para percentuais do volume final de tampão de homogeneização, ver passo 4.1) juntamente com 200 μL de clorofórmio para tubos de extração contendo socos cerebrais congelados e contas cerâmicas.
      2. Amostras de espeto com 10 μL de mistura padrão interna para PLs e co-extração eCB (ver passo 4.1.3) e homogeneizar via homogeneizador de tecido (alta velocidade, 20 s).
      3. Transfira os linfásis para novos tubos de centrífugas e centrífugas por 5 minutos a toda velocidade e 4 °C para permitir a separação da fase.
      4. Recuperar e utilizar a fase superior para extração de RNA utilizando kits de procedimento de extração de RNA padrão (Tabela de Materiais). Elute RNA em um volume total de 50 μL de água sem RNase e armazenar a -80 °C.
         NOTA: A amostra na etapa 4.1.5.4 é favorável tanto para o sequenciamento de RNA quanto para qPCR utilizando os métodos e instrumentação apropriados.
      5. Use a fase de contenção de clorofórmio inferior para extração lipídica. Adicione 800 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) e 200 μL de ácido fórmico e vórtice de 0,1% para 45 min a 4 °C. Recupere a fase orgânica superior e evapore sob um fluxo suave de _N2 a 37 °C.
      6. Reconstituir em 90 μL de metanol para análise suplementar de LC/MS. Armazene a -20 °C ou -80 °C ou proceda à etapa 5.
      7. Adicione 10% de _H2O a uma alíquota de extrato lipídudo (veja acima do passo 4.1.5.6) e injete 10 μL na LC/MS para análise de PLs. Para posterior análise do ECB proceda com a etapa 5.7.
      8. Faça uma alíquota do extrato (veja acima do passo 4.1.5.6) evaporar até o ressecamento e reconstituir em ACN/_H2O (1:1; v/v). Use 20 μL para injeção de LC/MS para análise de eCB (análogo à etapa 4.3.5).

5. Perfil qualitativo e quantitativo LC/MRM

1. Prepare sistemas de solventes LC, soluções de calibração e amostras de controle de qualidade.
   1. Para PLs, prepare a fase móvel A: metanol/água (1:1; v/v) contendo formato de amônio de 7,5 mM e 0,1% TEA. Prepare a fase móvel B: metanol/isopropanol (2:8; v/v) contendo formato de amônio de 7,5 mM e 0,1% TEA. Armazene solventes em garrafas LC.
   2. Para separação eCB e eiC, prepare os seguintes solventes LC: 0,1% ácido fórmico como fase móvel A e 100% ACN contendo ácido fórmico de 0,1% como fase móvel B. Armazene solventes em garrafas LC.
   3. Prepare os controles de qualidade utilizando as normas de calibração e normas internas (Tabela 3) em uma concentração equimolar ou definida pelo usuário.
   4. Prepare curvas de calibração com sete pontos de concentração. Use o mesmo lote padrão interno para cravar na solução da curva de calibração e em amostras a serem analisadas.
2. Use o método LC-MRM para perfil lipídudo qualitativo e quantitativo.
   1. Abra a guia Método de Aquisição de Compilação no software comercial (por exemplo, Analista) e selecione o modo LC/MRM com comutação de polaridade. Coloque no método as transições de íon (conforme dado na Tabela 3) para o perfil quantitativo. Estabeleça tempo de assentamento para 50 ms.
   2. Para o perfil dos PLs, defina os seguintes parâmetros de fonte de íon: gás de cortina = 40 psi; temperatura do aquecedor de origem = 550 °C; tensão de spray de íon = -4.500 V no modo íon negativo e = +5.200 V no modo íon positivo.
   3. Para co-análise de eCBs e eiCs, defina os seguintes parâmetros: gás de cortina = 40 psi; temperatura do aquecedor de origem = 550 °C; tensão de spray de íon = -4.500 V no modo íon negativo e = +4.500 V no modo íon positivo.
   4. Para análise de PL, defina o aquecimento da coluna para 45 °C e a vazão para 200 μL/min e defina o seguinte gradiente: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B, e min 52 = 40% B. Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
   5. Para análise de eCBs e eiCs, defina a temperatura da coluna à temperatura ambiente e defina o seguinte gradiente: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Ajuste o volume de injeção para 20 μL.
      NOTA: As condições de MRM podem variar entre plataformas instrumentais, portanto, as condições de fragmentação e MRM devem ser inferidas experimentalmente e os parâmetros de ionização devem ser testados e ajustados, se necessário, a fim de obter a máxima sensibilidade e seletividade.
3. Realize a análise em lote.
   1. Abra o lote build acquisition e preencha os parâmetros necessários para a descrição da amostra, localização no rack de amostra do autosampler e método de aquisição (definido como etapa 5.2).
   2. Inclua sempre controles de qualidade no início e no final da análise e dentro do lote. Após cada 25-30 amostras, inclua pelo menos três curvas de calibração dentro do lote e inclua uma etapa de lavagem com um solvente de escolha após cada amostra de controle de qualidade, curva de calibração e no final do lote de amostra.
   3. Transferir amostras obtidas na etapa 4 em frascos de LC/MS. Coloque as amostras nos racks de carregamento do autosampler LC de acordo com a posição definida no lote e carregue o rack de amostra no autosampler LC.
   4. Envie o lote e inicie a análise da fila.
4. Quantificação lipídica
   1. Use o software comercial (por exemplo, Analista) e o módulo de quantificação embarcada para quantificação de eCS e eiCs quantificação e software comercial (por exemplo, Multiquant) para quantificação de PLs.
      NOTA: O segundo software também pode ser usado para eCBs e eiCs, especialmente quando um padrão interno é usado para a quantificação de vários analitos.
   2. Abra o Método de Quantificação da Construção e preencha os parâmetros para analitos, normas internas, transições mrm e atribua as normas internas aos analitos a serem quantificados (Tabela 3). Ajuste a altura mínima de pico para 500 cps.
   3. Use os seguintes critérios ou combinações para atribuição de identidade lipídica e quantificação ^subsequente6: correspondência de tempo de retenção de analitos endógenos lipídes com padrões de calibração e/ou padrões internos deuterados, quando disponíveis; fragmentação do modo íon positivo e negativo para uma dada m/z de analitos lipídicos para os quais não são fornecidas normas; comportamento de elução inferido pela literatura de lipídios sob condições de LC utilizadas da mesma forma para dissecar estruturas isomericas e/ou isobáricas; e, quando disponível, análise de LC/MS e MS/MS com espectrometria de massa de alta resolução, utilizando condições semelhantes de LC como para análise direcionada (utilizando LC/MRM), para identificar com precisão o comportamento de identidade e eluição de lipídios endógenos de ^{interesse18,19}.
   4. Para validação da análise do lote, utilize os seguintes critérios: exatidão da quantificação ≤ ±20%; coeficiente de regressão ≥0,97 (idealmente ≥0,99).
      NOTA: Siga as diretrizes para o desenvolvimento e validação de métodos bioanálíticos para garantir uma análise confiável e reprodutível das moléculas-alvo.

Resultados

O conjunto de protocolos descritos pode ser combinado em diferentes níveis de forma específica do objetivo, como escolha de modelo animal, rota de amostragem, método de extração e perfil (Figura 1).

A fim de determinar mudanças lipídicas no cérebro e na periferia ao longo de um curso de tempo de um estado de convulsão epiléptica aguda e para desvendar o potencial efeito antiepiléptico13 d...

Discussão

A metodologia neurolipidômica e transcriômica descrita aqui é uma média viável para investigar qualquer doença ou desenvolvimento saudável em alta e baixa resolução espacial no cérebro e órgãos periféricos. Devido aos procedimentos otimizados de amostragem e manuseio de plasma, a análise lipidômica plasmática também pode ser realizada a partir dos mesmos animais sacrificados por lipidemia tecidual e transcrição, melhorando assim a confiabilidade dos correlatos moleculares do sangue tecidual e da descob...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS