Lipidomica e trascrittomica nelle malattie neurologiche

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo modulare per la lipidomica e la trascrittomica tissutale e la lipidomica plasmatica in modelli murini di malattie neurologiche che mirano ai lipidi sottostanti l'infiammazione e l'attività neuronale, i lipidi di membrana, i messaggeri a valle e gli enzimi / recettori che codificano per l'mRNA alla base della funzione lipidica. Vengono delineate le procedure di campionamento, elaborazione dei campioni, estrazione e quantificazione.

Abstract

I lipidi fungono da interfaccia primaria per insulti cerebrali o stimoli favorevoli alle malattie neurologiche e sono un serbatoio per la sintesi dei lipidi con varie funzioni di segnalazione o ligando che possono sottolineare l'insorgenza e la progressione delle malattie. Spesso cambiando a livello presintomatico, i lipidi sono una fonte emergente di bersagli farmacologici e biomarcatori. Molte malattie neurologiche presentano neuroinfiammazione, neurodegenerazione ed eccitabilità neuronale come segni distintivi comuni, in parte modulati da specifici sistemi di segnalazione lipidica. L'interdipendenza e l'interrelazione della sintesi di vari lipidi richiede un'analisi multilipidica, multienzimatica e multirecettore al fine di ricavare i punti in comune e le specificità dei contesti neurologici e di accelerare il dipanarsi degli aspetti meccanicistici dell'insorgenza e della progressione della malattia. L'attribuzione di ruoli lipidici a regioni cerebrali distinte fa progredire la determinazione del fenotipo molecolare lipidico e della morfologia associata a una malattia neurologica.

Qui viene presentato un protocollo modulare adatto per l'analisi dei lipidi di membrana e dei segnali lipidici a valle insieme all'mRNA di enzimi e mediatori alla base della loro funzionalità, estratti da regioni cerebrali discrete che sono rilevanti per una particolare malattia e / o condizione neurologica. Per garantire un'accurata profilazione lipidomica comparativa, i flussi di lavoro e i criteri operativi sono stati ottimizzati e standardizzati per: i) campionamento cerebrale e dissezione delle regioni di interesse, ii) co-estrazione di più segnali lipidici e lipidi di membrana, iii) doppia estrazione lipidico/mRNA, iv) quantificazione mediante cromatografia liquida monitoraggio a reazioni multiple (LC/MRM) e v) profilazione standard dell'mRNA. Questo flusso di lavoro è suscettibile per le basse quantità di tessuto ottenute dal campionamento delle sottoregioni cerebrali funzionalmente discrete (cioè mediante punzonatura cerebrale), prevenendo così pregiudizi nell'analisi multimolecolare dovuti all'eterogeneità tissutale e / o alla variabilità animale. Per rivelare le conseguenze periferiche delle malattie neurologiche e stabilire letture molecolari traslazionali degli stati di malattia neurologica, il campionamento degli organi periferici, l'elaborazione e la loro successiva analisi lipidomica, nonché la lipidomica plasmatica, sono anche perseguiti e descritti. Il protocollo è dimostrato su un modello murino di epilessia acuta.

Introduzione

I recenti progressi nella funzione dei lipidi e il loro ruolo nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche aprono nuove sedi di ricerca e sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e delucidazione del meccanismo della ^malattia1. Le differenze documentate nella composizione lipidica in diverse regioni del cervello, enfatizzate dalle moderne tecniche di imaging molecolare come l'imaging con spettrometria di massa e la profilazione avanzata della spettrometria di massa, spostano il paradigma dell'indagine lipidica dall'intero cervello verso regioni cerebrali funzionalmente distinte e discrete. Il fatto che la composizione lipidica vari nelle diverse regioni del cervello induce a una nuova concettualizzazione sia della sensibilità lipidica di membrana che della segnalazione lipidica a valle in risposta a un insulto o stimoli cerebrali attraverso le regioni cerebrali funzionalmente distinte. Pertanto, i protocolli lipidici richiedono nuovi sviluppi per affrontare la sfida di basse quantità di tessuto per il rilevamento e la quantificazione di una risoluzione spaziale più elevata e, contemporaneamente, l'analisi di più componenti lipidici delle membrane cellulari e delle vie di segnalazione. Inoltre, la determinazione di enzimi, ligandi lipidici e recettori coinvolti nella regolazione dei loro livelli e della loro funzione è fondamentale per chiarire le vie di segnalazione colpite in una malattia neurologica e guidare nuove indagini meccanicistiche in un contesto fisiopatologico.

Oltre all'aumento della risoluzione spaziale del cervello, ci sono due grandi difficoltà che sfidano lo sviluppo di nuovi approcci neurolipidomici. In primo luogo, le molecole di segnalazione lipidica sono tipicamente di abbondanza molto bassa rispetto ai lipidi costitutivi di membrana. In secondo luogo, il lipidoma presenta un'elevata eterogeneità strutturale, difficile da sezionare utilizzando un unico approccio analitico. Quindi, i metodi di estrazione e analisi sono adattati a diverse categorie lipidiche e comunemente eseguiti in campioni di tessuto distinti². Metodi lipidomici shotgun³ sono strumenti eccellenti per rivelare rapidamente un ampio profilo dei lipidi di membrana, mentre l'aumento della sensibilità e della selettività offerte dalla scoperta mirata e dalla quantificazione dei metodi spettrometrici di massa sono capitalizzati per lo studio di lipidi di segnalazione a bassa abbondanza tra cui: i) lipidi infiammatori e ii) lipidi coinvolti nella modulazione dell'attività neuronale, come endocannabinoidi (eCB), lipidi legati agli amminoacidi, and so on.^4,5. Per comprendere i cambiamenti lipidici sia a livello di membrana cellulare che di segnalazione che si verificano nelle regioni cerebrali dei modelli di malattie neurologiche, in genere l'estrazione e l'analisi dei lipidi vengono eseguite in campioni di tessuto distinti, ottenuti da lotti animali distinti o da emisferi diversi, o sezionando una regione tissutale più ampia in più pezzi. Quando anche i livelli di mRNA dei recettori enzimatici sono di interesse, la loro indagine richiede in genere l'approvvigionamento di un campione di tessuto distinto. Ad esempio, lo studio dei lipidi di membrana, dei cannabinoidi endogeni e dell'mRNA richiederebbe tre diversi campioni di tessuto (ad esempio, due campioni per i due metodi di estrazione dei lipidi - lipidi di membrana e lipidi di segnalazione - e successivi due metodi di analisi dei lipidi - e un campione per l'analisi dell'mRNA). Lo studio dei lipidi infiammatori e dei cannabinoidi endogeni richiede due distinti campioni di tessuto, metodi di estrazione e metodi di analisi, rispettivamente. Un altro esempio è lo studio dell'mRNA e di qualsiasi categoria lipidica in un campione di punch cerebrale o di microdissezione laser che di conseguenza richiede due animali distinti per procurarsi due campioni per (sotto)regione del cervello. In questi casi si verifica frequentemente una notevole variabilità e/o scarsa riproducibilità dei risultati, derivante dalla variabilità biologica e/o dall'eterogeneità tissutale. Guidato da queste limitazioni pratiche dell'analisi multimolecolare, che si verificano in particolare ad alta risoluzione spaziale nel cervello, è stato progettato un protocollo di neurolipidomica a tre moduli che comprende: 1) coestrazione e co-analisi da parte di LC / MRM di lipidi infiammatori (ad esempio, eicosanoidi (eiCs)) e lipidi coinvolti nella modulazione dell'attività neuronale, come gli eCB²; 2) co-estrazione di fosfolipidi (PL) ed eCB con successiva analisi multiscan LC/MRM e precursor/neutral loss scan²; e 3) doppia estrazione di lipidi di membrana (fosfo)lipidi ed eCB nonché di mRNA, con successiva analisi di sequenziamento LC/MRM e qPCR o RNA⁶. A seconda della questione biologica da affrontare in una malattia neurologica e della regione cerebrale di interesse, una combinazione del primo e del secondo protocollo, o del primo e del terzo protocollo, può essere applicata sullo stesso campione di tessuto per tessuti di peso di circa 4 mg. Il primo e il terzo protocollo possono essere applicati in modo indipendente per i tessuti intorno ai 2 mg. Il secondo protocollo può essere applicato per tessuti di peso minimo di 0,5 mg. Indipendentemente dal modulo di protocollo neurolipidomico selezionato, il campionamento dei tessuti e l'elaborazione pre-analitica, l'isolamento cerebrale e la dissezione della regione, nonché la procedura per sacrificare il modello animale sono standardizzati e identici per tutti e tre i moduli del protocollo. Nella nostra indagine sulle malattie neurologiche, gli organi periferici che sono rilevanti per le conseguenze patologiche della malattia vengono sempre raccolti e analizzati utilizzando questi protocolli modulari. Inoltre, il sangue viene regolarmente campionato per la lipidomica plasmatica per servire come strumento di lettura delle malattie neurologiche in vista di potenziali applicazioni traslazionali. Il protocollo lipidomico modulare qui presentato è molto versatile: scalabile a quantità di tessuto più grandi e facilmente applicabile praticamente a qualsiasi tipo di tessuto e malattia. Per l'applicazione del protocollo modulare (Figura 1) nelle malattie neurologiche, qualsiasi modello standardizzato di roditori di insorgenza e progressione di disturbi neurologici, come lesioni cerebrali traumatiche, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer o epilessia sono suscettibili.

Questi protocolli sono stati ampiamente applicati per studiare i cambiamenti nel lipidoma tissutale e/o nel trascrittoma nella fase acuta dell'epilessia nel modello murino di epilessia indotto dall'acido kainico (KA^)2,7, un modello ampiamente utilizzato negli studi preclinici a causa della somiglianza con l'epilessia del lobo temporale umano (TLE)^8,9,10,11. Utilizzando questi protocolli, il potenziale terapeutico di farmaci come palmitoiletanolamide (PEA)^12,13 è stato valutato nello stesso modello murino di epilessia. Lo studio ha identificato cambiamenti lipidici e mRNA ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e nella periferia, nel punto temporale delle intensità massime di convulsioni acute (a 60 minuti di induzione post-epilettica) e dopo il trattamento subcronico e acuto con PEA in quattro diversi punti temporali (20, 60, 120 e 180 min) dopo l'induzione della crisi ka, una finestra temporale che copre la fase acuta dell'epilessia. Plasma, cervello e organi periferici di topi iniettati con KA non trattati, topi acuti e subcronicamente trattati con PEA, così come topi di controllo veicolo e PEA-veicolo, sono stati raccolti in ogni punto ^{temporale12,13} e studiati con questa analisi molecolare. I dati molecolari sono stati correlati con fenotipi comportamentali ottenuti dal seizure scoring, nonché con dati derivati dall'immunoistochimica sui processi neurodegenerativi, al fine di svelare la progressione della fase di epilessia acuta e il potenziale della PEA per alleviarla.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono conformi alla direttiva del Consiglio della Comunità europea del 22 settembre 2010 (2010/63UE) e sono state approvate dal comitato locale per gli animali dello stato Renania-Palatinato, Germania (riferimento file: 23 177-07/G16-1-075).

1. Modello animale di epilessia acuta e profilatticamente trattata con KA

1. Eseguire l'induzione delle convulsioni, il trattamento e il punteggio comportamentale.
   1. Separare i topi (minimo n = 6 topi per gruppo) in gabbie singole.
   2. Preparare la soluzione per iniezione di induzione del sequestro e il veicolo corrispondente (vedere Tabella 1), nonché la soluzione di iniezione del trattamento e il veicolo corrispondente (vedere Tabella 2).
   3. Iniettare topi per via intraperitoneale (i.p.) (10 ml/kg di massa corporea del topo) senza anestesia in base alla loro identità di gruppo: malattia, trattata o trattata con veicolo (cioè KA, KA trattata con PEA e i due gruppi di veicoli). Vedere figura 2, tabella 1 e tabella 2.
   4. Monitorare e valutare il comportamento secondo la seguente scala standardizzata di intensità delle convulsioni: 0 = nessuna risposta; 1 = immobilità e fissare; 2 = estensione dell'arto anteriore e/o della coda, postura rigida; 3 = movimenti ripetitivi, oscillazione della testa; 4 = allevamento e caduta; 5 = allevamento e caduta continui; 6 = gravi convulsioni clonico-toniche; 7 = ^morte14,15 (Figura 3).
2. Eseguire la procedura di sacrificio per l'analisi lipidomica e trascrittomica.
   1. In quattro timepoint (cioè 20, 60, 120 e 180 min dopo KA- o iniezione del veicolo rispettivamente), sacrificare sei topi di ciascuno dei seguenti gruppi: PEA trattato, PEA-non trattato veicolo epilettico 1 e veicolo 2, seguendo protocolli approvati IACUC.
   2. Dieci secondi dopo aver raggiunto ogni punto temporale, anestetizzare i topi usando un tessuto imbevuto di isoflurano in una camera di vetro. Confermare l'anestesia dalla perdita del riflesso di raddrizzamento, indicata dall'incapacità di muoversi mentre si ribalta lentamente la camera di vetro. Decapitare i topi usando forbici chirurgiche e raccogliere plasma, cervello e organi periferici (vedere i passaggi 2.2.2-2.2.4).
      ATTENZIONE: le norme etiche per le procedure di sacrificio variano tra i comitati animali locali. Assicurati di controllare e seguire le normative emesse dal comitato locale per gli animali.
3. Seguire la procedura di sacrificio per l'analisi immunoistochimica.
   1. Per la colorazione immunoistochimica13, assegnare un punteggio comportamentale a tre topi di ciascuno dei seguenti gruppi: PEA trattata, epilessia non trattata con PEA e gruppi di veicoli, durante l'intero corso del tempo (180 min).
   2. Sacrifica e perfondi i topi 5 giorni dopo. Anestetizzare profondamente i topi (vedere il punto 1.3.1 per i gruppi murini) mediante iniezione i.p. di pentobarbital (100 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) come stupefacenti. Confermare l'anestesia profonda con la perdita di riflesso tra le dita dei piedi.
   3. Fissare il mouse su una piastra di polistirolo e aprire immediatamente il torace usando forbici sottili e pinze standard. Metti la farfalla nel ventricolo del cuore sinistro e taglia l'atrio destro usando forbici fini.
   4. Regolare la velocità e la pressione della pompa a un flusso peristaltico costante con una velocità di 2-3 ml / min. Perfondere con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per ~ 5 min. Se necessario, sostituire la farfalla.
      NOTA: Con una corretta perfusione, gli organi interni (ad eccezione della milza) iniziano a sbiancare entro 1-2 minuti.
   5. Passare la perfusione alla soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% (PFA) per ~ 5 min. Isolare cervelli interi come descritto nel passaggio 2.2.2 e fissare per 24 ore in soluzione di PFA al 4% a 4 °C.
   6. Incubare i cervelli in soluzione di saccarosio al 30% per 48 ore a 4 °C. Rimuovere il saccarosio avanzato con una carta velina asciutta e congelare il cervello su una piastra metallica (-80 °C). Conservare il cervello a -80 °C per le procedure di ^{colorazione13}.

2. Procedure di campionamento per analisi lipidomiche/trascrittomiche

1. Prepararsi per il campionamento.
   1. Tubi EDTA preraffreddati per il campionamento al plasma a 4 °C. Preraffreddare l'apparato centrifugo e vortice a 4 °C. Preraffreddare la piastra metallica ricoperta di foglio di alluminio (per far scattare il cervello congelato e/o altri tessuti di interesse) su ghiaccio secco (-80 °C). Preraffreddare i tubi marcati da 2 mL e 5 mL su ghiaccio secco (-80 °C) rispettivamente per aliquote plasmatiche, tessuto congelato e raccolta del cervello. Utilizzare tubi ambra per proteggere le molecole sensibili alla luce, come gli eIC.
   2. Pulire l'apparecchiatura per il campionamento e l'isolamento dei tessuti (forbici chirurgiche, forbici sottili dritte e affilate, pinze standard dritte e lisce, pinze fini con finitura a specchio, pinze curve e spatola, piastra in polistirene espanso e aghi per la fissazione) con un disinfettante (ad esempio, etanolo al 70%).
2. Protocolli di campionamento
   1. Determinare l'ordine di campionamento.
      1. Raccogliere il sangue immediatamente dopo la decapitazione in tubi EDTA preraffreddati da 1 mL (vedere punto 2.2.3).
      2. Rimuovere l'intero cervello e congelare immediatamente dopo la rimozione. Questo passaggio richiederà 1-2 minuti. Conservare i cervelli congelati a -80 °C per un'ulteriore elaborazione (vedere il passaggio 2.2.2).
      3. Rimuovere gli organi periferici di interesse (ad esempio, polmone, cuore, fegato), entro 5 minuti dopo la rimozione del cervello, e congelare e conservare a -80 °C per un'ulteriore elaborazione (vedere il passaggio 2.2.4).
   2. Rimuovere il cervello per le procedure di dissezione o punzonatura. Questa procedura richiede 1-2 min / cervello.
      1. Dopo la decapitazione (vedi passo 1.2), inizia a fare un'incisione della linea mediana nella pelle usando forbici fini. Libera il cranio capovolgendo la pelle sopra gli occhi. Raggiungi la parte superiore del cranio e fai una piccola incisione caudale a partire dal livello dell'osso intraparietale. Evitare di tagliare attraverso il cervello.
      2. Tagliare saldamente attraverso la parte più anteriore del cranio tra gli occhi per facilitare la rimozione del cervello. Inclina un lato dell'osso parietale usando una pinza curva a modello stretto e stacca. Ripeti l'ultimo passaggio per l'altro lato.
      3. Rimuovere le meningi cerebrali. Far scorrere una spatola sotto la parte anteriore del cervello (cioè il bulbo olfattivo) e inclinare delicatamente il cervello verso l'alto. Far scorrere la spatola più in basso per rompere l'ottica e altri nervi cranici.
      4. Sollevare il cervello dal cranio e congelare immediatamente l'intero cervello su una piastra metallica preraffreddata (-80 ° C) con il lato ventrale rivolto verso la piastra metallica (dorsale verso l'alto).
      5. Lasciare che il cervello si congeli completamente e si trasferisca in tubi preraffreddati da 5 ml e conservare a -80 °C fino alla dissezione delle regioni cerebrali o alla procedura di punzonatura (vedere i passaggi 3.1. e 3.2).
   3. Eseguire il campionamento del plasma.
      1. Tubi EDTA preraffreddati Spike con 10 μL di indometacina-diluizione appena preparata fino a una concentrazione target di 10 μM.
      2. Raccogliere il sangue del tronco immediatamente dopo la decapitazione mediante una delicata spremitura del corpo in tubi EDTA preraffreddati fino a un volume massimo di sangue di 1 ml.
         NOTA: In caso di corretta pressione sanguigna, non è richiesta la spremitura. Se il volume del sangue è inferiore a 1 ml, ridurre il tempo di incubazione dell'isoflurano per consentire un corretto flusso sanguigno.
      3. Centrifugare immediatamente le provette del sangue a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
      4. Rimuovere la fase plasmatica superiore risultante e, ai fini dell'analisi multilipidica, i volumi di plasma definiti aliquota nei tubi preraffreddati da 2 mL come segue: 50 μL per l'analisi eCB/eiCs, 30 μL per l'analisi DEI PL e il volume di plasma rimanente come campione di riserva o per altri tipi di analisi.
      5. Conservare i campioni di plasma a -80 °C per un'ulteriore estrazione (vedere i passaggi 4.1.2 e 4.1.4).
   4. Eseguire il campionamento degli organi periferici.
      NOTA: Utilizzare i riferimenti di anatomia del ^topo16 e la documentazione fornita per i corsi obbligatori (FELASA) frequentati da sperimentatori di animali per identificare i singoli organi, i loro tessuti connettivi e / o vasi sanguigni.
      1. Immobilizzare il busto del topo per facilitare la rimozione degli organi usando gli aghi. Fai un'incisione ventrale della linea mediana usando una forbice dritta affilata all'altezza del pube. Utilizzare una pinza standard smussata per fissare la parete addominale durante il taglio per aprire la cavità addominale.
      2. Immobilizzare la pelle per consentire la rimozione degli organi addominali utilizzando pinze smussate. Per la rimozione del cuore o del polmone, continuare il taglio mediale nella direzione della grotta del seno. Rimuovere il polmone e / o il cuore usando una pinza fine.
      3. Aprire attentamente la cavità mammaria per evitare sanguinamento. Tagliare i tessuti connettivi e i vasi sanguigni ancorando il rispettivo organo senza tagliare l'organo.
      4. Trasferire immediatamente i pezzi di tessuto su piastre metalliche preraffreddate (-80 °C) e lasciare congelare completamente. Trasferire i pezzi di tessuto in tubi preraffreddati e conservare a -80 °C per un'ulteriore lavorazione (vedere punto 4.1).

3. Lavorazione biologica dei materiali

NOTA: Per la co-estrazione di eCB/eIC utilizzare tubi ambrati da 2 ml come tubi di estrazione e aggiungere in ogni tubo sette sfere di acciaio preraffreddate. Per la co-estrazione di PL/eCB e per la doppia co-estrazione lipidica e RNA, utilizzare 2 mL di tubi di estrazione privi di RNAsi con chiodati con perline ceramiche (Table of Materials).

1. Eseguire la dissezione cerebrale e l'elaborazione degli organi periferici.
   NOTA: utilizzare lampade di ingrandimento per aumentare la visibilità del cervello per la dissezione.
   1. Pulire gli strumenti chirurgici, comprese le pinze con punte super sottili, 2x con il 70% di etanolo.
   2. Trasferire il cervello congelato da -80 °C a una capsula di Petri contenente tampone fisiologico preraffreddato (pH 5,5) Assicurarsi che la capsula di Petri sia a 4 °C. Consenti al cervello di sbloccarsi completamente per consentire la dissezione. Testare attentamente usando una pinza.
      ATTENZIONE: Non tenere il cervello a 4 °C più a lungo di quanto richiesto per lo scongelamento.
   3. Preraffreddare una piastra metallica su ghiaccio (4 °C) e coprirla con tessuti bagnati imbevuti di tampone fisiologico ghiacciato (pH 5,5) e trasferire accuratamente il cervello con il lato ventrale su una piastra metallica preraffreddata (4 °C) su ghiaccio. Coprirlo con tessuti bagnati imbevuti di tampone fisiologico ghiacciato (pH 5,5).
   4. Seziona le regioni del cervello entro un massimo di 5 minuti usando una pinza a punta super fine. Inizia con l'ipotalamo (HYP) e gira il lato dorsale verso l'alto per procedere con il lato destro. Isolare l'ippocampo (HCr), la corteccia prefrontale (PFCr), lo striato (STRr) e la corteccia cerebrale (cCTXr). Quindi seziona il lato sinistro. Isolare l'ippocampo (HCl), la corteccia prefrontale (PFCl), lo striato (STRl) e la corteccia cerebrale (cCTXl). Sezionare il cervelletto e la regione talamica. Utilizzare riferimenti anatomici ^{pubblicati16,17} per l'identificazione della regione del cervello.
   5. Trasferire ogni pezzo sezionato direttamente su una piastra metallica preraffreddata rivestita di foglio di alluminio (-80 °C). Consentire il congelamento e trasferire le regioni cerebrali isolate nei tubi preraffreddati da 2 ml etichettati.
   6. Polverizzare i pezzi di tessuto utilizzando un polverizzatore di tessuto (a -80 °C), evitando lo scongelamento del tessuto. Nella cella frigorifera, polvere di tessuto aliquota in tubi di estrazione preraffreddati etichettati contenenti perline di ceramica o sfere di acciaio. Per la doppia analisi lipidomica/trascrittomica, pesare le aliquote di polvere tissutale nella cella frigorifera. Per l'analisi solo lipidomica, scegliere tra la normalizzazione al peso del tessuto o al contenuto proteico. Per quest'ultimo, procedere ulteriormente senza pesare i tessuti.
   7. Tagliare i tessuti periferici dell'organo in pezzi con un peso massimo di 20 mg. Procedere con la polverizzazione dei tessuti come al punto 3.1.6.
   8. Procedere con l'estrazione di campioni di tessuto (vedere i passaggi 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o conservare i tubi a -80 °C per un'estrazione successiva.
      NOTA: La matrice cerebrale può anche essere utilizzata se il progetto di studio lo consente. Tuttavia, il metodo è più adatto per un numero discreto e limitato di regioni del cervello, e non è pratico sezionare e isolare tutte le regioni cerebrali sopra menzionate entro il periodo di tempo stabilito.
2. Esegui la punzonatura cerebrale.
   1. Montare l'intero cervello congelato sul sistema di montaggio (Tabella dei materiali) nel criostato. Impostare lo spessore su 50 μm e affettare in modalità trim vicino alla regione di interesse.
   2. Macchiare la fetta di cervello (18-20 μm) usando il blu di toluidina (0,1% -1%) come riferimento per localizzare la sottoregione di interesse. Ispezionare le fette macchiate utilizzando un microscopio per identificare le regioni di interesse da punzonare. Utilizzare un atlante del topo come riferimento per trovare le regioni anatomiche cerebrali ^{appropriate16}. Prelevare punzoni con un diametro di 0,8-1,0 mm utilizzando corer campione in tubi preraffreddati.
   3. Pesare i punzoni congelati nella cella frigorifera in tubi di estrazione da 2 mL etichettati e preraffreddati contenenti perline di ceramica o sfere di acciaio. Utilizzare tubi ambra per la co-estrazione di eCB ed eIC.
   4. Avviare l'estrazione (vedere i passaggi 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o conservare i tubi a -80 °C per un'ulteriore estrazione.
3. Eseguire l'elaborazione al plasma.
   1. Posizionare i campioni di plasma congelato sul ghiaccio (4 °C) e lasciarli scongelare (~20 min).
   2. Assicurarsi che il plasma sia completamente scongelato prima di iniziare l'estrazione.
   3. Procedere con la procedura di estrazione del plasma (vedere i passaggi 4.1.2 o 4.1.4).
      NOTA: i campioni di plasma devono rimanere a -80 °C fino all'estrazione. Evitare cicli di scongelamento e ricongelamento.

4. Procedure di estrazione

1. Eseguire protocolli di co-estrazione lipidica Liquid-Liquid (LLE).
   1. Eseguire la co-estrazione di eCB ed eIC da pezzi cerebrali, pugni o campioni di polvere di tessuto.
      NOTA: durante tutta la procedura è necessario un pipettaggio accurato.
      1. Posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e sette sfere di acciaio sul ghiaccio (4 °C). Aggiungere 600 μL di MTBE ghiacciato e 50 μL di ACN/_H2O (1:1; v/v) contenenti gli standard interni. La concentrazione target delle norme interne nel volume finale per l'analisi (50 μL) è la seguente: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 e 5 ng/mL per PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 e TXB2-d4, rispettivamente.
      2. Aggiungere 400 μL di acido formico 0,1 M e omogeneizzare con un liser tissutale (30 s-1 min). Centrifugare l'omogeneizzato per 15 min a 5.000 x g a 4 °C. Consentire il congelamento della fase inferiore acquosa per 10 minuti a -80 °C per facilitare il trasferimento della fase organica superiore.
      3. Trasferire la fase organica in nuovi tubi. Evaporare sotto un flusso delicato di _N2 a 37 °C e ricostituire in 50 μL di ACN/_H2O (1:1; v/v) per ulteriori analisi.
      4. Conservare la fase acquosa a -20 °C o -80 °C per un'ulteriore analisi del contenuto proteico.
   2. Eseguire la co-estrazione di eCB ed eIC da campioni di plasma.
      1. Aliquote plasmatiche di scongelamento a 4 °C. Aggiungere 800 μL di MTBE e 50 μL di ACN/_H2O (1:1; v/v) contenenti le norme interne (analoghe a quelle utilizzate per l'analisi dei tessuti, cfr. punto 5.1.1). Ottimizzare la concentrazione standard interna per lo spiking utilizzando campioni di plasma di riferimento.
      2. Aggiungere 600 μL di 0,1 M di acido formico e campioni di vortice a 4 °C per 2 minuti. Centrifugare i campioni a 4.000 x g per 15 min a 4 °C.
      3. Trasferire la fase organica in nuovi tubi, evaporare sotto un flusso delicato di _N2 a 37 °C e ricostituire in 50 μL di ACN/_H2O (1:1; v/v) per l'analisi LC/MRM.
         NOTA: Se possibile, evitare lo stoccaggio di estratti secchi di eIC e procedere immediatamente all'analisi LC/MRM. Se la conservazione non può essere evitata, ricorrere alla conservazione a breve termine per soli 2-3 giorni a 4 ° C con campioni in solvente per iniezione LC.
   3. Eseguire la co-estrazione di PL ed eCB da regioni del cervello, punzoni o altri campioni di polvere tissutale.
      1. Posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e le perle di ceramica sul ghiaccio (4 °C). Aggiungere 800 μL di MTBE/MeOH (10:3; v/v) e 10 μL di MeOH contenenti gli standard interni. La concentrazione target delle norme interne nel volume finale per l'analisi (100 μL) è la seguente: 150 ng/mL per PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 e 3 ng/mL PEA- d4 rispettivamente.
      2. Aggiungere 200 μL di acido formico allo 0,1% contenente 25 μM di tetraidrolipstatina/URB597 e 50 μg/mL di BHT. Omogeneizzare con l'omogeneizzatore tissutale (Tavolo dei Materiali) e centrifugare a 5.000 x g e 4 °C per 15 min.
      3. Recuperare la fase organica superiore in nuovi tubi ed evaporare sotto un flusso delicato di _N2 a 37 °C. Ricostituire in 90 μL di MeOH e conservare a -20 °C o -80 °C o procedere con il passaggio successivo.
      4. Aggiungere il 10% di _H2O ad un'aliquota di estratto lipidico (4.1.3.3) e iniettare 10 μL nella LC/MS per l'analisi dei PL. Per ulteriori analisi eCB procedere con il passaggio 4.3.5.
      5. Prelevare un'aliquota dell'estratto (4.1.3.3), evaporare a secco e ricostituire in ACN/_H2O (1:1; v/v). Utilizzare 20 μL per l'iniezione di LC/MS per l'analisi eCB.
   4. Eseguire la co-estrazione di PL ed eCB da campioni di plasma.
      1. Scongelare le aliquote plasmatiche a 4 °C, aggiungere 1.000 μL di MTBE/metanolo (10:3; v/v) e 10 μL Di MeOH contenenti standard interni (analogo al punto 4.1.3) e vortice a 4 °C per 1 min.
      2. Aggiungere 250 μL di _H2O e vortice per 45 min a 4 °C. Centrifugare i campioni per 15 min a 5.000 x g e 4 °C. Recuperare la fase organica superiore, evaporare sotto un flusso delicato di _N2 a 37 °C e ricostituire in 90 μL di metanolo per ulteriori analisi LC/MS. Conservare a -20 °C o -80 °C o procedere al passaggio successivo.
      3. Per l'analisi dei PL, aggiungere il 10% di acqua a un'aliquota di estratto lipidico (4.1.2.2).
      4. Per l'analisi eCB, aggiungere il 10% di acqua a un'aliquota dell'estratto lipidico (vedere 4.1.4.3), evaporare a secco e ricostituire in 50% ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Eseguire la doppia estrazione di RNA e lipidi (co-estrazione di PL ed eCB) da campioni di tessuto.
      ATTENZIONE: Assicurarsi di lavorare in condizioni prive di RNA per evitare la degradazione dell'RNA.
      1. Scongelare aliquote di polvere tissutale o grappoli cerebrali (a 4 °C) e aggiungere 600 μL di tampone RLT contenente 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT e 1% β-mercaptoetanolo (per le percentuali del volume finale del tampone di omogeneizzazione, vedere punto 4.1) insieme a 200 μL di cloroformio in tubi di estrazione contenenti pugni cerebrali congelati e perline ceramiche.
      2. Spike di campioni con 10 μL di miscela standard interna per la co-estrazione di PL ed eCB (vedi punto 4.1.3) e omogeneizzazione tramite omogeneizzatore tissutale (alta velocità, 20 s).
      3. Trasferire lisati in nuovi tubi centrifuga e centrifuga per 5 minuti a piena velocità e 4 °C per consentire la separazione di fase.
      4. Recuperare e utilizzare la fase superiore per l'estrazione dell'RNA utilizzando kit di procedure di estrazione dell'RNA standard (Tabella dei materiali). Elutare l'RNA in un volume totale di 50 μL di acqua priva di RNasi e conservare a -80 °C.
         NOTA: Il campione al passo 4.1.5.4 è suscettibile sia per il sequenziamento dell'RNA che per la qPCR utilizzando i metodi e la strumentazione appropriati.
      5. Utilizzare la fase inferiore contenente cloroformio per l'estrazione dei lipidi. Aggiungere 800 μL di MTBE/metanolo (10:3; v/v) e 200 μL di acido formico allo 0,1% e vortice per 45 minuti a 4 °C. Recuperare la fase organica superiore ed evaporare sotto un leggero flusso di _N2 a 37 °C.
      6. Ricostituire in 90 μL di metanolo per ulteriori analisi LC/MS. Conservare a -20 °C o -80 °C o procedere al passaggio 5.
      7. Aggiungere il 10% di _H2O a un'aliquota di estratto lipidico (vedere sopra il punto 4.1.5.6) e iniettare 10 μL nella LC/MS per l'analisi dei PL. Per ulteriori analisi eCB procedere con il passaggio 5.7.
      8. Prendere un'aliquota dell'estratto (vedi sopra il punto 4.1.5.6) evaporare a secco e ricostituirsi in ACN/_H2O (1:1; v/v). Utilizzare 20 μL per l'iniezione di LC/MS per l'analisi eCB (analogamente al passaggio 4.3.5).

5. Profilazione qualitativa e quantitativa LC/MRM

1. Preparare sistemi di solventi LC, soluzioni di calibrazione e campioni di controllo qualità.
   1. Per i PL, preparare la fase mobile A: metanolo/acqua (1:1; v/v) contenente 7,5 mM di formiato di ammonio e 0,1% di TEA. Preparare la fase mobile B: metanolo/isopropanolo (2:8; v/v) contenente 7,5 mM di formiato di ammonio e 0,1% di TEA. Conservare i solventi in flaconi LC.
   2. Per la separazione eCB ed eiC, preparare i seguenti solventi LC: 0,1% di acido formico come fase mobile A e 100% ACN contenente lo 0,1% di acido formico come fase mobile B. Conservare i solventi in flaconi LC.
   3. Preparare i controlli di qualità utilizzando gli standard di taratura e gli standard interni (Tabella 3) in una concentrazione equimolare o definita dall'utente.
   4. Preparare curve di calibrazione con sette punti di concentrazione. Utilizzare lo stesso batch standard interno per aumentare la soluzione della curva di calibrazione e nei campioni da analizzare.
2. Utilizzare il metodo LC-MRM per la profilazione lipidica qualitativa e quantitativa.
   1. Aprire la scheda Build Acquisition Method nel software commerciale (ad esempio, Analyst) e selezionare la modalità LC/MRM con commutazione di polarità. Impostare nel metodo le transizioni ioniche (come indicato nella Tabella 3) per la profilazione quantitativa. Impostare il tempo di assestamento a 50 ms.
   2. Per la profilatura dei PL, impostare i seguenti parametri della sorgente di ioni: gas di cortina = 40 psi; temperatura del riscaldatore della sorgente = 550 °C; tensione di spruzzatura ionica = -4.500 V in modalità ione negativo e = + 5.200 V in modalità ioni positivi.
   3. Per la co-analisi di eCB ed eIC, impostare i seguenti parametri: gas di cortina = 40 psi; temperatura del riscaldatore della sorgente = 550 °C; tensione di spruzzatura ionica = -4.500 V in modalità ioni negativi e = +4.500 V in modalità ioni positivi.
   4. Per l'analisi PL, impostare il riscaldamento della colonna a 45 °C e la portata a 200 μL/min e impostare il seguente gradiente: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B e min 52 = 40% B. Impostare il volume di iniezione a 10 μL.
   5. Per l'analisi di eCB ed eIC, impostare la temperatura della colonna a temperatura ambiente e impostare il seguente gradiente: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Impostare il volume di iniezione a 20 μL.
      NOTA: le condizioni MRM possono variare tra le piattaforme strumentali, quindi la frammentazione e le condizioni MRM devono essere dedotte sperimentalmente e i parametri di ionizzazione devono essere testati e regolati se necessario per ottenere la massima sensibilità e selettività.
3. Eseguire analisi batch.
   1. Aprire il batch build acquisition e inserire i parametri richiesti per la descrizione del campione, la posizione nel rack campione dell'autocampionatore e il metodo di acquisizione (impostato come passaggio 5.2).
   2. Includere sempre i controlli di qualità all'inizio e alla fine dell'analisi e all'interno del lotto. Dopo ogni 25-30 campioni, includere almeno tre curve di calibrazione all'interno del lotto e includere una fase di lavaggio con un solvente di scelta dopo ogni campione di controllo qualità, curva di calibrazione e alla fine del lotto di campione.
   3. Trasferire i campioni ottenuti al punto 4 in flaconcini LC/MS. Posizionare i campioni nelle scaffalature di carico dell'autocampionatore LC in base alla posizione definita nel lotto e caricare il rack campione nell'autocampionatore LC.
   4. Invia batch e avvia l'analisi della coda.
4. Quantificazione lipidica
   1. Utilizzare il software commerciale (ad esempio, Analyst) e il modulo di quantificazione incorporato per la quantificazione di eCB ed eIC e il software commerciale (ad esempio, Multiquant) per la quantificazione dei PL.
      NOTA: Il secondo software può essere utilizzato anche per eCB ed eIC, in particolare quando viene utilizzato uno standard interno per la quantificazione di più analiti.
   2. Aprire build quantification Method e compilare i parametri per gli analiti, gli standard interni, le transizioni MRM e attribuire gli standard interni agli analiti da quantificare (Tabella 3). Impostare l'altezza minima di picco su 500 cps.
   3. Utilizzare i seguenti criteri o combinazioni di essi per l'assegnazione dell'identità lipidica e la successiva ^{quantificazione6}: corrispondenza del tempo di ritenzione degli analiti lipidici endogeni con gli standard di calibrazione e/o gli standard interni deuterati, se disponibili; corrispondenza dello ione del frammento mediante frammentazione in modalità ionica positiva e negativa per un dato m/z di analiti lipidici per i quali non sono previste norme; comportamento di eluizione dedotto dalla letteratura dei lipidi in condizioni LC impiegate in modo simile per sezionare strutture isomeriche e/o isobariche; e, ove disponibile, analisi LC/MS e MS/MS con spettrometria di massa ad alta risoluzione, utilizzando condizioni LC simili a quelle dell'analisi mirata (utilizzando LC/MRM), per identificare con precisione l'identità e il comportamento di eluizione dei lipidi endogeni di ^{interesse18,19}.
   4. Per la convalida dell'analisi dei lotti, utilizzare i seguenti criteri: accuratezza della quantificazione ≤ ±20%; coefficiente di regressione ≥0,97 (idealmente ≥0,99).
      NOTA: Seguire le linee guida per lo sviluppo e la convalida del metodo bioanalitico per garantire un'analisi affidabile e riproducibile delle molecole bersaglio.

Risultati

L'insieme dei protocolli descritti può essere combinato su diversi livelli in modo specifico per scopo, come la scelta del modello animale, la via di campionamento, il metodo di estrazione e la profilazione (Figura 1).

Al fine di determinare i cambiamenti del livello lipidico nel cervello e nella periferia nel corso di un decorso acuto di crisi epilettica e per svelare il potenziale effetto antiepi...

Discussione

La metodologia neurolipidomica e trascrittomica qui descritta è un mezzo praticabile per studiare qualsiasi malattia o sviluppo sano ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e negli organi periferici. Grazie alle procedure ottimizzate di campionamento e manipolazione del plasma, l'analisi lipidomica plasmatica può essere effettuata anche dagli stessi animali sacrificati per la lipidomica e la trascrittomica tissutale, migliorando così l'affidabilità dei correlati molecolari del sangue tissutale e la scoperta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS