Lipidomik und Transkriptomik bei neurologischen Erkrankungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein modulares Protokoll für Gewebelipidomik und Transkriptomik sowie Plasmalipidomik in Mausmodellen für neurologische Erkrankungen vor, die auf Lipide abzielen, die Entzündungen und neuronaler Aktivität zugrunde liegen, Membranlipide, nachgeschaltete Botenstoffe und mRNA-kodierende Enzyme / Rezeptoren, die der Lipidfunktion zugrunde liegen. Probenahme-, Probenverarbeitungs-, Extraktions- und Quantifizierungsverfahren werden beschrieben.

Zusammenfassung

Lipide dienen als primäre Schnittstelle zu Hirnverletzungen oder Reizen, die neurologischen Erkrankungen förderlich sind, und sind ein Reservoir für die Synthese von Lipiden mit verschiedenen Signal- oder Ligandenfunktionen, die den Beginn und das Fortschreiten von Krankheiten unterstreichen können. Lipide, die sich oft auf präsymptomatischer Ebene verändern, sind eine aufstrebende Quelle für Wirkstoffziele und Biomarker. Viele neurologische Erkrankungen weisen Neuroinflammation, Neurodegeneration und neuronale Erregbarkeit als häufige Kennzeichen auf, die teilweise durch spezifische Lipidsignalsysteme moduliert werden. Die Interdependenz und Wechselbeziehung der Synthese verschiedener Lipide führt zu einer Multilipid-, Multienzym- und Multirezeptoranalyse, um die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten neurologischer Kontexte abzuleiten und die Entschlüsselung mechanistischer Aspekte des Krankheitsbeginns und -verlaufs zu beschleunigen. Die Zuschreibung von Lipidrollen an verschiedene Hirnregionen fördert die Bestimmung des molekularen Lipidphänotyps und der Morphologie im Zusammenhang mit einer neurologischen Erkrankung.

Hier wird ein modulares Protokoll vorgestellt, das für die Analyse von Membranlipiden und nachgeschalteten Lipidsignalen zusammen mit mRNA von Enzymen und Mediatoren, die ihrer Funktionalität zugrunde liegen, aus diskreten Hirnregionen extrahiert wird, die für eine bestimmte neurologische Erkrankung und / oder Erkrankung relevant sind. Um ein genaues vergleichendes lipidomisches Profiling zu gewährleisten, wurden die Arbeitsabläufe und Betriebskriterien optimiert und standardisiert für: i) Gehirnprobenahme und Dissektion von Regionen von Interesse, ii) Co-Extraktion mehrerer Lipidsignale und Membranlipide, iii) duale Lipid/mRNA-Extraktion, iv) Quantifizierung durch Flüssigkeitschromatographie Multiple Reaction Monitoring (LC/MRM) und v) Standard-mRNA-Profiling. Dieser Workflow ist für die geringen Gewebemengen geeignet, die durch die Probenahme der funktionell diskreten Hirnunterregionen (d.h. durch Hirnstanzen) erhalten werden, wodurch Verzerrungen in der multimolekularen Analyse aufgrund von Gewebeheterogenität und/oder Tiervariabilität verhindert werden. Um periphere Konsequenzen neurologischer Erkrankungen aufzudecken und translationale molekulare Auslesungen neurologischer Krankheitszustände zu etablieren, werden auch periphere Organentnahmen, -verarbeitungen und deren anschließende lipidomische Analyse sowie Plasmalipidomik verfolgt und beschrieben. Das Protokoll wird an einem Mausmodell für akute Epilepsie demonstriert.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in der Funktion von Lipiden und ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten neurologischer Erkrankungen eröffnen neue Forschungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für neue therapeutische Ziele und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen1. Dokumentierte Unterschiede in der Lipidzusammensetzung in verschiedenen Hirnregionen, die durch moderne molekulare Bildgebungsverfahren wie Massenspektrometrie-Bildgebung und fortschrittliche Massenspektrometrie-Profilierung betont werden, verschieben das Paradigma der Lipiduntersuchung vom gesamten Gehirn hin zu funktionell unterschiedlichen und diskreten Hirnregionen. Die Tatsache, dass die Lipidzusammensetzung in verschiedenen Gehirnregionen variiert, führt zu einer neuen Konzeptualisierung sowohl der Membranlipidempfindlichkeit als auch der nachgeschalteten Lipidsignalisierung als Reaktion auf eine Hirnverletzung oder -reize in den funktionell unterschiedlichen Hirnregionen. Daher erfordern Lipidprotokolle neue Entwicklungen, um die Herausforderung niedriger Gewebemengen für die Erkennung und Quantifizierung mit höherer räumlicher Auflösung und gleichzeitig die Analyse mehrerer Lipidkomponenten von Zellmembranen und Signalwegen zu bewältigen. Auch die Bestimmung von Enzymen, Lipidliganden und Rezeptoren, die an der Regulation ihrer Spiegel und Funktion beteiligt sind, ist von größter Bedeutung, um die bei einer neurologischen Erkrankung betroffenen Signalwege aufzuklären und neue mechanistische Untersuchungen in einem pathophysiologischen Kontext zu leiten.

Neben der erhöhten räumlichen Auflösung des Gehirns gibt es zwei große Schwierigkeiten, die die Entwicklung neuer neurolipidomischer Ansätze herausfordern. Erstens sind die Lipidsignalmoleküle im Vergleich zu membrankonstitutiven Lipiden typischerweise von sehr geringer Häufigkeit. Zweitens weist das Lipidom eine hohe strukturelle Heterogenität auf, die mit einem einzigen analytischen Ansatz schwer zu sezieren ist. Daher sind Extraktions- und Analysemethoden auf verschiedene Lipidkategorien zugeschnitten und werden üblicherweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt.². Shotgun lipidomische Methoden³ sind ausgezeichnete Werkzeuge, um schnell ein breites Profil von Membranlipiden aufzudecken, während eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität, die durch die gezielte Entdeckung und Quantifizierung von massenspektrometrischen Methoden ermöglicht wird, für die Untersuchung von Signallipiden mit geringer Häufigkeit genutzt werden, darunter: i) Entzündungslipide und ii) Lipide, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie Endocannabinoide (eCBs), Aminosäure-verknüpfte Lipide, etc.^4,5. Um Lipidveränderungen sowohl auf Zellmembran- als auch auf Signalebene zu erfassen, die in Gehirnregionen neurologischer Krankheitsmodelle auftreten, werden die Lipidextraktion und -analyse typischerweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt, die aus verschiedenen Tierchargen oder aus verschiedenen Hemisphären gewonnen werden, oder indem eine größere Geweberegion in mehrere Stücke zerlegt wird. Wenn auch die mRNA-Spiegel von Enzymrezeptoren von Interesse sind, erfordert ihre Untersuchung typischerweise die Beschaffung einer eindeutigen Gewebeprobe. Zum Beispiel würde die Untersuchung von Membranlipiden, endogenen Cannabinoiden und mRNA drei verschiedene Gewebeproben erfordern (z. B. zwei Proben für die beiden Lipidextraktionsmethoden - Membranlipide und Signallipide - und anschließend zwei Lipidanalysemethoden - und eine Probe für die mRNA-Analyse). Die Untersuchung von Entzündungslipiden und endogenen Cannabinoiden erfordert zwei verschiedene Gewebeproben, Extraktionsmethoden bzw. Analysemethoden. Ein weiteres Beispiel ist die Untersuchung von mRNA und jeder Lipidkategorie in einer Gehirnstanz- oder Laser-Mikrodissektionsprobe, die folglich zwei verschiedene Tiere benötigt, um zwei Proben pro Gehirn(sub)region zu beschaffen. In solchen Fällen tritt häufig ein erhebliches Maß an Variabilität und/oder schlechter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf, das auf biologische Variabilität und/oder Gewebeheterogenität zurückzuführen ist. Geleitet von diesen praktischen Einschränkungen der multimolekularen Analyse, die insbesondere bei hoher räumlicher Auflösung im Gehirn auftritt, wurde ein dreimoduliges Neurolipidomik-Protokoll entwickelt, das Folgendes umfasst: 1) Koextraktion und Co-Analyse durch LC / MRM von entzündlichen Lipiden (z. B. Eicosanoide (EiCs)) und Lipiden, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie z. B. eCBs²; 2) Co-Extraktion von Phospholipiden (PLs) und eCBs mit anschließender Multiscan LC/MRM und Precursor/Neutral Loss Scan Analyse²; und 3) duale Extraktion von Membran(phospho)lipiden und eCBs sowie mRNA, mit anschließender LC/MRM- und qPCR- oder RNA-Sequenzierungsanalyse⁶. Abhängig von der biologischen Fragestellung, die bei einer neurologischen Erkrankung behandelt werden soll, und der interessierenden Hirnregion kann eine Kombination aus dem ersten und dem zweiten Protokoll oder dem ersten und dritten Protokoll auf dieselbe Gewebeprobe für Gewebe mit einem Gewicht von etwa 4 mg angewendet werden. Das erste und dritte Protokoll können unabhängig voneinander für Gewebe um 2 mg angewendet werden. Das zweite Protokoll kann für Gewebe mit einem Gewicht von nur 0,5 mg angewendet werden. Unabhängig vom gewählten neurolipidomischen Protokollmodul sind die Gewebeentnahme und präanalytische Verarbeitung, die Hirnisolation und Regionsektion sowie das Verfahren zur Opferung des Tiermodells für alle drei Module des Protokolls standardisiert und identisch. Bei unserer Untersuchung neurologischer Erkrankungen werden mit diesen modularen Protokollen immer auch periphere Organe, die für die pathologischen Folgen der Erkrankung relevant sind, gesammelt und analysiert. Darüber hinaus wird regelmäßig Blut für die Plasmalipidomik entnommen, um als Auslesewerkzeug für neurologische Erkrankungen mit Blick auf prospektive translationale Anwendungen zu dienen. Das hier vorgestellte modulare Lipidomik-Protokoll ist sehr vielseitig: skalierbar auf größere Gewebemengen und leicht anwendbar für praktisch jeden Gewebetyp und jede Krankheit. Für die Anwendung des modularen Protokolls (Abbildung 1) bei neurologischen Erkrankungen ist jedes standardisierte Nagetiermodell für den Beginn und das Fortschreiten neurologischer Störungen wie Schädel-Hirn-Trauma, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Epilepsie zugänglich.

Diese Protokolle wurden umfassend angewendet, um Veränderungen des Gewebelipidoms und/oder Transkriptoms in der akuten Phase der Epilepsie im Kainsäure (KA)-induzierten Mausmodell der Epilepsie zu ^{untersuchen2,7}, einem Modell, das in präklinischen Studien aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Temporallappenepilepsie (TLE) häufig verwendet wird ^8,9,10,11. Unter Verwendung dieser Protokolle wurde das therapeutische Potenzial von Arzneimitteln wie Palmitoylethanolamid (PEA)^12,13 im selben Mausmodell für Epilepsie untersucht. Die Studie identifizierte Lipid- und mRNA-Veränderungen mit hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in der Peripherie, zum Zeitpunkt der maximalen akuten Anfallsintensitäten (bei 60 Minuten posteizürischer Induktion) und bei subchronischer und akuter Behandlung mit PEA zu vier verschiedenen Zeitpunkten (20, 60, 120 und 180 min) nach der KA-Anfallsinduktion, einem Zeitfenster, das die akute Phase der Epilepsie abdeckt. Plasma, Gehirne und periphere Organe von unbehandelten KA-injizierten Mäusen, akuten und subchron PEA-behandelten Mäusen sowie Vehikel- und PEA-Vehikel-Kontrollmäusen wurden zu jedem Zeitpunkt ^{gesammelt12,13} und mit dieser molekularen Analyse untersucht. Die molekularen Daten korrelierten mit Verhaltensphänotypen, die durch Anfallsbewertung erhalten wurden, sowie mit immunhistochemisch abgeleiteten Daten zu neurodegenerativen Prozessen, um das Fortschreiten der akuten Epilepsiephase und das Potenzial von PEA, sie zu lindern, zu entschlüsseln.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Versuchsverfahren entsprechen der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 22. September 2010 (2010/63EU) und wurden vom örtlichen Tierausschuss des Landes Rheinland-Pfalz genehmigt (Aktenzeichen: 23 177-07/G16-1-075).

1. Tiermodell der akuten und prophylaktisch behandelten KA-induzierten Epilepsie

1. Führen Sie Anfallsinduktion, Behandlung und Verhaltensbewertung durch.
   1. Getrennte Mäuse (mindestens n = 6 Mäuse pro Gruppe) in Einzelkäfigen.
   2. Herstellung einer Anfallsinduktionsinjektionslösung und des entsprechenden Vehikels (siehe Tabelle 1) sowie der Behandlungsinjektionslösung und des entsprechenden Vehikels (siehe Tabelle 2).
   3. Injizieren Sie Mäuse intraperitoneal (i.p.) (10 ml/kg Mauskörpermasse) ohne Anästhesie entsprechend ihrer Gruppenidentität: Krankheit, behandelt oder vehikelbehandelt (d. h. KA, PEA-behandelte KA und die beiden Vehikelgruppen). Siehe Abbildung 2, Tabelle 1 und Tabelle 2.
   4. Überwachen und bewerten Sie das Verhalten gemäß der folgenden standardisierten Anfallsintensitätsskala: 0 = keine Reaktion; 1 = Unbeweglichkeit und Starren; 2 = Vorderglied und/oder Schwanzstreckung, starre Haltung; 3 = sich wiederholende Bewegungen, Kopfwippen; 4 = Aufzucht und Sturz; 5 = kontinuierliches Aufziehen und Fallen; 6 = schwere klonisch-tonische Anfälle; 7 = ^Tod14,15 (Abbildung 3).
2. Führen Sie ein Opferverfahren für die lipidomische und transkriptomische Analyse durch.
   1. Zu vier Zeitpunkten (d. h. 20, 60, 120 bzw. 180 minuten nach der KA- bzw. Fahrzeugeinjektion) werden sechs Mäuse aus jeder der folgenden Gruppen geopfert: PEA-behandeltes, PEA-unbehandeltes epileptisches Vehikel 1 und Vehikel 2 gemäß den von der IACUC genehmigten Protokollen.
   2. Zehn Sekunden nach Erreichen jedes Zeitpunkts betäuben Sie die Mäuse mit einem isoflurangetränkten Gewebe in einer Glaskammer. Bestätigen Sie die Anästhesie durch den Verlust des aufrichtenden Reflexes, der durch die Unfähigkeit angezeigt wird, sich zu bewegen, während die Glaskammer langsam umgeworfen wird. Enthaupten Sie Mäuse mit einer chirurgischen Schere und sammeln Sie Plasma, Gehirn und periphere Organe (siehe Schritte 2.2.2-2.2.4).
      VORSICHT: Die ethischen Vorschriften für Opferverfahren variieren zwischen den lokalen Tierkomitees. Stellen Sie sicher, dass Sie die vom örtlichen Tierkomitee erlassenen Vorschriften überprüfen und befolgen.
3. Befolgen Sie das Opferverfahren für die immunhistochemische Analyse.
   1. Für die immunhistochemische ^Färbung13 werden drei Mäuse aus jeder der folgenden Gruppen verhaltensbezogen bewertet: PEA-behandelt, PEA-unbehandelte Epilepsie und Vehikelgruppen über den gesamten Zeitverlauf (180 min).
   2. Opfern und perfundieren Sie Mäuse 5 Tage später. Tiefe Betäubung von Mäusen (siehe Schritt 1.3.1 für die Mausgruppen) durch i.p. Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg) und Buprenorphin (0,1 mg/kg) als Betäubungsmittel. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie durch den Verlust des Reflexes zwischen den Zehen.
   3. Befestigen Sie die Maus auf einer Styroporplatte und öffnen Sie den Thorax sofort mit einer feinen Schere und einer Standardzange. Setzen Sie den Schmetterling in die linke Herzkammer und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer feinen Schere ab.
   4. Stellen Sie die Drehzahl und den Druck der Pumpe auf einen konstanten peristaltischen Durchfluss mit einer Rate von 2−3 ml/min ein. Mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für ~5 min perfundieren. Ersetzen Sie bei Bedarf den Schmetterling.
      HINWEIS: Bei richtiger Durchblutung beginnen die inneren Organe (mit Ausnahme der Milz) innerhalb von 1−2 min auszubleichen.
   5. Perfusion für ~5 min auf eiskalte 4% ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung umschalten. Isolieren Sie das ganze Gehirn wie in Schritt 2.2.2 beschrieben und fixieren Sie es für 24 h in 4% iger PFA-Lösung bei 4 °C.
   6. Inkubieren Sie Gehirne in 30% iger Saccharoselösung für 48 h bei 4 °C. Entfernen Sie die übrig gebliebene Saccharose mit einem trockenen Seidenpapier und frieren Sie die Gehirne auf einer Metallplatte (-80 °C) ein. Lagern Sie das Gehirn bei -80 °C für die ^{Färbevorgänge13}.

2. Probenahmeverfahren für die lipidomische/transkriptomische Analyse

1. Bereiten Sie sich auf die Probenahme vor.
   1. Vorkühl-EDTA-Röhrchen für plasmaförmige Probenahme bis 4 °C. Zentrifugen- und Wirbelapparatur auf 4 °C vorkühlen. Die mit Aluminiumfolie bedeckte Metallplatte (um gefrorenes Gehirn und/oder andere Gewebe von Interesse zu zerbrechen) auf Trockeneis (-80 °C) vorkühlen. Die markierten 2 ml und 5 ml Röhrchen auf Trockeneis (-80 °C) für Plasma-Aliquots, gefrorenes Gewebe bzw. Gehirnentnahme vorkühlen. Verwenden Sie bernsteinfarbene Röhren, um lichtempfindliche Moleküle wie EiCs zu schützen.
   2. Reinigen Sie die Gewebeprobenahme- und Isolationsgeräte (chirurgische Schere, gerade scharfe feine Schere, gerade glatte Standardzange, feine Pinzette mit Spiegelfinish, gebogene Pinzette und Spatel, Polystyrolschaumplatte und Nadeln zur Fixierung) mit einem Desinfektionsmittel (z. B. 70% Ethanol).
2. Sampling-Protokolle
   1. Bestimmen Sie die Reihenfolge der Stichproben.
      1. Blut unmittelbar nach der Enthauptung in vorgekühlten 1 ml EDTA-Röhrchen sammeln (siehe Schritt 2.2.3).
      2. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und frieren Sie sofort nach dem Entfernen ein. Dieser Schritt dauert 1−2 Min. Gefrorene Gehirne zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern (siehe Schritt 2.2.2).
      3. Entfernen Sie periphere Organe von Interesse (z. B. Lunge, Herz, Leber) innerhalb von 5 Minuten nach der Entfernung des Gehirns und frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei -80 °C zur weiteren Verarbeitung (siehe Schritt 2.2.4).
   2. Entfernen Sie das Gehirn für Dissektions- oder Stanzverfahren. Dieser Vorgang dauert 1−2 min/Gehirn.
      1. Beginnen Sie nach der Enthauptung (siehe Schritt 1.2) mit einer feinen Schere einen Mittellinienschnitt in die Haut. Befreien Sie den Schädel, indem Sie die Haut über die Augen drehen. Greifen Sie bis zur Oberseite des Schädels und machen Sie einen kleinen kaudalen Schnitt, der auf der Höhe des intraparietalen Knochens beginnt. Vermeiden Sie es, durch das Gehirn zu schneiden.
      2. Schneiden Sie fest durch den vordersten Teil des Schädels zwischen den Augen, um die Entfernung des Gehirns zu erleichtern. Kippen Sie eine Seite des Parietalknochens mit einer gekrümmten Schmalmusterzange und brechen Sie ab. Wiederholen Sie den letzten Schritt für die andere Seite.
      3. Entfernen Sie die Hirnhäute. Schieben Sie einen Spatel unter den vorderen Teil des Gehirns (dh den Riechkolben) und neigen Sie das Gehirn sanft nach oben. Schieben Sie den Spatel weiter nach unten, um die Sehkraft und andere Hirnnerven zu brechen.
      4. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und frieren Sie das gesamte Gehirn sofort auf einer vorgekühlten (-80 ° C) Metallplatte ein, wobei die ventrale Seite der Metallplatte (dorsal nach oben) zugewandt ist.
      5. Lassen Sie das Gehirn vollständig einfrieren und in vorgekühlte 5-ml-Röhrchen übergehen und lagern Sie es bei -80 °C bis zur Sezierung der Hirnregionen oder zum Stanzverfahren (siehe Schritte 3.1. und 3.2).
   3. Führen Sie eine Plasmaprobenahme durch.
      1. Vorgekühlte EDTA-Röhrchen mit 10 μL frisch zubereiteter Indomethacin-Verdünnung auf eine Zielkonzentration von 10 μM spitzeln.
      2. Sammeln Sie das Rumpfblut unmittelbar nach der Enthauptung durch sanftes Zusammendrücken des Körpers in vorgekühlte EDTA-Röhrchen auf ein maximales Blutvolumen von 1 ml.
         HINWEIS: Bei richtigem Blutdruck ist kein Quetschen erforderlich. Wenn das Blutvolumen weniger als 1 ml beträgt, verringern Sie die Isofluran-Inkubationszeit, um einen ordnungsgemäßen Blutfluss zu ermöglichen.
      3. Blutröhrchen sofort bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
      4. Entfernen Sie die resultierende obere Plasmaphase und für die Zwecke der Multilipidanalyse aliquot definierte Plasmavolumina in vorgekühlten 2 ml Röhrchen wie folgt: 50 μL für die eCBs/EICs-Analyse, 30 μL für die PLs-Analyse und das verbleibende Plasmavolumen als Backup-Probe oder für andere Arten der Analyse.
      5. Die Plasmaproben werden zur weiteren Extraktion bei -80 °C gelagert (siehe Schritte 4.1.2 und 4.1.4).
   4. Führen Sie eine periphere Organprobenahme durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie hinweise auf die Anatomie der ^Maus16 und die Unterlagen für die obligatorischen Kurse (FELASA), an denen Tierforscher teilnehmen, um die einzelnen Organe, ihr Bindegewebe und/oder ihre Blutgefäße zu identifizieren.
      1. Immobilisieren Sie den Maustorso, um die Organentfernung mit Nadeln zu erleichtern. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt mit einer geraden scharfen Schere auf der Höhe des Schambeins. Verwenden Sie eine stumpfe Standardzange, um die Bauchdecke zu fixieren, während Sie schneiden, um die Bauchhöhle zu öffnen.
      2. Immobilisieren Sie die Haut, um die Entfernung der Bauchorgane mit einer stumpfen Pinzette zu ermöglichen. Für die Herz- oder Lungenentfernung setzen Sie den medialen Schnitt in Richtung brusthöhle fort. Entfernen Sie die Lunge und/oder das Herz mit einer feinen Pinzette.
      3. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig, um Blutungen zu vermeiden. Schneiden Sie das Bindegewebe und die Blutgefäße, verankern Sie das jeweilige Organ, ohne durch das Organ zu schneiden.
      4. Gewebestücke sofort auf vorgekühlte Metallplatten (-80 °C) geben und vollständig einfrieren lassen. Gewebestücke in vorgekühlte Röhrchen überführen und zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern (siehe Schritt 4.1).

3. Biologische Materialaufbereitung

HINWEIS: Für die Co-Extraktion von eCBs/EICs verwenden Sie 2 ml Bernsteinrohre als Extraktionsrohre und fügen Sie in jedes Rohr sieben vorgekühlte Stahlkugeln hinzu. Für die Co-Extraktion von PLs/eCBs und für die Dual-Lipid- und RNA-Co-Extraktion verwenden Sie 2 ml RNAse-freie Extraktionsröhrchen, die mit Keramikperlen versetzt sind (Materialtabelle).

1. Führen Sie eine Gehirndissektion und periphere Organverarbeitung durch.
   HINWEIS: Verwenden Sie Vergrößerungslampen, um die Sichtbarkeit des Gehirns für die Dissektion zu erhöhen.
   1. Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge, einschließlich der Pinzette mit superfeinen Spitzen, 2x mit 70% Ethanol.
   2. Übertragen Sie die gefrorenen Gehirne von -80 °C auf eine Petrischale mit vorgekühltem physiologischem Puffer (pH 5,5) Stellen Sie sicher, dass die Petrischale bei 4 °C ist. Erlauben Sie dem Gehirn, sich vollständig zu entfrieren, um eine Dissektion zu ermöglichen. Testen Sie sorgfältig mit einer Pinzette.
      VORSICHT: Halten Sie das Gehirn nicht länger bei 4 °C als zum Auftauen erforderlich.
   3. Eine Metallplatte auf Eis (4 °C) vorkühlen und mit feuchtem Gewebe bedecken, das in eiskaltem physiologischem Puffer (pH 5,5) getränkt ist, und das Gehirn mit ventraler Seite nach oben vorsichtig auf eine vorgekühlte (4 °C) Metallplatte auf Eis übertragen. Bedecken Sie es mit feuchtem Gewebe, das in eiskaltem physiologischem Puffer (pH 5,5) getränkt ist.
   4. Zerlegen Sie Gehirnregionen innerhalb von maximal 5 Minuten mit einer superfeinen Spitzenzange. Beginnen Sie mit dem Hypothalamus (HYP) und drehen Sie die dorsale Seite nach oben, um mit der rechten Seite fortzufahren. Isolieren Sie den Hippocampus (HCr), den präfrontalen Kortex (PFCr), das Striatum (STRr) und die Großhirnrinde (cCTXr). Dann sezieren Sie die linke Seite. Isolieren Sie den Hippocampus (HCl), den präfrontalen Kortex (PFCl), das Striatum (STRl) und die Großhirnrinde (cCTXl). Sezieren Sie das Kleinhirn und die thalamische Region. Verwenden Sie veröffentlichte anatomische ^{Referenzen16,17} für die Identifizierung von Hirnregionen.
   5. Übertragen Sie jedes zerlegte Stück direkt auf eine mit Aluminiumfolie überzogene, vorgekühlte Metallplatte (-80 °C). Erlauben Sie das Einfrieren und übertragen Sie die isolierten Hirnregionen in die markierten vorgekühlten 2 ml Röhrchen.
   6. Pulverisieren Sie die Gewebestücke mit einem Gewebepulverisierer (bei -80 °C), um das Auftauen des Gewebes zu vermeiden. Im Kühlraum aliquotes Gewebepulver in markierten, vorgekühlten Extraktionsröhrchen, die Keramikperlen oder Stahlkugeln enthalten. Für die Dual-Lipidomics/Transkriptomics-Analyse ist das Gewebepulver Aliquots im Kühlraum zu wiegen. Für die reine Lipidomik-Analyse wählen Sie zwischen Normalisierung auf das Gewebegewicht oder den Proteingehalt. Für letzteres gehen Sie ohne Gewebegewicht weiter vor.
   7. Schneiden Sie die peripheren Organgewebe in Stücke mit einem maximalen Gewicht von 20 mg. Fahren Sie mit der Gewebepulverisierung wie in Schritt 3.1.6 fort.
   8. Fahren Sie mit der Extraktion von Gewebeproben fort (siehe Schritte 4.1.1, 4.1.3 oder 4.1.5) oder lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C für eine spätere Extraktion.
      HINWEIS: Die Gehirnmatrix kann auch verwendet werden, wenn das Studiendesign dies zulässt. Die Methode eignet sich jedoch besser für eine diskrete und begrenzte Anzahl von Hirnregionen, und es ist nicht praktikabel, alle oben genannten Hirnregionen innerhalb des festgelegten Zeitrahmens zu sezieren und zu isolieren.
2. Führen Sie Gehirnstanzen durch.
   1. Montieren Sie das ganze, gefrorene Gehirn auf das Montagesystem (Table of Materials) im Kryostaten. Stellen Sie die Dicke auf 50 μm ein und schneiden Sie im Trimmmodus nahe am gewünschten Bereich.
   2. Färben Sie den Gehirnschnitt (18-20 μm) mit Toluidinblau (0,1% -1%) als Referenz, um die interessierende Subregion zu lokalisieren. Untersuchen Sie die gefärbten Scheiben mit einem Mikroskop, um die zu stanzenden Regionen von Interesse zu identifizieren. Verwenden Sie einen Mausatlas als Referenz, um die geeigneten anatomischen Hirnregionen zu ^finden16. Nehmen Sie Stempel mit einem Durchmesser von 0,8−1,0 mm mit Probenkorren in vorgekühlten Röhrchen.
   3. Wiegen Sie gefrorene Stempel im Kühlraum in gekennzeichneten, vorgekühlten 2 ml Extraktionsrohren mit Keramikperlen oder Stahlkugeln. Verwenden Sie bernsteinfarbene Röhrchen für die Co-Extraktion von eCBs und EICs.
   4. Beginnen Sie die Extraktion (siehe Schritte 4.1.1, 4.1.3 oder 4.1.5) oder lagern Sie die Röhrchen zur weiteren Extraktion bei -80 °C.
3. Führen Sie eine Plasmaverarbeitung durch.
   1. Die gefrorenen Plasmaproben auf Eis (4 °C) legen und auftauen lassen (~20 min).
   2. Stellen Sie sicher, dass das Plasma vollständig ungefroren ist, bevor Sie mit der Extraktion beginnen.
   3. Fahren Sie mit der Plasmaextraktion fort (siehe Schritte 4.1.2 oder 4.1.4).
      HINWEIS: Plasmaproben sollten bis zur Extraktion bei -80 °C bleiben. Vermeiden Sie Zyklen von Auftauen und erneutem Einfrieren.

4. Extraktionsverfahren

1. Führen Sie Flüssig-Flüssig (LLE) Lipid-Co-Extraktionsprotokolle durch.
   1. Führen Sie eine Co-Extraktion von eCBs und EICs aus Gehirnstücken, Stanzen oder Gewebepulverproben durch.
      HINWEIS: Während des gesamten Verfahrens ist ein genaues Pipettieren erforderlich.
      1. Legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und sieben Stahlkugeln auf Eis (4 °C). Fügen Sie 600 μL eiskaltes MTBE und 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) hinzu, die die internen Standards enthalten. Die Zielkonzentration der internen Standards im endgültigen Analysevolumen (50 μL) ist wie folgt: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 und 5 ng/ml für PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 bzw. TXB2-d4.
      2. 400 μL 0,1 M Ameisensäure zugeben und mit einem Gewebelysator homogenisieren (30 s-1 min). Zentrifugieren Sie das Homogenat für 15 min bei 5.000 x g bei 4 °C. Einfrieren der wässrigen unteren Phase für 10 min bei -80 °C einwirken lassen, um die Übertragung der oberen organischen Phase zu erleichtern.
      3. Übertragen Sie die organische Phase in neue Röhrchen. Unter einem sanften _N2-Strom bei 37 °C verdampfen und zur weiteren Analyse in 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) rekonstituieren.
      4. Lagern Sie die wässrige Phase bei -20 °C oder -80 °C zur weiteren Analyse des Proteingehalts.
   2. Durchführung der Co-Extraktion von eCBs und EICs aus Plasmaproben.
      1. Plasma-Aliquots bei 4 °C auftauen. Fügen Sie 800 μL MTBE und 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) hinzu, die die internen Standards enthalten (analog zu denen, die für die Gewebeanalyse verwendet werden, siehe Schritt 5.1.1). Optimieren Sie die interne Standardkonzentration für das Spiking mit Referenzplasmaproben.
      2. 600 μL 0,1 M Ameisensäure und Wirbelproben bei 4 °C für 2 min zugeben. Zentrifugenproben bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C.
      3. Die organische Phase in neue Röhrchen überführen, unter einem sanften _N2-Strom bei 37 °C verdampfen und in 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) für die LC/MRM-Analyse rekonstituieren.
         HINWEIS: Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Lagerung von getrockneten Extrakten aus EICs und fahren Sie sofort mit der LC/MRM-Analyse fort. Wenn die Lagerung nicht vermieden werden kann, greifen Sie auf eine Kurzzeitlagerung für nur 2−3 Tage bei 4° C mit Proben in LC-Injektionslösungsmittel zurück.
   3. Führen Sie eine Co-Extraktion von PLs und eCBs aus Gehirnregionen, Stanzen oder anderen Gewebepulverproben durch.
      1. Legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und Keramikkügelchen auf Eis (4 °C). Fügen Sie 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) und 10 μL MeOH mit den internen Standards hinzu. Die Zielkonzentration der internen Standards im endgültigen Analysevolumen (100 μL) ist wie folgt: 150 ng/ml für PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 bzw. 3 ng/ml PEA-d4.
      2. Fügen Sie 200 μL 0,1% Ameisensäure mit 25 μM Tetrahydrolipstatin/URB597 und 50 μg/mL BHT hinzu. Mit dem Gewebehomogenisator homogenisieren (Materialtabelle) und 15 min bei 5.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
      3. Gewinnen Sie die obere organische Phase in neuen Rohren zurück und verdampfen Sie unter einem sanften _N2-Strom bei 37 °C. Rekonstituieren Sie in 90 μL MeOH und lagern Sie es entweder bei -20 °C oder -80 °C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
      4. 10% _H2O zu einem Aliquot Lipidextrakt (4.1.3.3) geben und 10 μL in die LC/MS zur PLs-Analyse injizieren. Für weitere eCB-Analysen fahren Sie mit Schritt 4.3.5 fort.
      5. Ein Aliquot des Extrakts (4.1.3.3) wird entnommen, getrocknet und in ACN/_H2O (1:1; v/v) rekonstituiert. Verwenden Sie 20 μL für die LC/MS-Injektion für die eCB-Analyse.
   4. Führen Sie eine Co-Extraktion von PLs und eCBs aus Plasmaproben durch.
      1. Plasma-Aliquots bei 4 °C auftauen, 1.000 μL MTBE/Methanol (10:3; v/v) und 10 μL MeOH mit internen Standards (analog zu Schritt 4.1.3) und Wirbel bei 4 °C für 1 min hinzufügen.
      2. 250 μL _{H2O zugeben} und 45 min bei 4 °C wirbeln. Zentrifugenproben für 15 min bei 5.000 x g und 4 °C. Gewinnen Sie die obere organische Phase zurück, verdampfen Sie unter einem sanften Strom von _N2 bei 37 °C und rekonstituieren Sie in 90 μL Methanol für weitere LC / MS-Analysen. Bei -20 °C oder -80 °C lagern oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
      3. Für die PLs-Analyse werden 10 % Wasser zu einem Aliquot Lipidextrakt (4.1.2.2) gegeben.
      4. Für die eCB-Analyse werden 10 % Wasser zu einem Aliquot des Lipidextrakts gegeben (siehe 4.1.4.3), bis zur Trockenheit verdampft und in 50 % ACN/_H2O (1:1; v/v) rekonstituiert.
   5. Führen Sie eine doppelte Extraktion von RNA und Lipiden (Co-Extraktion von PLs und eCBs) aus Gewebeproben durch.
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Sie unter RNA-freien Bedingungen arbeiten, um einen RNA-Abbau zu vermeiden.
      1. Tauen Sie Gewebepulver aliquots oder Gehirnbündel (bei 4 °C) auf und geben Sie 600 μL RLT-Puffer mit 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT und 1% β-Mercaptoethanol (für Prozentsätze des Endvolumens des Homogenisierungspuffers siehe Schritt 4.1) zusammen mit 200 μL Chloroform in Extraktionsröhrchen mit gefrorenen Hirnstempeln und Keramikperlen.
      2. Spike-Proben mit 10 μL interner Standardmischung für PLs und eCB-Co-Extraktion (siehe Schritt 4.1.3) und homogenisieren mit Gewebehomogenisator (hohe Geschwindigkeit, 20 s).
      3. Lysate in neue Zentrifugenrohre und Zentrifugen für 5 min bei voller Geschwindigkeit und 4 °C überführen, um die Phasentrennung zu ermöglichen.
      4. Rückgewinnung und Verwendung der oberen Phase für die RNA-Extraktion unter Verwendung von Standard-RNA-Extraktionsverfahrenskits (Materialtabelle). RNA in einem Gesamtvolumen von 50 μL RNase-freiem Wasser eluieren und bei -80 °C lagern.
         ANMERKUNG: Die Probe in Schritt 4.1.5.4 ist sowohl für die RNA-Sequenzierung als auch für die qPCR unter Verwendung der geeigneten Methoden und Instrumente geeignet.
      5. Verwenden Sie die untere chloroformhaltige Phase für die Lipidextraktion. 800 μL MTBE/Methanol (10:3; v/v) und 200 μL 0,1% Ameisensäure und Wirbel für 45 min bei 4 °C zugeben. Gewinnen Sie die obere organische Phase zurück und verdampfen Sie unter einem sanften _N2-Strom bei 37 °C.
      6. Rekonstitution in 90 μL Methanol für weitere LC/MS-Analysen. Bei -20 °C oder -80 °C lagern oder mit Schritt 5 fortfahren.
      7. 10% _H2O zu einem Aliquot Lipidextrakt geben (siehe oben Schritt 4.1.5.6) und 10 μL in die LC/MS zur PLs-Analyse injizieren. Für weitere eCB-Analysen fahren Sie mit Schritt 5.7 fort.
      8. Ein Aliquot des Extrakts (siehe oben Schritt 4.1.5.6) wird verdampft und in ACN/_H2O (1:1; v/v) rekonstituiert. Verwenden Sie 20 μL für die LC/MS-Injektion für die eCB-Analyse (analog zu Schritt 4.3.5).

5. Qualitatives und quantitatives LC/MRM-Profiling

1. Bereiten Sie LC-Lösungsmittelsysteme, Kalibrierlösungen und Qualitätskontrollproben vor.
   1. Für PLs bereiten Sie die mobile Phase A vor: Methanol/Wasser (1:1; v/v) mit 7,5 mM Ammoniumformiat und 0,1% TEA. Herstellung der mobilen Phase B: Methanol/Isopropanol (2:8; v/v) mit 7,5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % TEA. Lagern Sie Lösungsmittel in LC-Flaschen.
   2. Bereiten Sie für die Trennung von eCB und eiC die folgenden LC-Lösungsmittel vor: 0,1% Ameisensäure als mobile Phase A und 100% ACN mit 0,1% Ameisensäure als mobile Phase B. Lagern Sie Lösungsmittel in LC-Flaschen.
   3. Bereiten Sie Qualitätskontrollen unter Verwendung der Kalibrierstandards und internen Standards (Tabelle 3) in einer äquimolaren oder benutzerdefinierten Konzentration vor.
   4. Bereiten Sie Kalibrierkurven mit sieben Konzentrationspunkten vor. Verwenden Sie dieselbe interne Standardcharge, um die Kalibrierkurvenlösung und die zu analysierenden Proben zu spitzen.
2. Verwenden Sie die LC-MRM-Methode für qualitative und quantitative Lipidprofile.
   1. Öffnen Sie die Registerkarte Build Acquisition Method in der kommerziellen Software (z. B. Analyst) und wählen Sie den LC/MRM-Modus mit Polaritätsumschaltung. Setzen Sie in der Methode die Ionenübergänge (wie in Tabelle 3 angegeben) für die quantitative Profilerstellung ein. Setzen Sie die Einschwingzeit auf 50 ms.
   2. Stellen Sie für die PLs-Profilierung die folgenden Ionenquellenparameter ein: Vorhanggas = 40 psi; Temperatur des Heizkörpers = 550 °C; Ionensprühspannung = -4.500 V im negativen Ionenmodus und = +5.200 V im positiven Ionenmodus.
   3. Stellen Sie für die Co-Analyse von eCBs und EICs die folgenden Parameter ein: Vorhanggas = 40 psi; Temperatur des Heizkörpers = 550 °C; Ionensprühspannung = -4.500 V im negativen Ionenmodus und = +4.500 V im positiven Ionenmodus.
   4. Für die PL-Analyse die Säulenerwärmung auf 45 °C und den Durchfluss auf 200 μL/min einstellen und folgenden Gradienten einstellen: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B und min 52 = 40% B. Injektionsvolumen auf 10 μL einstellen.
   5. Stellen Sie für die eCBs- und EICs-Analyse die Säulentemperatur auf Raumtemperatur ein und stellen Sie den folgenden Gradienten ein: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Injektionsvolumen auf 20 μL einstellen.
      HINWEIS: MrM-Bedingungen können zwischen instrumentellen Plattformen variieren, daher müssen Fragmentierung und MRM-Bedingungen experimentell abgeleitet werden und Ionisationsparameter sollten getestet und bei Bedarf angepasst werden, um maximale Empfindlichkeit und Selektivität zu erhalten.
3. Führen Sie eine Chargenanalyse durch.
   1. Öffnen Sie den Build Acquisition-Batch und geben Sie die erforderlichen Parameter für die Probenbeschreibung, die Position im Probenrack des Autosamplers und die Erfassungsmethode (festgelegt als Schritt 5.2) ein.
   2. Schließen Sie Qualitätskontrollen immer zu Beginn und am Ende der Analyse und innerhalb der Charge ein. Fügen Sie nach jeweils 25-30 Proben mindestens drei Kalibrierkurven in die Charge ein und fügen Sie nach jeder Qualitätskontrollprobe, Kalibrierkurve und am Ende der Probencharge einen Waschschritt mit einem Lösungsmittel Ihrer Wahl hinzu.
   3. Transferproben, die in Schritt 4 in LC/MS-Durchstechflaschen gewonnen wurden. Legen Sie die Proben entsprechend der in der Charge definierten Position in die Ladegestelle des LC-Autosamplers und laden Sie das Probenrack in den LC-Autosampler.
   4. Stapel- und Warteschlangenanalyse senden.
4. Lipidquantifizierung
   1. Verwenden Sie die kommerzielle Software (z. B. Analyst) und das eingebettete Quantifizierungsmodul für die Quantifizierung von eCBs und EICs sowie kommerzielle Software (z. B. Multiquant) für die PLs-Quantifizierung.
      HINWEIS: Die zweite Software kann auch für eCBs und EICs verwendet werden, insbesondere wenn ein interner Standard für die Quantifizierung mehrerer Analyten verwendet wird.
   2. Öffnen Sie die Build-Quantifizierungsmethode und füllen Sie die Parameter für Analyten, interne Standards, MRM-Übergänge aus und schreiben Sie die internen Standards den zu quantifizierenden Analyten zu (Tabelle 3). Stellen Sie die minimale Peakhöhe auf 500 cps ein.
   3. Verwenden Sie die folgenden Kriterien oder kombinationen davon für die Lipididentitätszuweisung und die anschließende Quantifizierung6: Retentionszeitabgleich von endogenen Lipidanalyten mit Kalibrierstandards und/oder deuterierten internen Standards, sofern verfügbar; Fragmentionenanpassung durch positive und negative Ionenmodenfragmentierung für einen gegebenen m/z von Lipidanalyten, für die keine Standards angegeben sind; literaturgeleitetes Elutionsverhalten von Lipiden unter ähnlich eingesetzten LC-Bedingungen zur Sezierung isomerer und/oder isobarer Strukturen; und, soweit verfügbar, LC/MS- und MS/MS-Analysen mit hochauflösender Massenspektrometrie unter Verwendung ähnlicher LC-Bedingungen wie bei der gezielten Analyse (unter Verwendung von LC/MRM), um die Identität und das Elutionsverhalten endogener Lipide von Interesse genau zu ^{identifizieren18,19}.
   4. Verwenden Sie für die Validierung der Chargenanalyse die folgenden Kriterien: Genauigkeit der Quantifizierung ≤ ±20%; Regressionskoeffizient ≥0,97 (idealerweise ≥0,99).
      HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien für die Entwicklung und Validierung bioanalytischer Methoden, um eine zuverlässige, reproduzierbare Analyse der Zielmoleküle zu gewährleisten.

Ergebnisse

Der Satz der beschriebenen Protokolle kann auf verschiedenen Ebenen zielspezifisch kombiniert werden, z. B. wahlweise des Tiermodells, Probenahmeweg, Extraktionsmethode und Profilerstellung (Abbildung 1).

Um Lipidspiegeländerungen im Gehirn und in der Peripherie über einen bestimmten Verlauf eines akuten epileptischen Anfallszustands zu bestimmen und die potenzielle antiepileptische

Diskussion

Die hier beschriebene neurolipidomische und transkriptomische Methodik ist ein praktikables Mittel, um jede Krankheit oder gesunde Entwicklung bei hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in peripheren Organen zu untersuchen. Aufgrund der optimierten Plasmaprobenahme- und Handhabungsverfahren kann die Plasmalipidomanalyse auch von denselben Tieren durchgeführt werden, die für die Gewebelipidomik und Transkriptomik geopfert wurden, wodurch die Zuverlässigkeit der molekularen Korrelate von Gewebeblut und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS