JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تطوير طريقة لإنشاء خطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب من خلايا سرطان الغدة الرئوية PC-9، وتميزت الخلايا المقاومة. يمكن استخدام الخلايا المقاومة للتحقيق في مستقبلات عامل النمو البشرة التيروزين كيناز آليات مقاومة مثبطات، تنطبق على المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة.

Abstract

المقاومة المكتسبة لمثبطات الهدف الجزيئي هي مشكلة خطيرة في علاج السرطان. ولا يزال سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في معظم البلدان. اكتشاف "طفرات السائق الأنسيجينية"، مثل مستقبلات عاملنمو البشرة (EGFR) - تنشيط الطفرات، والتطور اللاحق للعوامل المستهدفة الجزيئية من مثبطات كيناز التيروزين EGFR (TKIs) (gefitinib، erlotinib، afatinib, dacomitinib, وosimertinib) قد غيرت بشكل كبير علاج سرطان الرئة في العقود الأخيرة. ومع ذلك، لا تزال هذه الأدوية غير فعالة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) تحمل EGFR-تفعيل الطفرات. بعد المقاومة المكتسبة، لا يزال التقدم المنهجي لNSCLC عقبة كبيرة في علاج المرضى الذين يعانون من الطفرة الإيجابية EGFR NSCLC. هنا، نقدم طريقة تصعيد الجرعة التدريجية لإنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقلة مقاومة للأفاتينيب المكتسبة من خلايا NSCLC PC-9 التي تأوي طفرات EGFR-تفعيل من 15 قاعدة حذف الزوج في EGFR exon 19. يتم عرض طرق لتوصيف خطوط الخلايا الثلاثة المستقلة المقاومة للعفاتينيب لفترة وجيزة. إن آليات المقاومة المكتسبة للمعارف التقليدية في إطار الـ EGFR غير متجانسة. ولذلك، يجب فحص خطوط الخلايا المتعددة التي لها مقاومة مكتسبة للمعارف التقليدية في مصر. هناك حاجة إلى عشرة إلى اثني عشر شهرا للحصول على خطوط الخلايا مع المقاومة المكتسبة باستخدام هذا النهج تصعيد الجرعة stepwise. وسيسهم اكتشاف آليات جديدة للمقاومة المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأمانا.

Introduction

خمسة مثبطات كيناز التيروزين, استهداف مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR), بما في ذلك gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, وosimertinib متاحة حاليا لعلاج المرضى الذين يعانون من الطفرة EGFR إيجابية الرئة غير الصغيرة الخلية السرطان (NSCLC). على مدى العقد الماضي، شهدت العلاجات لهؤلاء المرضى تطورا كبيرا مع اكتشاف إمكانات جديدة EGFR-TKIs. بين المرضى الذين يعانون من سرطان الغدة الدرقية في الرئة، يتم تحديد الطفرات الجسدية في EGFR في ما يقرب من 50٪ من الآسيويين و 15٪ من المرضى القوقازيين1. الطفرات الأكثر شيوعا في EGFR هي طفرة نقطة L858R في EGFR exon 21 و 15 زوج قاعدة (BP) الحذف في EGFR exon 192. في المرضى الإيجابية الطفرة EGFR مع NSCLC، EGFR-TKIs تحسين معدلات الاستجابة والنتائج السريرية مقارنة مع المعيار السابق للعلاج الكيميائي البلاتين doublet3.

وكان جيفيتينيب وإرلوتينيب أول مثبطات جزيء صغيرة معتمدة ويشار إليها عموما ً باسم الجيل الأول من المعارف التقليدية غير التقليدية. هذه EGFR TKIs كتلة نشاط كيناز التيروزين من خلال التنافس مع ATP وملزمة عكسها لمواقع الربط ATP4. Afatinib هو الجيل الثاني من EGFR TKI التي ترتبط بشكل لا رجعة فيه وبشكل مشترك إلى مجال كيناز التيروزين من EGFR ويتميز بأنه مثبط الأسرة EGFR عموم الإنسان5.

على الرغم من الفائدة الكبيرة من هذه العلاجات في المرضى الذين يعانون من NSCLC، اكتسبت مقاومة أمر لا مفر منه. آلية المقاومة الأكثر شيوعا ضد الجيل الأول والثاني EGFR TKIs هو ظهور طفرة T790M في EGFR exon 20، وهوموجود في 50-70٪ من عينات الورم 6،7،8. وتشمل آليات المقاومة الأخرى إشارات الالتفافية (إلى MET، IGF1R، وHER2)، والتحول إلى سرطان الرئة الخلية الصغيرة، وتحريض الانتقال الظهاري إلى mesenchymal، والتي تحدث قبل سريريا وسريريا9. إن آليات المقاومة للمعارف التقليدية في إطار القانون الدولي غير متجانسة. من خلال تحديد آليات المقاومة الجديدة في الدراسات ما قبل السريرية، قد يكون من الممكن تطوير علاجات جديدة للتغلب على المقاومة. يجب أن تراعي علاجات التسلسل الأمثل التي تحقق أقصى قدر من الفائدة السريرية للمرضى آليات المقاومة والهدف العلاجي.

لا بد من اختيار خط الخلية الأبوية الصحيح، كما هو أساس جميع التجارب اللاحقة. تبدأ استراتيجيات الاختيار بالأهمية السريرية؛ من الضروري اختيار خط الخلايا السذاجة العلاج الكيميائي والإشعاعي. قد يؤدي العلاج الكيميائي و/أو الإشعاعي السابق إلى تغيير مسارات المقاومة وتغييرات التعبير عن علامات مقاومة الأدوية. في هذه الدراسة، يتم استخدام خلايا PC-9، التي تحمل 15 نقطة أساس الحذف في EGFR exon 19، لإنشاء مقاومة المكتسبة لafatinib. تم اشتقاق هذا الخط الخلوي من مريض ياباني من NSCLC، الذي لم يتلق العلاج الكيميائي والإشعاعي المسبق.

لأن afatinib تدار شفويا على أساس يومي، والعلاج المستمر في المختبر، حيث يتم زراعة الخلايا باستمرار في وجود afatinib ستكون ذات الصلة سريريا. يجب تحسين جرعة الأدوية المستخدمة في مختلف خطوات التجربة لخط الخلية الأبوية المختارة. ويمكن استخدام فحص السمية الخلوية لتحديد مجموعة مناسبة من المخدرات، والتي ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة مع المعلومات الدوائية للدواء.

وطوال عملية الاختيار، يتم الاحتفاظ بمجموع عدد الخلايا كمجموعة واحدة؛ لا يتم استخدام الاستنساخ أو أساليب الفصل الأخرى. تتعرض الخلايا أولا باستمرار إلى مستوى منخفض من المخدرات. في وقت لاحق ، بعد أن تتكيف الخلايا لتنمو في وجود الدواء ، يتم زيادة جرعة الدواء ببطء إلى الجرعة المثلى النهائية من الدواء10،11. بدلا من ذلك، يمكن استخدام نبض إدارة المخدرات أو الطفرات لاختيار خلايا المقاومة، والتي يتم تنفيذها أيضا قبل العلاج من المخدرات 12،13. ولسوء الحظ، لا يتم الإبلاغ عموما عن الحالات التي تفشل فيها مقاومة المخدرات في التطور. يتم تطوير استراتيجيات الاختيار بهدف محاولة تقليد ظروف مرضى السرطان لإعادة بناء المقاومة ذات الصلة سريريا. في بعض الأحيان ، لتحديد التغيرات الجزيئية المرتبطة بآليات مقاومة المخدرات ، يتم استخدام تركيز عالي للأدوية. يصبح هذا النموذج أقل أهمية سريريا.

هنا، ونحن نصف طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 التي تحتوي على 15 نقطة في الثانية حذف في EGFR exon 19، فضلا عن التوصيف الأولي لخطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إنشاء ثلاثة خطوط خلية مستقلة مقاومة للأفاتينيب PC-9

  1. تحديد التركيز الأولي للتعرض للأفاتينيب لخلايا PC-9 باستخدام الفحص 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
    1. ثقافة خلايا PC-9 في وسط النمو تحتوي على مصل البقر الجنيني (10٪)، البنسلين (100 U/mL)، والعقدية (100 ميكروغرام / مل) في خلية الثقافة علاج طبق 10 سم في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية.
    2. إعادة تعليق خلايا PC-9 في 4 × 104 خلايا / مل في متوسط النمو ومن ثم البذور في 50 درجة مئوية / جيدا في ميكروبليت 96 جيدا. التركيز النهائي للخلايا هو 2.0 × 103 خلايا / 50 ميكرولتر / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من محلول أفاتينيب بتركيزات مختلفة: 0، 0.002، 0.006، 0.02، 0.06، 0.2، 0.6، 2، 6، و 20 ميكرومتر إلى الآبار التي تحتوي على وسط النمو (50 ميكرولتر). الحجم النهائي وتركيزات afatinib هي 100 ميكرولتر و 0.001 و 0.003 و 0.01 و 0.03 و 0.1 و 0.3 و 1 و 3 و 10 ميكرومتر على التوالي.
    4. احتضان لوحة 96 جيدا لمدة 96 ساعة في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية.
    5. إضافة 15 ميكرولتر من محلول الصبغة (انظر جدولالمواد) إلى كل بئر وحضانة لمدة 4 ساعة في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية، ثم إضافة 100 درجة مئوية من الذوبان / وقف الحل (انظر جدولالمواد) إلى كل بئر وحضانة بين عشية وضحاها في CO 5٪ c10>2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
    6. قياس الكثافة البصرية عند 570 نانومتر (OD570)باستخدام قارئ لوحة صغيرة (انظر جدولالمواد). إعداد 6-12 تكرار وتكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل.
    7. استخدام البرمجيات الإحصائية (انظر جدولالمواد) لرسم هذه البيانات بيانيا كرسم بياني شبه سجل وحساب قيمة IC50، وهو تركيز الدواء الذي يقلل من الاستجابة إلى 50٪ من الحد الأقصى (انظر جدول المواد ).
  2. التعرض المستمر لخلايا PC-9 إلى EGFR-TKI لا رجعة فيه، afatinib، عن طريق تصعيد الجرعة التدريجية في ثلاثة أطباق مستقلة 10 سم
    1. ثقافة PC-9 الخلايا في الأطباق p100 التي تحتوي على 10 مل من متوسط النمو. عندما تصل خلايا PC-9 إلى مرحلة sub-confluent، نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى ثلاثة أطباق P100 جديدة، مع 9 مل من متوسط النمو. تصبح خلايا PC-9 المخففة 1:10 دون الأنفية في 3-4 أيام، مع عدد خلايا من حوالي 4-5 × 105 خلايا/مل.
    2. في اليوم التالي، أضف 1/10 من قيمةIC 50 من afatinib في كل من الأطباق الثلاثة p100.
      ملاحظة: يتم إعادة تشكيل Afatinib في DMSO بتركيزات المخزون من 1 μM، 10 μM، 100 μM، 1 mM، و 5 mM. 1 إلى 10 ميكروغرام من محلول أفاتينيب يضاف إلى 10 مل من النمو المتوسط في الثقافة، وفقا للتركيزات النهائية المطلوبة.
    3. عندما تصبح الخلايا في الأطباق p100 التي تحتوي على afatinib دون الأنفية، تخلط جيدا مع الطموح مع ماصة 1 مل وإضافة 1 مل من تعليق الخلية إلى 9 مل من وسط النمو الطازج في طبق جديد P100. بعد ذلك، إضافة تركيزات أعلى 10-20٪ من afatinib إلى الثقافة الجديدة.
    4. زيادة تركيز afatinib من 0.1 nM إلى 1 μM في المتوسط عن طريق تصعيد الجرعة التدريجية مع تركيز afatinib زيادة بنسبة 10-20٪ في كل خطوة على مدى فترة 10-12 شهرا.
      ملاحظة: عندما يقترب تركيز afatinib من قيمة IC50، يصبح نمو الخلايا بطيئاً جداً. إذا تم تقسيم الخلايا 1:9، فإنها قد لا تنمو، كما يتم قتل هذه الخلايا من قبل تركيزات أعلى من afatinib. لذلك، في تركيزات afanitib أعلى، يمكن تقسيم الخلايا بنسبة 1:2. وتزرع الخلايا الأكثر مقاومة في المتوسطة التي تحتوي على afatinib لمدة 3-14 يوما، ولم يتم تغيير المتوسطة حتى الخلايا المقاومة تحتاج إلى مرور.
    5. زراعة الخلايا المقاومة للأفاتينيب لمدة 2-3 أشهر في 1 μM afatinib التي تحتوي على وسط النمو. في تركيز afatinib من 1 μM, 10-12 أشهر مطلوبة لتطوير مقاومة أفاتينيب في هذا النموذج. إجراء التبيع MTT للتأكد من أن الخلايا مقاومة لafatinib. وكانت خطوط الخلايا الثلاثة للمقاومة التي أنشئت بشكل مستقل هي AFR1 وAFR2 وAFR3.

2. توصيف ثلاث خلايا مستقلة مقاومة للأفاتينيب

  1. تحديد منحنى نمو الخلايا الأبوية PC-9 وإنشاء خلايا مقاومة للأفاتينيب
    1. ثقافة خلايا PC-9 وAFR1 وAFR2 وAFR3 في وسط النمو في حاضنة CO2 بنسبة 5% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. إعادة تعليق الخلايا في 5 × 103 خلايا / مل مع متوسط النمو، والبذور 100 درجة مئوية / جيدا في لوحة صغيرة 96 جيدا، بحيث التركيز النهائي للخلايا هو 500 خلية / 100 درجة مئوية / جيدا.
      ملاحظة: يتم إجراء تقييم MTT لقياس قيم OD570 في 0 و 1 و 2 و 3 و 5 و 7 أيام. هناك حاجة إلى ستة لوحات صغيرة 96 جيدا لكل يوم.
    3. إجراء بفحص MTT كل 24 ساعة ثم في الأيام 0 و 1 و 2 و 3 و 5 و 7. قياس قيم OD570 وإعداد نسخ متماثل6-12؛ كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل، ورسم رسوميا النتائج باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد).
  2. تحديد تعديلات الحمض النووي الجينومي في EGFR من قبل PCR في الوقت الحقيقي
    ملاحظة: Afatinib هو مثبط جزيء صغير يستهدف كيناز التيروزين EGFR. يتم تحديد حالة التعبير EGFR على مستويات الحمض النووي والبروتين.
    1. يتم عزل الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (انظر جدولالمواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قياس تركيز الحمض النووي الجينومي المعزول مع مقياس الطيف الضوئي (انظر جدولالمواد) وضبط جميع عينات الحمض النووي الجينومي إلى 25 نانوغرام/ ميكرولتر.
    2. تضخيم 50 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي، وهو ما يعادل 2 ميكرولتر من مخزونات 25 نانوغرام/ميكرولتر، باستخدام مزيج رئيسي أخضر SYBR (انظر جدولالمواد) وتحليل النتائج باستخدام نظام الكشف عن RT-PCR القائم على الفلورة (انظر جدولالمواد).
      ملاحظة: بدأت ظروف ركوب الدراجات PCR مع خطوة denaturation الأولية في 95 درجة مئوية لمدة 20 s، تليها 40 دورات من 95 درجة مئوية denaturation لمدة 3 s، 60 درجة مئوية الصلب لمدة 30 s. مجموعات التمهيدي محددة هي كما يلي: EGFR F: 5′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3′, R: 5′-CTGGAATGAGGTGAACA-3′. تطبيع الجينات خط-1 F: 5′-AAAGCCGCTCAACTAACTACATGG-3′, R: 5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′.
  3. تقييم تأثير تعديلات البروتين على مستوى EGFR من خلال تحليل اللطخة الغربية
    1. علاج الخلايا مع afatinib باستمرار قبل التجارب لمدة 24 h. غسل PC-9، AFR1، AFR2، وAFR3 الخلايا مرتين مع PBS ومن ثم زرعها في وسائل الإعلام النمو دون afatinib. غسل PC-9، AFR1، AFR2، وAFR3 الخلايا مرتين مع 5 مل من PBS الجليد الباردة.
    2. Lyse الخلايا في RIPA العازلة التي تحتوي على 1٪ كوكتيل مثبطات البروتياز (انظر جدولالمواد) وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز الثاني والثالث (انظر جدولالمواد) واحتضان هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في 100 × ز و 4 درجة مئوية وجمع lysates تطهيرها.
    3. تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار حمض البيكينشونينيك (انظر جدولالمواد)، وضبط جميع عينات البروتين إلى 0.5 أو 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام 4X عينة العازلة (500 mM Tris (PH 6.8)، 40٪ الجلسرين، 8٪ SDS، 20٪ H2O، 0.02٪ بروموفينول الأزرق) و 0.02٪ بروموفينول الأزرق) و يغلي في 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تخزين هذه العينات البروتين في -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل وصمة عار الغربية.
    4. فصل كميات متساوية من عينات البروتين، ويفضل 20-30 درجة مئوية، بنسبة 8٪ SDS-الصفحة ونقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF).
      ملاحظة: الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولياكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) يستخدم عادة في المختبر لفصل البروتينات على أساس وزنها الجزيئي.
      1. لوحات الزجاج نظيفة مع الإيثانول وتجميع لوحة زجاجية والفواصل. إعداد 8٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد التي تحتوي على 1.5 M تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 8.8، 40٪ بيس-أكريلاميد، 10٪ SDS، 10٪ APS، وTEMED. البلمرة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. في وقت لاحق، وإعداد هلام التراص التي تحتوي على 0.5 M تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 6.8، 40٪ مكررا أكريلاميد، 10٪ SDS، 10٪ APS، وTEMED. إضافة حل هلام التراص، إدراج المشط، والبوليمر هلام لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. وضع المواد الهلامية في جهاز الكهربائي وملء الخزان مع تشغيل العازلة (0.25 M تريس، 1.92 M غليسين، و 1٪ SDS). تحميل كمية متساوية من عينات البروتين (20-30 درجة مئوية) وتشغيل هلام في 180 V. وقف الكهربائي مرة واحدة في الجبهة صبغ يتدفق من هلام، بعد حوالي 60 دقيقة.
      4. اغسل الجل لمدة 1-2 دقيقة مع TBST ثم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF عن طريق النشاف شبه الجاف (انظر جدولالمواد) لمدة 1.5 ساعة في تيار ثابت من 300 مأ.
    5. منع الأغشية مع 5٪ من الحليب الجاف غير الدسم (انظر جدولالمواد) المخفف مع حل TBST (انظر جدولالمواد) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم التحقيق في الأغشية مع المضادة للEGFR، ومكافحة phospho-EGFR (Y1068)، ومكافحة HER2، المضادة لHER3، المضادة للميت، والأجسام المضادة للأكتين (المخفف 1:3000 في TBST) (انظر جدولالمواد) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. غسل الأغشية مع TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق، ومن ثم عرض الأغشية إلى الأجسام المضادة الثانوية (المخفف 1:200 في TBST) لمدة 1-1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الأغشية خمس مرات مع TBST لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتعريضها إلى حل ECL (انظر جدولالمواد)، وتصور الإشارات باستخدام الأفلام.
  4. تحليل الطفرات EGFR عن طريق التسلسل
    1. تضخيم الحمض النووي الجينومي باستخدام التمهيديات محددة لexons EGFR 19-21. تبدأ ظروف ركوب الدراجات PCR مع خطوة denaturation الأولية في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 30 دورات من denaturation في 98 درجة مئوية لمدة 10 s، والصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 s، وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: التمهيديات محددة لEGFR exon 19: F: 5′-GCAATATGCCTTAGGTGTGT-3′ R: 5′-CATAGAAGTGAACATTTAGTGTG-3′, exon 20: F: 5′-CCATGAGTACGTTTTGAAACTC-3′, R: 5′-CATATCCAAACTCTTGC-3′, وexon 21: F: 5′-ATGAACATCACCCTGAATTCGG-3′, R: ′5' GCTCACCCAGAATGTGTGGAGA-3′.
    2. تنقية منتجات PCR تضخيم باستخدام مجموعة تنقية PCR (انظر جدولالمواد) وتسلسل amplicons.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر في الشكل 1مخطط إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 باستخدام إجراء تصعيد الجرعة التدريجية . ويبين الشكل 2 انخفاضاً في انتشار الخلايا في خلايا PC-9 الأبوية مع زيادة تركيز الأفاتينيب، مما يشير إلى أن خلايا PC-9 حساسة للتعرض ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، وصفنا طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب وتميزت هذه الخلايا بالمقارنة مع الخلايا الأبوية PC-9. من خلال التعرض لتصعيد الجرعة التدريجية، اكتسبت خلايا PC-9 الأبوية مقاومة لafatinib على مدى فترة 10-12 شهرا. سريريا، آليات المقاومة لEGFR TKIs غير متجانسة، وبالتالي، بعد العلاج ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر عضو معهد أبحاث الترجمة المتقدمة للسرطان على تعليقاته المدروسة وتحريره على مساعدتهم في تحرير اللغة الإنجليزية. وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة: 16K09590 إلى T.Y.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
afatinibSelleckS1011
anti-EGFR monoclonal antibodycell signaling technology4267S
bicinchoninc acid assaysigmaB9643
cell-culture treated 10 cm dishViolamo2-8590-03
CELL BANKER1 TakaRaCB011cryopreservation media
CellTiter 96Promega G4100 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution
DMSOWako043-07216
ECL solutionPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied Biosystemsfluorescence-based RT-PCR-detection system 
GraphPad Prism v.7 software GraphPad, Inc.a statistical software
NanoDrop Lite spectrophotometerThermospectrophotometer
Nonfat dry milkcell signaling technology9999S
Pen Strepgibco15140-163
phosphatase inhibitor cocktail 2sigmaP5726
phosphatase inhibitor cocktail 3sigmaP0044
Powerscan HT microplate readerBioTek
 Power SYBR Green master mix Applied BiosystemsSYBR Green master mix
protease inhibitor cocktailsigmaP8340
QIAamp DNA Mini kitQiagen51306DNA purification kit
QIAquick PCR Purification KitQIAGENPCR purification kit
RPMI-1640 Wako189-02025with L-Glutamine and Phenol Red
TBST powdersigmaT9039
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cellBio-Radsemi-dry t4ransfer apparatus
96 well microplateThermo130188

References

  1. Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
  2. Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
  3. Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
  4. Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
  5. Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
  6. Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
  7. Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26(2011).
  8. Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
  9. Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
  10. Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
  11. Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
  12. Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
  13. Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
  14. Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
  15. Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
  16. Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
  17. Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
  18. Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
  19. Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
  20. Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148EGFREGFR TKIafatinib

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved