Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib

Toshimitsu Yamaoka; Motoi Ohba; Yuki Matsunaga; Junji Tsurutani; Tohru Ohmori

doi:10.3791/59473

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einleitung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
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Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es wurde ein Verfahren zur Etablierung von Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus Lungenadenokarzinom-PC-9-Zellen entwickelt und resistente Zellen charakterisiert. Die resistenten Zellen können verwendet werden, um epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz-Mechanismen zu untersuchen, anwendbar für Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

Zusammenfassung

Erworbene Resistenz gegen molekulare Zielhemmer ist ein ernstes Problem in der Krebstherapie. Lungenkrebs ist in den meisten Ländern nach wie vor die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Die Entdeckung von "onkogenen Treibermutationen", wie epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)-aktivierende Mutationen, und die anschließende Entwicklung molekularer gezielter Wirkstoffe von EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib) haben die Lungenkrebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten dramatisch verändert. Diese Medikamente sind jedoch immer noch nicht wirksam bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die EGFR-aktivierende Mutationen tragen. Nach erworbener Resistenz bleibt das systemische Fortschreiten von NSCLC ein erhebliches Hindernis bei der Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positivem NSCLC. Hier stellen wir eine stufenweise Dosiseskalationsmethode zur Etablierung von drei unabhängigen erworbenen Afatinib-resistenten Zelllinien aus NSCLC PC-9-Zellen vor, die EGFR-aktivierende Mutationen von 15-Basen-Paar-Deletionen in EGFR exon 19 enthalten. Methoden zur Charakterisierung der drei unabhängigen afatinib-widerstandsgebundenen Zelllinien werden kurz vorgestellt. Die erworbenen Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Daher müssen mehrere Zelllinien mit erworbener Resistenz gegen EGFR-TKIs untersucht werden. Zehn bis zwölf Monate sind erforderlich, um Zelllinien mit erworbenem Widerstand mit diesem schrittweisen Dosiseskalationsansatz zu erhalten. Die Entdeckung neuartiger resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sicherer therapeutischer Strategien beitragen.

Einleitung

Fünf Tyrosinkinase-Inhibitoren, die auf epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) abzielen, einschließlich Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib, sind derzeit für die Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positiver nicht-kleinzelliger Lunge verfügbar. Krebs (NSCLC). In den letzten zehn Jahren haben sich Therapien für solche Patienten mit der Entdeckung neuer potenzieller EGFR-TKIs dramatisch entwickelt. Bei Patienten mit Lungenadenokarzinom wurden somatische Mutationen in EGFR bei etwa 50%der asiatischen und 15% der kaukasischen Patienten 1 identifiziert. Die häufigsten Mutationen in EGFR sind eine L858R-Punktmutation bei EGFR exon 21 und 15 Base pair (bp) Deletionen in EGFR exon 19². Bei EGFR-Mutations-positiven Patienten mit NSCLC verbessern EGFR-TKIs die Ansprechraten und klinischen Ergebnisse im Vergleich zum vorherigen Standard der Platin-Doppelchemotherapie³.

Gefitinib und Erlotinib waren die ersten zugelassenen kleinen Molekülinhibitoren und werden im Allgemeinen als EGFR-TKIs der ersten Generation bezeichnet. Diese EGFR TKIs blockieren die Tyrosinkinase-Aktivität, indem sie mit ATP konkurrieren und reversibel an ATP-Bindungsstellen binden⁴. Afatinib ist ein EGFR-TKI der zweiten Generation, das irreversibel und kovalent an die Tyrosinkinase-Domäne von EGFR bindet und als panhumaner EGFR-Familieninhibitor⁵charakterisiert ist.

Trotz des dramatischen Nutzens dieser Therapien bei Patienten mit NSCLC ist eine erworbene Resistenz unvermeidlich. Der häufigste Resistenzmechanismus gegen EGFR-TKIs der ersten und zweiten Generation ist die Entstehung der T790M-Mutation in EGFR exon20, die in 50-70% der Tumorproben 6,⁷^,⁸vorhanden ist. Andere Resistenzmechanismen sind Bypass-Signale (zu MET, IGF1R und HER2), Transformation zu kleinzelligem Lungenkrebs und Induktion epitheliaal-mesenchymaler Übergang, die vorklinisch und klinisch⁹auftreten. Die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Durch die Identifizierung neuartiger Resistenzmechanismen in präklinischen Studien kann es möglich sein, neuartige Therapeutika zu entwickeln, um Resistenzen zu überwinden. Optimale Sequenztherapien, die den klinischen Nutzen für die Patienten maximieren, müssen die Resistenzmechanismen und das therapeutische Ziel berücksichtigen.

Es ist zwingend notwendig, die richtige elterliche Zelllinie zu wählen, da sie die Grundlage aller nachfolgenden Experimente ist. Die Auswahlstrategien beginnen mit klinischer Relevanz; es ist notwendig, eine Chemotherapie und Bestrahlung naive Zelllinie zu wählen. Vorherige chemotherapeutische und/oder strahlungstechnische Behandlung kann die Veränderung der Resistenzwege und Veränderungen der Expression von Arzneimittelresistenzmarkern induzieren. In dieser Studie werden PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 tragen, für die Etablierung der erworbenen Resistenz gegen Afatinib eingesetzt. Diese Zelllinie wurde von einem japanischen NSCLC-Patienten abgeleitet, der keine vorherige Chemotherapie und Bestrahlung erhielt.

Da Afatinib täglich oral verabreicht wird, wäre eine kontinuierliche In-vitro-Behandlung, bei der die Zellen ständig in Gegenwart von Afatinib kultiviert werden, klinisch relevant. Die Dosis der Medikamente, die in den verschiedenen Schritten des Experiments verwendet werden, muss für die ausgewählte Elternzelllinie optimiert werden. Zur Bestimmung eines geeigneten Arzneimittelbereichs kann ein Zytotoxizitätstest verwendet werden, der mit den pharmakokinetischen Informationen des Arzneimittels vergleichbar sein sollte.

Während des gesamten Auswahlprozesses wird die gesamte Zellgesamtheit als eine einzige Gruppe beibehalten. Klonen oder andere Trennmethoden werden nicht verwendet. Die Zellen werden zunächst kontinuierlich einem niedrigen Niveau des Medikaments ausgesetzt. Anschließend, nachdem sich die Zellen anpassen, um in Gegenwart des Medikaments zu wachsen, wird die Dosis des Medikaments langsam auf die endgültige optimale Dosis des Medikaments¹⁰^,¹¹erhöht. Alternativ kann eine Pulsmedikamenten-Verabreichung oder Mutagenese zur Auswahl von Resistenzzellen verwendet werden, die auch vor der medikamentösen Behandlung durchgeführt werden ¹²^,¹³. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt, in der Regel nicht gemeldet. Die Selektionsstrategien werden mit dem Ziel entwickelt, die Bedingungen von Krebspatienten für den Wiederaufbau klinisch relevanter Resistenzen nachzuahmen. Manchmal wird eine hohe Arzneimittelkonzentration verwendet, um molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu identifizieren. Dieses Modell wird weniger klinisch relevant.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien aus PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 enthalten, sowie die anfängliche Charakterisierung der afatinibresistenten Zelllinien.