Estabelecimento e caracterização de três linhagens de células PC-9 de adenocarcinoma de pulmão resistentes ao Afatinib desenvolvidas com doses crescentes de Afatinib

Resumo

Um método para estabelecer linhas de pilha da afatinib-resistência das pilhas do adenocarcinoma do pulmão PC-9 foi desenvolvido, e as pilhas resistentes foram caracterizadas. As células resistentes podem ser usadas para investigar mecanismos de resistência a inibidores da tirosina quinase do receptor de fator de crescimento epidérmico, aplicáveis para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.

Resumo

A resistência adquirida aos inibidores do alvo molecular é um problema severo na terapia de cancro. O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer na maioria dos países. A descoberta de "mutações do condutor oncogênico", tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)-ativando mutações, e o desenvolvimento subsequente de agentes moleculares alvejados de inibidores da tirosina quinase de EGFR (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib) modificaram dramaticamente o tratamento do cancro do pulmão nas últimas décadas. No entanto, essas drogas ainda não são eficazes em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) portadoras de Mutações ativadoras de EGFR. Após a resistência adquirida, a progressão sistémica do NSCLC continua a ser um obstáculo significativo no tratamento de doentes com CPNPC com mutação EGFR positiva. Aqui, nós apresentamos um método Stepwise do escalonamento de dose para estabelecer três linhas de pilha de afatinib-resistentes adquiridas independentes das pilhas de NSCLC PC-9 que abrigando mutações EGFR-ativando de deleções do par 15-base em EGFR exon 19. Os métodos para caracterizar as três linhas de pilha independentes do afatinib-resistência são apresentados momentaneamente. Os mecanismos de resistência adquiridos aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Conseqüentemente, as linhas de pilha múltiplas com resistência adquirida a EGFR-TKIs devem ser examinadas. Dez a doze meses são exigidos para obter as linhas de pilha com resistência adquirida usando esta aproximação Stepwise da escalada de dose. A descoberta de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais efetivas e seguras.

Introdução

Cinco inibidores da tirosina quinase, que visam o receptor do fator de crescimento epidérmico (TFGE), incluindo Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib estão atualmente disponíveis para o tratamento de doentes com pulmão de células não pequenas com mutação EGFR cancro (NSCLC). Durante a década passada, as terapias para tais pacientes sofreram o desenvolvimento dramático com a descoberta de EGFR-TKIs novo potencial. Entre os pacientes com adenocarcinoma de pulmão, mutações somáticas na Tfge são identificadas em aproximadamente 50% da Ásia e 15% dos pacientes caucasianos¹. As mutações mais comuns no EGFR são uma mutação de ponto L858R em exon EGFR 21 e 15 eliminações de par base (BP) no exon EGFR 19². Em doentes com mutação positiva EGFR com NSCLC, o EGFR-TKIs melhora as taxas de resposta e os resultados clínicos em comparação com o padrão anterior de quimioterapia de dúvida de platina³.

Gefitinib e erlotinib foram os primeiros inibidores da molécula pequena aprovados e são geralmente referidos como TKIs de primeira geração de EGFR. Esses EGFR TKIs bloqueiam a atividade da tirosina quinase competindo com ATP e vinculando reversivelmente a sites de associação de ATP⁴. O afatinib é um EGFR de segunda geração TKI que se liga irreversivelmente e covalentemente ao domínio da tirosina quinase do EGFR e é caracterizado como um inibidor da família EGFR Pan-humano⁵.

Apesar do benefício dramatical destas terapias nos pacientes com NSCLC, a resistência adquirida é inevitável. O mecanismo de resistência mais comum contra a EGFR tkis de primeira e segunda geração é o surgimento da mutação T790M no EGFR exon 20, que está presente em 50-70% das amostras tumorais^6,7,8. Outros mecanismos de resistência incluem sinais de bypass (para MET, IGF1R e HER2), transformação para câncer de pulmão de pequenas células e indução de transição epitelial-mesenquimais, que ocorrem pré-clinicamente e clinicamente⁹. Os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Ao identificar novos mecanismos de resistência em estudos pré-clínicos, pode ser possível desenvolver terapêutica inovadora para superar a resistência. As terapias ideais da seqüência que maximizam o benefício clínico aos pacientes devem considerar os mecanismos da resistência e o alvo terapêutico.

É imperativo escolher a linha de célula parental direita, porque é a base de todos os experimentos subseqüentes. As estratégias de seleção começam com relevância clínica; é necessário escolher uma linha celular ingênua de quimioterapia e radiação. O tratamento quimioterapêutico e/ou radiativo prévio pode induzir a alteração de vias de resistência e alterações da expressão de marcadores de resistência a fármacos. Neste estudo, as células PC-9, que transportam 15 deleções BP no exon 19 do EGFR, são empregadas para o estabelecimento de resistência adquirida ao afatinib. Esta linha de pilha foi derivada de um paciente japonês de NSCLC, que não recebesse a quimioterapia e a radiação prévia.

Uma vez que o afatinib é administrado por via oral numa base diária, o tratamento in vitro contínuo, onde as células são cultivadas constantemente na presença de afatinib, seria clinicamente relevante. A dose de medicamentos utilizados nas várias etapas do experimento deve ser otimizada para a linha celular parental selecionada. Um ensaio de citotoxicidade pode ser utilizado para determinar uma gama de fármacos adequado, que deve ser comparável à informação farmacocinética da droga.

Ao longo do processo de seleção, toda a população de células é mantida como um único grupo; clonagem ou outros métodos de separação não são utilizados. As células são primeiro continuamente expostos a um baixo nível da droga. Subseqüentemente, depois que as pilhas se adaptarem para crescer na presença da droga, a dose da droga é aumentada lentamente à dose óptima final da medicina^10,11. Alternativamente, um pulso de administração de drogas ou mutagenese pode ser usado para a seleção de células de resistência, que também são realizadas antes do tratamento medicamentoso ^12,13. Infelizmente, casos em que a resistência à droga não se desenvolve geralmente não são relatados. As estratégias de seleção são desenvolvidas com o objetivo de tentar imitar as condições dos pacientes oncológicos para reconstruir a resistência clinicamente relevante. Às vezes, para identificar alterações moleculares associadas a mecanismos de resistência a fármacos, é utilizada uma alta concentração de fármacos. Este modelo torna-se menos clinicamente relevante.

Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independente afatinib-resistentes das pilhas PC-9 que abrigando deleções de 15 BP no exon 19 de EGFR assim como a caracterização inicial das linhas de pilha afatinib-resistentes.

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Protocolo

1. criação de três linhas de células PC-9 resistentes ao Afatinib independentes

1. Determinação da concentração inicial de exposição de afatinib para células PC-9 utilizando o ensaio de 3-(4, 5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
   1. Cultura PC-9 células em meio de crescimento contendo soro fetal bovino (10%), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma célula-cultura tratada 10-cm prato em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 ° c.
   2. Resuspend PC-9 células em 4 x 10⁴ células/ml em meio de crescimento e, em seguida, semente em 50 μL/bem em uma microplaca de 96 poços. A concentração final de células é 2,0 x 10³ células/50 μl/poço. Incubar durante a noite em uma incubadora de 5% CO₂ a 37 ° c.
   3. Adicionar 50 μL de solução de afatinib em diferentes concentrações: 0, 0, 2, 0, 6, 0, 2, 0, 6, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 μM aos poços contendo o meio de crescimento (50 μL). O volume final e as concentrações de afatinib são 100 μL e 0, 0, 1, 0, 3, 0, 1, 0, 3, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 μM, respetivamente.
   4. Incubar a placa 96-well para 96 h em uma incubadora de 5% CO₂ em 37 ° c.
   5. Adicionar 15 μL da solução corante (ver tabela de materiais) para cada poço e incubar para 4 h em uma incubadora de 5% co₂ a 37 ° c, e depois adicionar 100 μl de solubilização/parar-solução (ver tabela de materiais) para cada poço e incubar durante a noite em um 5% co < C10 > 2 incubadora a 37 ° c.
   6. Meça a densidade ótica em 570 nanômetro (OD₅₇₀) usando um leitor do microplate (veja a tabela dos materiais). Prepare 6-12 repetições e repita os experimentos pelo menos três vezes.
   7. Use software estatístico (ver tabela de materiais) para plotar graficamente esses dados como um gráfico de semi-log e calcular o valor IC₅₀ , que é a concentração de drogas que reduz a resposta a 50% do seu máximo (ver tabela de materiais ).
2. Exposição contínua de células PC-9 ao EGFR-TKI irreversível, afatinib, por escalonamento de dose Stepwise em três pratos independentes de 10 cm
   1. Cultura PC-9 células em pratos P100 contendo 10 mL de meio de crescimento. Quando as células PC-9 atingem a fase subconfluente, transfira 1 mL de suspensão celular para três novos pratos P100, com 9 mL de meio de crescimento. As 1:10 células PC-9 diluídas tornam-se subconfluentes em 3-4 dias, com um número de células de aproximadamente 4-5 x 10⁵ células/ml.
   2. No dia seguinte, adicione 1/10 do valor de IC₅₀ de afatinib em cada um dos três pratos P100.
      Nota: O afatinib é reconstituído em DMSO em concentrações de 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM e 5 mM. 1 a 10 μL de solução de afatinib é adicionado em 10 mL de meio de crescimento na cultura, de acordo com as concentrações finais exigidas.
   3. Quando as células nos pratos P100 contendo afatinib se tornarem subconfluentes, misture bem por aspiração com uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL da suspensão celular a 9 mL de meio de crescimento fresco em um novo prato P100. Em seguida, adicione 10-20% maiores concentrações de afatinib à nova cultura.
   4. Aumente a concentração de afatinib de 0,1 nM para 1 μM no meio pelo agravamento da dose Stepwise com a concentração de afatinib aumentada em 10-20% em cada passo durante o período de 10-12 meses.
      Nota: Quando a concentração de afatinib se aproxima do valor do IC₅₀ , o crescimento celular torna-se bastante lento. Se as células forem divididas em 1:9, elas podem não crescer, pois essas células são mortas por concentrações mais elevadas de afatinib. Conseqüentemente, em umas concentrações mais elevadas do afanitib, as pilhas podem ser rachadas em uma relação de 1:2. As células mais resistentes foram cultivadas em meio contido em afatinib por 3-14 dias, e o meio não foi alterado até que as células resistentes precisassem ser passadas.
   5. Cultura das células resistentes ao afatinib durante 2-3 meses em meio de crescimento contendo 1 μM de afatinib. A uma concentração de afatinib de 1 μM, são necessários 10-12 meses para desenvolver resistência ao afatinib neste modelo. Realize o ensaio MTT para confirmar que as células são resistentes ao afatinib. As três linhagens de células de resistência de afatinib, independentemente estabelecidas, foram denominadas AFR1, AFR2 e AFR3.

2. caracterização de três células independentes Afatinib-resistentes

1. Determinação da curva de crescimento das células PC-9 parentais e do estabelecimento de células resistentes ao afatinib
   1. Cultura as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 em meio de crescimento em uma incubadora de 5% CO₂ a 37 ° c.
   2. Resuspend as pilhas em 5 x 10³ Cells/ml com meio de crescimento, e semente 100 μl/poço em um microplate de 96 poços, tais que a concentração final das pilhas é 500 Cells/100 μl/poço.
      Nota: O ensaio MTT é realizado para medir os valores de OD₅₇₀ em 0, 1, 2, 3, 5 e 7 dias. 6 96-bem microplates são necessários para cada dia.
   3. Realize o ensaio MTT a cada 24 h e, em seguida, nos dias 0, 1, 2, 3, 5 e 7. Meça os valores OD₅₇₀ e prepare 6-12 repetições; Repita os experimentos pelo menos três vezes, e graficamente plotar os resultados usando um software estatístico (ver tabela de materiais).
2. Identificação das alterações do DNA genômica na TFGE por PCR em tempo real
   Nota: O afatinib é um inibidor da molécula pequena que tem como alvo a tirosina quinase de EGFR. O status da expressão EGFR é determinado nos níveis de DNA e proteína.
   1. O ADN de Genomic é isolado usando um jogo da purificação do ADN (veja a tabela dos materiais) que segue as instruções do fabricante. Meça a concentração do ADN genomic isolado com um espectrofotômetro (veja a tabela de materiais) e ajuste todas as amostras genomic do ADN a 25 ng/μl.
   2. Amplificar 50 ng de DNA genómico, o que equivale a 2 μL dos estoques de 25 ng/μL, usando uma mistura Master SYBR Green (ver tabela de materiais) e analisar os resultados usando um sistema de detecção de RT-PCR baseado em fluorescência (ver tabela de materiais).
      Nota: As condições de ciclagem do PCR começaram com uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c por 20 s, seguidas por 40 ciclos da desnaturação de 95 ° c para 3 s, 60 ° c que recozimento para 30 s. Os conjuntos de primers específicos são os seguintes: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalização gene linha-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
3. Avaliação do efeito de alterações proteicas no nível de EGFR pela análise Western blot
   1. Trate as células com afatinib continuamente antes de experimentos para 24 h. Lave as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 duas vezes com PBS e, em seguida, semeá-las em meios de crescimento sem afatinib. Lave as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 duas vezes com 5 mL de PBS gelada.
   2. Lyse as pilhas no tampão de RIPA que contem o cocktail do inibidor de protease de 1% (veja a tabela dos materiais) e o cocktail II e III do inibidor da fosfatase (veja a tabela dos materiais) e incubar esta solução em 4 ° c por 30 minutos. centrifugar os lisados durante 10 min a 100 x g e 4 ° c e recolher os lisados limpos.
   3. Determinar as concentrações de proteínas utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ver tabela de materiais), ajustar todas as amostras de proteínas para 0,5 ou 1 μg/μl utilizando um tampão de amostra 4x (500 mm tris (pH 6,8) 40, 1, 8% glicerol, 8% SDS, 20% H₂O, 0, 2% bromofenol azul) e ferver a 96 ° c por 5 min. Armazene estas amostras da proteína em-80 ° c até que a análise ocidental do borrão esteja executada.
   4. Separe as quantidades iguais de amostras da proteína, preferivelmente 20-30 μL, pela SDS-Página de 8% e transfira as proteínas a uma membrana do fluoreto do polyvinylidene (PVDF).
      Nota: A electroforese do gel do Dodecil sulfato-Polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE) é usada geralmente no laboratório para a separação das proteínas baseadas em seu peso molecular.
      1. Limpe as placas de vidro com etanol e monte a placa de vidro e os espaçadores. Prepare 8% de gel de poli-acrilamida contendo 1,5 M de Tris-HCl, pH 8,8, 40% bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Polimerize por 30 minutos à temperatura ambiente.
      2. Posteriormente, prepare um gel de empilhamento contendo 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Adicione a solução de gel de empilhamento, insira o pente e polimerize o gel por 20-30 min à temperatura ambiente.
      3. Coloque os géis no aparelho de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida (0,25 M Tris, 1,92 M de glicina e 1% SDS). Carregue a quantidade igual de amostras da proteína (20-30 μL) e funcione o gel em 180 V. pare a electroforese uma vez que a parte dianteira do corante flui fora do gel, após aproximadamente 60 minutos.
      4. Lave o gel por 1-2 min com TBST e, em seguida, transfira as proteínas para uma membrana de PVDF por blotting semiseco (ver tabela de materiais) para 1,5 h a uma corrente constante de 300 ma.
   5. Bloqueie as membranas com 5% de leite seco não gordo (ver tabela de materiais) diluída com a solução TBST (ver tabela de materiais) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, sonda as membranas com anti-EGFR, anti-fosho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, e anti-Actin anticorpos (diluído 1:3000 em TBST) (ver tabela de materiais) a 4 ° c durante a noite.
   6. Lave as membranas com TBST três vezes por 10 min e, em seguida, expor as membranas para o anticorpo secundário (diluído 1:200 em TBST) para 1-1.5 h à temperatura ambiente. Lave as membranas cinco vezes com TBST durante 10 min à temperatura ambiente, exponha-as à solução ECL (ver tabela de materiais) e visualize os sinais utilizando filmes.
4. Análise das mutações do EGFR por sequenciamento
   1. Amplificar o DNA genómico usando primers específicos para exões EGFR 19-21. As condições de ciclagem do PCR começam com uma etapa inicial da desnaturação em 94 ° c por 1 minuto, seguidas por 30 ciclos da desnaturação em 98 ° c para 10 s, recozimento a 55 ° c para 30 s, e extensão em 72 ° c por 1 minuto.
      Nota: Os primers específicos para EGFR exon 19: F: 5 ′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ′ R: 5 ′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3 ′, eXoN 20: F: 5 ′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3 ′, R: 5 ′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3 ′, e exon 21: F: 5 ′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′.
   2. Purify os produtos amplificados do PCR usando um jogo da purificação do PCR (veja a tabela dos materiais) e sequencia os amplicons.

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Resultados

O esquema para estabelecer três linhas celulares de resistência à afatinib de células PC-9 usando um procedimento de escalonamento de dose Stepwise é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra uma diminuição da proliferação celular de células PC-9 parentais, pois a concentração de afatinib é aumentada, indicando que as células PC-9 são sensíveis à exposição ao afatinib. A Figura 3 mos...

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Discussão

Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independentes do afatinib-resistentes e caracterizamos estas pilhas por comparação às pilhas PC-9 parentais. Por exposição Stepwise da escalada de dose, as pilhas PC-9 parentais adquiriram a resistência ao afatinib durante um período de 10-12 meses. Clinicamente, os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos e, portanto, após o tratamento inicial com afatinib, as células PC-9 foram divididas em três pratos P100 independ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
afatinib	Selleck	S1011
anti-EGFR monoclonal antibody	cell signaling technology	4267S
bicinchoninc acid assay	sigma	B9643
cell-culture treated 10 cm dish	Violamo	2-8590-03
CELL BANKER1	TakaRa	CB011	cryopreservation media
CellTiter 96	Promega	G4100	Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution
DMSO	Wako	043-07216
ECL solution	Perkin Elmer	NEL105001EA
FBS	gibco	26140-079
GeneAmp 5700	Applied Biosystems		fluorescence-based RT-PCR-detection system
GraphPad Prism v.7 software	GraphPad, Inc.		a statistical software
NanoDrop Lite spectrophotometer	Thermo		spectrophotometer
Nonfat dry milk	cell signaling technology	9999S
Pen Strep	gibco	15140-163
phosphatase inhibitor cocktail 2	sigma	P5726
phosphatase inhibitor cocktail 3	sigma	P0044
Powerscan HT microplate reader	BioTek
Power SYBR Green master mix	Applied Biosystems		SYBR Green master mix
protease inhibitor cocktail	sigma	P8340
QIAamp DNA Mini kit	Qiagen	51306	DNA purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN		PCR purification kit
RPMI-1640	Wako	189-02025	with L-Glutamine and Phenol Red
TBST powder	sigma	T9039
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell	Bio-Rad		semi-dry t4ransfer apparatus
96 well microplate	Thermo	130188