JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن نقدم طريقة لتحليل سلوك نمو المحاور في المصفوفات ثلاثية الأبعاد، ومحاكاة نموها الطبيعي.

Abstract

يستخدم هذا البروتوكول الكولاجين الطبيعي من النوع الأول لتوليد هيدروجيل ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) لرصد وتحليل النمو المحوري. ويتركز البروتوكول على زراعة قطع صغيرة من أدمغة القوارض الجنينية أو المبكرة بعد الولادة داخل هيدروجيل ثلاثي الأبعاد يتكون من النوع المشتق من ذيل الجرذان I مع الكولاجين المسامية محددة. يتم استزراع قطع الأنسجة داخل هيدروجيل وتواجه شظايا الدماغ محددة أو مجاميع الخلايا المعدلة وراثيا لإنتاج وإفراز جزيئات مناسبة لخلق تدرج داخل المصفوفة المسامية. إن خطوات هذا البروتوكول بسيطة وقابلة للاستنساخ ولكنها تشمل خطوات حاسمة للنظر فيها بعناية أثناء وضعها. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد سلوك المحاور المتنامية وتحليلها مباشرة باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلورسنت أحادية / متعددة الفوتونات بعد التثبيت عن طريق الأساليب المناعية.

Introduction

تهاجر المحاور العصبية، التي تنتهي بالمخاريط المحورية للنمو، لمسافات طويلة من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) للجنين عبر مسارات محددة للوصول إلى أهدافها المناسبة. مخروط النمو هو الجزء البعيد من محور وهو متخصص في الشعور بالبيئة المادية والجزيئية للخلية1,2. من وجهة نظر جزيئية، يتم توجيه المخاريط النمو من قبل ما لا يقل عن أربع آليات جزيئية مختلفة: جذب الاتصال، الكيميائية، الاتصال النفور، وchemorepulsion الناجمة عن مختلف العظة توجيه محاور3،4 , 5 , 6. يمكن رصد العمليات التي يتم الاتصال بها بشكل جزئي في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على ركائز صغيرة النقوش (على سبيل المثال، مع خطوط7أو8 أو بقع9 تحتوي على الجزيئات). ومع ذلك، يمكن للمحاور التنقل إلى هدفهم بطريقة غير انتشارية عن طريق الاستشعار عن بعدة جزيئات جذابة ومثيرة للاشمئزاز من خلايا الدليل في البيئة4،5،10. هنا، ونحن وصف طريقة سهلة للثقافة 3-D للتحقق مما إذا كان جزيء يفرز يحفز آثار chemorepulsive أو chemoattractive على تطوير المحاور.

وكانت الدراسات الأولى تهدف إلى تحديد آثار إشارات توجيه محور عصبي تستخدم ثقافات الزراعة في المصفوفات ثلاثية الأبعاد (3-D) لتوليد التدرجات محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12. هذا النهج، جنبا إلى جنب مع التجارب في الجسم الحي، يسمح لتحديد الأسر الرئيسية الأربع من العظة التوجيهية: Netrins، Slits، سيمابورينس، وEphrins4،5،6. هذه العظة الجزيئية والعوامل الأخرى13 متكاملة من قبل المحاور المتنامية، مما أدى إلى ديناميات المجمعات الالتصاق والقوى الميكانيكية عبر الهيكل الخلوي14،15،16. لتوليد التدرجات الجزيئية في الثقافات ثلاثية الأبعاد للملاحة المحورية، استخدم الباحثون الرواد ركائز تجلط البلازما17،والتي كانت تستخدم أيضا لتحضيرات شريحة organotypic18. ومع ذلك، في عام 1958، تم الإبلاغ عن بروتوكول جديد لتوليد هيدروجيل الكولاجين 3-D لدراسة مع أجهزة ماكسيمو19،منصة الثقافة، وتستخدم في العديد من الدراسات المناسبة للملاحظات المجهرية20. وذكرت دراسة رائدة أخرى هلام الكولاجين كأداة لتضمين الخلايا الليفية البشرية لدراسة تمايز الخلايا الليفية في الخلايا العضلية الليفية في عمليات التئام الجروح21. بالتوازي، طبّق Lumsden وDavies الكولاجين من الأدمة البقري لتحليل التأثير المفترض لعامل نمو الأعصاب (NGF) على توجيه الألياف العصبية الحسية22. مع تطوير منصات ثقافية جديدة (على سبيل المثال، لوحات متعددة الآبار) من قبل شركات ومختبرات مختلفة، تم تكييف ثقافات الكولاجين لهذه الأجهزة الجديدة6،23،24،25 ،26. في موازاة ذلك، تم توفير خلاصة من مواد ECM المشتقة من خط خلايا الورم إنغلبريث-هولم-سرب تجارياً لتوسيع هذه الدراسات27.

وقد وضعت مؤخرا عدة بروتوكولات لتوليد التدرجات الجزيئية مع الأدوار المفترضة في توجيه محور عصبي باستخدام الهلام المائي ثلاثي الأبعاد (مثل الكولاجين، الفيبرين، الخ. 28. وكبديل عن ذلك، يمكن تجميد الجزيء المرشح بتركيز مختلف في مصفوفة مسامية (مثل NGF29)أو إنشاؤه عن طريق الزراعة في منطقة صغيرة من المجاميع خلية هيدروجيل ثلاثية الأبعاد تفرز الجزيء لتوليد شعاعي التدرج4,23,24,25,26. وسيجري شرح آخر إمكانية في هذا البروتوكول.

الإجراء المعروض هنا هو طريقة سهلة وسريعة وقابلة للاستنساخ للغاية استنادا إلى تحليل النمو المحوري في الثقافات هيدروجيل 3D من الدماغ الماوس الجنيني. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن البروتوكول مناسب تماما للباحثين غير المدربين ويمكن تطويره بالكامل بعد تدريب قصير (1-2 أسابيع). في هذا البروتوكول، نقوم أولاً بعزل الكولاجين عن ذيول الفئران البالغة لزيادة توليد المصفوفات ثلاثية الأبعاد التي يتم فيها زراعة مجاميع الخلايا المعدلة وراثياً أمام الأنسجة العصبية الجنينية. وتشكل هذه المجاميع الخلية تدرجات كيميائية شعاعية لجزيء مرشح مما يثير استجابة للمحاور المتنامية. وأخيرا، يمكن بسهولة تقييم آثار الجزيء على نمو المحاور باستخدام المجهر التباين المرحلة أو، بدلا من ذلك، أساليب Immunocytochemical.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بموجب المبادئ التوجيهية والبروتوكولات للجنة الأخلاقية للتجارب الحيوانية (CEEA) لجامعة برشلونة، وتم استعراض بروتوكول استخدام القوارض في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل CEEA من جامعة برشلونة (CEEA الموافقة #276/16 و 141/15).

1. تنقية من الجرذ الذيل الكولاجين

  1. جمع الكبار سبراغ-دولي ذيول الفئران (8-9 أسابيع من العمر) بعد التضحية الحيوان اتباع المبادئ التوجيهية الأخلاقية وشطف في 95٪ الإيثانول. ضع 2-4 ذيول على الجليد (4 درجة مئوية) والاحتفاظ بها مغطاة بالجليد أثناء العملية.
  2. للحصول على الأوتار التيل، قم بإصلاح الذيل في أكثر الفقرات الكوالية في الذيل باستخدام الهيموستات وضغط الذيل مع hemostat الثانية المتمركزة حول 5-7 ملم من الأول. كسر الذيل عن طريق التواء بحدة مع كل من hemostats. للقيام بذلك، أضعاف / تتكشف الفقرات عدة مرات حتى يكسر.
  3. سحب الفقرات ببطء مع hemostat لفصل الأوتار من غمد هاون كما يخرج. في هذه اللحظة، وقطع الأوتار مع مقص صغير. احتفظ يقطّع قطع الأوتار هذه في طبق بتري معقم 100 مم على الثلج.
  4. كرر لقط وانزلاق لبقية الذيل حتى يتم استخراج الأوتار تماما.
  5. كرر الخطوات 1.2-1.4 لكافة الذيل التي تم الحصول عليها.
  6. لاحظ الأوتار تحت المجهر. تخلص من الأوعية الدموية عن طريق قطع مع مقص صغير وعقد مع ملقط غرامة على التوالي لتحسين نقاء وتر وشطف الأوتار 3 مرات مع الماء فائقة النقاوة.
  7. جمع 3-4 غرام من الأوتار الرطبة. قم بإذابة الأوتار في 150 مل من حمض الخليك الجليدي 3% عند 4 درجة مئوية في قارورة مخروطية زجاجية 200-250 مل لمدة 24-36 ساعة، تحت التحريك اللطيف.
  8. جهاز طرد مركزي في 20,000 x ز لمدة 1 ساعة. في موازاة ذلك، إعداد غشاء أنابيب غسيل الكلى عن طريق قطع قطعة من حوالي 10-15 سم في الطول وغليه في الماء ultrapure تحتوي على 1 م حمض الإثيلين ديامينرباعيالاستيك (EDTA) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، شطف بلطف غشاء غسيل الكلى جيدا مع الماء ultrapure.
  9. بعد التمركز، وجمع supernatant في غشاء أنابيب غسيل الكلى عن طريق decantation. تحتوي الكريات على مادة حمضية غير قابلة للذوبان (بروتينات غير كولاجينية) ويحتوي الفوقاتان على بروتينات الكولاجين القابلة للذوبان.
  10. Dialyze السوبر ضد 2 لتر من 0.1x الحد الأدنى من الأساسية متوسطة النسر (MEM)، ورقم البال 4.0 في كوب زجاجي 2-5 لتر. دياليز لمدة 3 أيام. تغيير 0.1x MEM الحل مرتين على الأقل في اليوم التحقق من رقم الألف في كل تغيير قبل استخدام. إذا كان الأس الألف قد تحول الأساسية, تعديله مع بضع قطرات من 0.1 M حمض الخليك حتى درجة الحموضة هو 4.0.
  11. بعد غسيل الكلى، إضافة المضادات الحيوية (1.5 مل من البنسلين / ستربتوميسين (القلم-العقدية)) إلى محلول الكولاجين dialyzed. اصنع 5 مل من محلول مخزون الكولاجين وخزنه عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: من هذه النقطة، يجب أن يتم تنفيذ جميع إجراءات المناولة في ظل ظروف معقمة في غطاء محرك السيارة تدفق الصفيحة.
  12. المضي قدما في اختبار gelation من محلول مخزون الكولاجين أعدت بعد الخطوات التالية.
    1. منذ الكولاجين المخزون عادة ما تكون مركزة جدا، وإعداد 3 تخفيفات العمل (75٪، 50٪، و 25٪ حل الكولاجين) عن طريق تمييع الأسهم في 0.1x MEM، ورقم الألف 4.0. الحجم النهائي الموصى به لكل تخفيف العمل هو 5 مل. في كل حالة، تحقق من تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين اللوني.
    2. ضع عدة أنابيب طرد مركزي مخروطية فارغة 1.5 مل (واحدة لكل تخفيف عامل)، وأنابيب MEM 10x، ومحلول بيكربونات الصوديوم بنسبة 7.5% ومختلف التخفيفات العاملة للكولاجين على الجليد. انتظر حتى يتم تبريد هذه.
    3. إضافة 40-50 ميكرولتر من 10x MEM إلى أنبوب الطرد المركزي الباردة (4 °C). بعد ذلك، امزجها بلطف مع محلول بيكربونات الصوديوم 7-8 ميكرولتر.
    4. أضف 310-330 ميكرولتر من أحد التخفيفات المختلفة للكولاجين إلى هذا الأنبوب واخلطه برفق مع الماصة مع تجنب أي تشكيل للفقاعة. احتفظ بخليط بيكربونات الصوديوم-الكولاجين-MEM على الجليد (4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق على الأقل.
    5. ماصة 10-25 ميكرولتر من الخليط في طبق بيتري 35 مم.
    6. ضع طبق بيتري في حاضنة CO2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم ملاحظة gelgel (± 15-20 min).
    7. كرر الخطوات 1.12.3-1.12.6 لتخفيف الكولاجين المتبقية في أطباق بيتري المختلفة.
    8. حدد تخفيف الكولاجين العامل الذي يجعل أفضل النتائج.
      ملاحظة: يجب أن يكون أفضل هيدروجيل gelled نسيج شفاف موحد، اللون الرمادي، وينبغي أن لا تكون متكتل أو stringy. في تجربتنا، وتخفيف 3:1 (الكولاجين: 0.1x MEM) يولد أفضل النتائج التجريبية.

2. إعداد الخلية (COS1) المجاميع المعدلة وراثيا لإفراز جزيء مرشح في 3-D الكولاجين هيدروجيلز

  1. لوحة 2 x 106 COS1 الخلايا في أطباق بيتري 35 ملم واحتضان مع ثقافة كاملة المتوسطة تتألف من 100 مل من D-MEM تحتوي على 10% (vol/vol) الحرارة تنشيط الجنين مصل الأبقار, 0.5% (الوزن / المجلد) الجلوتامين و 1% (الوزن / المجلد) القلم / ستريب في ثقافة الخلية حاضنة، من أجل الوصول إلى 70-80٪ confluency بين عشية وضحاها. إعداد طبق بيتري واحد لكل إجراء التغوط.
  2. في اليوم التالي transfect COS1 الخلايا مع الحمض النووي ترميز جزيء المرشح (Netrin-1 أو Sema3E) باستخدام طريقة التشقق اتّصل ية ومبنية على تعليمات الشركة المصنعة.
    1. للقيام بذلك، قم بخلط 250 ميكرولتر من المصل الخالي من المصل والحمض النووي (1-2 ميكروغرام لكل حالة) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل (أنبوب الحمض النووي) ومزيج. الاحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    2. بعد الحضانة، إضافة محتوى أنبوب الحمض النووي إلى أنبوب liposomal وتخلط بلطف. الآن احتضان في RT لمدة 15 دقيقة. احتضان لمدة 3 ح في ثاني2 خلية حاضنة الثقافة.
  3. بعد 3 ح من حضانة الترباض، استبدل الوسط بالوسط الثقافي الكامل والحضانة بين عشية وضحاها في الحاضنة.
  4. في اليوم التالي، شطف الخلايا مع 0.1 M دولبيكو الفوسفات المخزنة في محلول ملحي (D-PBS)، علاج الثقافات مع تريبسين-EDTA (800 ميكرولتر لكل طبق لمدة 5-15 دقيقة في حاضنة CO2) وجمع الخلايا المنفصلة مع 15 مل من ثقافة كاملة المتوسطة.
  5. طرد مركزي الخلايا عند 4 °C عند 130 x g لمدة 5 دقائق. بعد التمركز، قم بإزالة الوسائط والحفاظ على الكريات التي تحتوي على خلايا COS1 على الجليد.
  6. كرر الخطوات 1.12.3-1.12.6 لإعداد خليط الكولاجين العمل.
  7. أضف 100-150 ميكرولتر من خليط الكولاجين إلى بيليه الخلايا المصابة ومزج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وانتشار 45-50 ميكرولتر من هذا الخليط على طبق بيتري (قطر 35 ملم) لتشكيل مجموعة موحدة من خلايا الكولاجين من حوالي 1-1.5 سم في الطول. ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة37 درجة مئوية (5% ثاني أكسيد الكربون 2) حتى يتم ملاحظة الجليشن (± 15-20 دقيقة).
  8. إعداد شريط ثان يحتوي على خلايا التحكم (التخريد وهمية) في طبق الثقافة الثاني وطبق في الحاضنة (± 15-20 دقيقة) وعند الانتهاء من gelation إضافة 3-4 مل من حرارة (37 درجة مئوية) كوس1 ثقافة كاملة متوسطة لكل طبق يحتوي على gelled الكولاجين خلايا شرائط والاحتفاظ بها في حاضنة ثقافة ثاني2 الخلية. بعد ذلك، قطع شرائط الكولاجين الخلايا لتوليد قطع مربعة صغيرة (400 إلى 500 ميكرومتر في الطول) باستخدام مشرط غرامة أو المروحية الأنسجة.
  9. نقل جميع المقاطع من نفس حالة التغوط إلى طبق بيتري يحتوي على 3-3.5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا العصبية (NCM) والتحقق تحت المجهر تشريح نوعية القطع. مرة أخرى، الاحتفاظ بها في حاضنة ثقافة خلية CO 2.
    ملاحظة: تتكون وسط ثقافة الأعصاب من وسيط عصبي يحتوي على 1-5% (vol/vol) مصل حصان معطل حراري، 2 ملغلومين، 0.5% (وزن/مجلد) الجلوكوز، 1% (الوزن/المجلد) محلول بين ستريب و0.044% (وزن/مجلد) NaHCO3. تأكد من أن رقم الـ pH يتراوح بين 7.2-7.3.

3. جيل من النبتة الجنينية للثقافة

  1. تعقيم الأدوات الجراحية (مقص، مشرط شفرة مقبض، ملقط مستقيم ومنحني) عن طريق الأوتوكلاف بعد المبادئ التوجيهية التعقيم الروتينية. في موازاة إعداد 500 مل من محلول الملح المتوازن هانك-الجلوكوز العازلة و 4-5 أطباق بيتري (100 مم قطر) تحتوي على 10 مل من HBSS-G. ضع هذه الألواح على الجليد (4 درجة مئوية).
  2. التضحية بالجرذ ة الحامل (يوم الجنين 16.5) خارج المنطقة المعقمة، باتباع الإجراءات الأخلاقية المعتمدة. قطع قرون الجنين مع مقص من تجويف البطن ووضعها في طبق بيتري كبير يحتوي على الباردة HBSS-G.
  3. ضع الطبق في غطاء محرك السيارة لتدفق الصفيحات واستخرج الأجنة مع ملقط مستقيم. وضعها في طبق جديد يحتوي على الباردة HBSS-G. بعد ذلك، إزالة الجلد من الجنين باستخدام ملقط صغيرة وتشريح بعناية الدماغ باستخدام ملقط منحنية ومستقيمة. وضعها في طبق يحتوي على الباردة HBSS-G.
  4. تحت المجهر تشريح، وقطع الدماغ إلى النصف على طول خط الوسط لفصل كل من نصفي الكرة الأرضية مع مشرط أو مقص غرامة وإزالة diencephalon، والسحايا والأوعية الدموية من قطع الدماغ مع ملقط غرامة.
  5. كرر الخطوات 3.3-3.4 مع بقية الأجنة. لا تؤخر التشريح لأكثر من 2 ساعة للحفاظ على جودة الأنسجة.
  6. تنظيف جميع أجزاء من المروحية الأنسجة مع الإيثانول 100٪ (وخاصة بوليتترافلوروإيثيلين (PTFE) لوحة القطع وشفرة الحلاقة). الحفاظ على المروحية الأنسجة في غطاء محرك الدفق الصفيحتحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  7. نقل كل قطعة الأنسجة (على سبيل المثال، القشرة مع الحصين) إلى لوحة قطع من المروحية الأنسجة. لالحصين، وضعه عمودي اين شفرة الحلاقة والحصول على أجزاء الأنسجة من 450-500 ميكرون في سمك.
  8. إعداد عدة أطباق بيتري 35 مم مع 3-4 مل من NCM كاملة ونقل قطع الأنسجة من لوحة المروحية الأنسجة إلى أطباق بيتري. قد تكون هناك حاجة إلى العديد من الأطباق كما يتم تشريح المناطق ذات الاهتمام.
  9. إنهاء تشريح الأنسجة في NCM كاملة باستخدام الإبر التنغستن غرامة. تحقق من جودة الشرائح التي تم الحصول عليها تحت المجهر تشريح. تأكد من أن الطبقات يمكن التعرف عليها بوضوح في البصريات المظلمة وتشريح المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال، منطقة CA من الحصين) مع إبر التنغستن. تجاهل الشرائح التالفة. الحفاظ على explants الحصين في المتوسط NCM كاملة في حاضنة CO 2.

4. إعداد الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد في الهلام المائي الكولاجين

  1. ضع عدة لوحات معقمة من 4 آبار في غطاء محرك السيارة لتدفق الصفيحات وأعد خليط اعمل الكولاجين كما سبق في الخطوات 1.12.2-1.12.6.
  2. ضع 15-20 ميكرولتر من خليط هيدروجيل في قاع البئر لإنتاج قاعدة كولاجين دائرية. كرر هذه الخطوة لبقية الآبار. لا تعد أكثر من خمس لوحات في نفس الوقت لتجنب التبخر السائل المفرط من قاعدة هيدروجيل.
  3. احتفظ بالأطباق في الحاضنة حتى يتم ملاحظة الجليشن الكامل (± 15-20 دقيقة) وأخرج الأطباق من الحاضنة فقط عند اكتمال الهلام. تحقق من جودة الكولاجين الهلامي.
  4. نقل قطعة صغيرة من مجموع خلايا COS1 مع ماصة. ضعها على قاعدة هيدروجيل ووضع قطعة نسيج على نفس القاعدة مع ماصة قريبة من قطعة من الخلايا في حجم explant واحد.
  5. إعداد خليط الكولاجين العمل الجديد على الجليد كما هو الحال في الخطوات 1.12.2-1.12.6.
  6. ماصة بلطف 15-20 ميكرولتر من هذا الخليط الجديد وتغطي explant والخلية الكلي. وسيتم ملاحظة ثقافة هيدروجيل مثل شطيرة. في هذه اللحظة، إعادة توجيه explant مع إبرة التنغستن غرامة (لا تلمس مجموع خلايا COS1!)، لذلك فإنه يواجه مجموع الخلية في ± 500-600 ميكروم.
  7. إعادة اللوحة إلى الحاضنة حتى لوحظ الهلام (± 10-15 دقيقة)، و0.5 مل من NCM كاملة تكمل مع 2٪ B27 الملحق والحفاظ على الثقافات لمدة 36 إلى 48 ساعة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).

5. تثبيت الخلايا النباتية النباتية المجاميع والتركيب ية والإجراء المناعي

  1. بعد 36-48 ساعة من الحضانة، وإزالة المتوسطة وشطف مع 0.1 M فوسفات المخزنة المالحة (PBS)، ورقم الحموضة 7.3. بعد ذلك، إصلاح الثقافات لمدة 1 ساعة مع 4٪ بارافورمالديهايد في 0.1 M الفوسفات العازلة (PB)، ودرجة الحموضة 7.3، في 4 درجة مئوية.
  2. إزالة المثبت وشطف بلطف الثقافات 3-4 مرات (10-15 دقيقة لكل منهما) في 0.1 M PB، ورقم الألف 7.3.
  3. فصل شطيرة هيدروجيل من الجزء السفلي من البئر مع ملعقة أو ملقط. نقل كتلة الكولاجين مع فرشاة الطلاء غرامة إلى لوحة ثقافة 6-well تحتوي على 0.1 M PBS مع 0.5٪ المنظفات غير الأيونية.
  4. احتضان الهلام المائي العائمة الحرة في الحل حجب (10٪ المصل، 0.5٪ السطحي غير الأيونية، و0.2٪ الجيلاتين في 0.1 M PBS) لمدة 2-3 ساعة في RT مع الهياج لطيف.
  5. شطف 3 مرات (10-15 دقيقة لكل منهما) مع 0.1 M PBS تحتوي على 0.5٪ السطحي غير الأيونية.
  6. الاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف في PBS تحتوي على 5٪ المصل، 0.5٪ السطحي غير الأيونية، 0.2٪ الجيلاتين، و 0.02٪ أزيدي الصوديوم. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 36-48 ساعة في 4 درجة مئوية على شاكر.
    ملاحظة: عادة ما يستخدم جسم مضاد ضد الفئة الثالثة β-tubulin (α-TUJ-1) (المخفف 1:2,000) لتحديد النمو المحوري في الثقافات هيدروجيل 3-D.
  7. بعد الحضانة، شطف كما في الخطوة 5.5.
  8. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 4 ساعة في RT (أو 6-7 ح في 4 درجة مئوية) على الهزاز المخفف في مصل 5٪، 0.5٪ السطحي غير الأيونية، و0.2٪ الجيلاتين. يستخدم في هذه التجربة جسم مضاد بيولوجي مضاد للفأر (مخفف 1:200).
  9. شطف الثقافات كما هو الحال في 5.5.
  10. احتضان الثقافات لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية مع حل مجمع فيفيدين بيوتين (ABC) 1:100 المخفف في PBS تحتوي على 5٪ المصل، 0.5٪ السطحي غير الأيونية، و 0.2٪ الجيلاتين. بدلامن ذلك، استخدم الفجل البيروكسيديز (HRP) -الموسومة ستربتينين (المخفف 1:300-400) في نفس المخزن المؤقت.
  11. شطف الثقافات كما هو موضح في 5.5.
  12. شطف الثقافات عدة مرات مع 0.1 M تريس-HCl العازلة، ورقم الحموضة 7.6 لمدة 1 ساعة.
  13. احتضان الثقافات مع 0.03٪ من 3,3′-ثنائي أمينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB) الحل في 0.1 م تريس-حمض الهيدروكلوريك, درجة الحموضة 7.6.
  14. إضافة 5-8 μL من 1٪ H2O2 وانتظر 10-15 دقيقة.
  15. إيقاف رد الفعل عن طريق إزالة حل DAB مع 0.1 M Tris-HCl العازلة، ودرجة الحموضة 7.6.
  16. شطف الثقافات في PBS لمدة 30 دقيقة (عدة تغييرات).
  17. جبل الهلام المائي على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام تصاعد المائية القائمة.
  18. تحليل طول وتوزيع المحاور داخل هيدروجيل باستخدام شول تحليل المكونات في أو مع نيورايتج المكونات في لبرنامج ImageJ30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا، نقدم منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة النمو المحوري في الثقافات الكولاجين هيدروجيل 3-D من الجهاز العصبي الماوس الجنيني. ولهذه الغاية، قمنا بعزل الكولاجين من ذيول الفئران البالغة لتوليد مصفوفات ثلاثية الأبعاد قمنا فيها بزراعة مجاميع الخلايا المعدلة وراثياً التي تعبر عن N...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نمو المحاور النامية هو في المقام الأول الغازية ويشمل تدهور ECM وإعادة عرض. باستخدام الإجراء المعروض هنا، يمكن للباحثين الحصول على مصفوفة ثلاثية الأبعاد متجانسة تتكون من الكولاجين الطبيعي I النوع الذي يمكن أن تستجيب فيه المحاور (أو الخلايا) لتدرج كيميائي يفرزه الخلايا المعدلة وراثياً كما ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفان توم يوهانان على المشورة التحريرية وM. Segura-Feliu على المساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج المركز الإقليمي للبحوث والبحوث والبحوث من قبل لجنة الجامعات والبحوث التابعة لقسم الابتكار والجامعات والمؤسسة العامة لكاتالونيا (SGR2017-648). تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة البحوث والابتكار والجامعات الإسبانية (MEICO) من خلال BFU2015-67777-R وRTI2018-099773-B-100، وشبكة Prion الإسبانية (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT)، ومعهد كارلوس الثالث، CIBERNED ( PRY-2018-2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)SigmaD5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 serum-free supplement 50x Invitrogen17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kitPierce23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell linesATTCCRL-1570
D-(+)-GlucoseSigma16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal mediumSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture mediumInvitrogen41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for culturesInvitrogen14200
Ethanol merck108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)SigmaE5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)Electron Microscopy Sciences (EMS)17984-25
Gelatin powder SigmaG1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)Panreac211008
Hank’s balanced salt solution Invitrogen24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum Invitrogen10108-165
Heat-inactivated horse serum Invitrogen26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)Sigma316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 mediumInvitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 ReagentInvitrogen11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 supplement 100x Invitrogen17502-048
Neurobasal medium Invitrogen21103049
ParaformaldehydeMerck1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x Invitrogen15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistryInvitrogenAM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse Vector LabsBA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Sodium azide Panreac162712
Sodium bicarbonate solution 7.5% Invitrogen25080-094
Sterile culture grade H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 SigmaX100
Trizma base SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes Corning or similar
2 haemostats  Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissorsFine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugationNalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates Nunc176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes.Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors)Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membraneSigmaD9402
Dialysis tubing closures SigmaZ37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes Nunc 150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin barsIKA or similar
McIlwain tissue chopperMickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue piecesFine tools Instruments or similar

References

  1. Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148 3 D explants

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved