JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы предоставляем метод анализа поведения растущих аксонов в 3D матрицах, имитирующих их естественное развитие.

Аннотация

Этот протокол использует естественный коллаген i типа для того чтобы произвести трехмерный (3-D) гидрогель для контролировать и анализировать рост аксонального. Протокол сосредоточен на культивировании небольших кусочков эмбрионального или раннего послеродового мозга грызунов внутри 3-D гидрогеля, образованного коллагеном типа I, полученным от хвоста крысы. Части тканей культивируются внутри гидрогеля и сталкиваются с конкретными фрагментами мозга или генетически модифицированными клеточными агрегатами для производства и выделения молекул, пригодных для создания градиента внутри пористой матрицы. Шаги этого протокола просты и воспроизводимы, но включают критические шаги, которые необходимо тщательно рассмотреть при его разработке. Кроме того, поведение растущих аксонов можно контролировать и анализировать непосредственно с помощью фазово-контрастного микроскопа или моно/мультифотонного флуоресцентного микроскопа после фиксации иммуноцитохимическими методами.

Введение

Нейронные аксоны, заканчивающиеся аксоновыми конусами роста, мигрируют на большие расстояния через внеклеточную матрицу (ECM) эмбриона по определенным путям для достижения соответствующих целей. Конус роста дистальная часть аксона и специализируется на чувстве физической и молекулярной среды клетки1,2. С молекулярной точки зрения, рост конусов руководствуются по крайней мере четыре различных молекулярных механизмов: контакт притяжения, химиоаттракцион, контактное отталкивание, и chemorepulsion вызвано различными аксональных сигналов руководства3,4 , 5 , 6. Контактные процессы могут быть частично контролироваться в двухмерных (2D) культурах на микроузорчатых субстратах (например, с полосами7,8 или пятнами9, содержащими молекулы). Тем не менее, аксоны могут перемещаться к своей цели в недиффузной манере, чувствуянесколько привлекательных и отталкивающих молекул из клеток направляющего столба в окружающей среде 4,5,10. Здесь мы описываем простой метод трех-D культуры, чтобы проверить, является ли секретная молекула вызывает chemorepulsive или химиопривлекательные эффекты на развивающихся аксонов.

Самые ранние исследования, направленные на определение эффектов аксон руководства сигналы использовали explant культур в трехмерных (3-D) матрицы для создания градиентов, имитирующих в условиях vivo11,12. Этот подход, наряду с экспериментами in vivo, позволил выявить четыре основных семейства наведения сигналов: Netrins, Slits, Semaphorins, и Ephrins4,5,6. Эти молекулярные сигналы и другие факторы13 интегрированы растущими аксономи, запуская динамику адгезионных комплексов и преобразуя механические силы через цитоскелет14,15,16. Для генерации молекулярных градиентов в трех-D культур для аксональной навигации, новаторские исследователи использовали плазменный сгусток субстратов17, который также был использован для органотипических срез препаратов18. Тем не менее, в 1958 году, новый протокол для создания 3-D коллагена гидрогели было сообщено для изучения с устройствами Максимова19, культурная платформа, используемая в нескольких исследованиях, пригодных для микроскопических наблюдений20. Другое исследование пионера сообщили коллагена гель в качестве инструмента для встраивания человека фибробластов для изучения дифференциации фибробластов в миофибробласты в процессах заживления ран21. Параллельно, Ламсден и Дэвис применяется коллаген из бычьей дермы для анализа преображаемого влияния фактора роста нерва (NGF) на руководящих сенсорных нервных волокон22. С развитием новых культурных платформ (например, многоколодцных пластин) различными компаниями и лабораториями, коллагеновые культуры были адаптированы к этим новым устройствам6,23,24,25 ,26. Параллельно, экстракт материала ECM, полученных из Линии опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой, был коммерчески доступен для расширения этих исследований27.

Недавно было разработано несколько протоколов для генерации молекулярных градиентов с исходными ролями в аксоне, используя 3-D гидрогели (например, коллаген, фибрин и т.д.) 28. Кроме того, молекула-кандидат может быть обездвижена в разной концентрации в пористой матрице (например, NGF29) или порождена путем культивирования в небольшой области 3-D гидрогелевной клетки агрегатов, выделяющих молекулу для генерации радиальной градиент4,23,24,25,26. Последняя возможность будет объяснена в этом протоколе.

Процедура, представленная здесь, является простым, быстрым и высоко воспроизводимым методом, основанным на анализе аксонального роста в трехмерных гидрогелевы химкультурэмбрионных культурах эмбрионального мозга мыши. По сравнению с другими методами, протокол хорошо подходит для неподготовленных исследователей и может быть полностью разработан после короткого обучения (1-2 недели). В этом протоколе мы сначала изолируем коллаген от взрослых крысиных хвостов для дальнейшего создания 3-D матриц, в которых генетически модифицированные клеточные агрегаты культивируются перед эмбриональной нейронной тканью. Эти клеточные агрегаты образуют радиальные химические градиенты молекулы-кандидата, которые вызывают реакцию на растущие аксоны. Наконец, оценка влияния молекулы на растущие аксоны может быть легко выполнена с помощью фазовой контрастной микроскопии или, в качестве альтернативы, иммуноцитохимических методов.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами Комитета по этике для экспериментов на животных (CEEA) Университета Барселоны, и протокол об использовании грызунов в данном исследовании был рассмотрен и одобрен CEEA Университет Барселоны (CEEA утверждение #276/16 и 141/15).

1. Очистка крысиного хвоста коллагена

  1. Соберите взрослых хвостов Крысы Sprague-Dawley (8-9 недель) после жертвоприношения животного в соответствии с этическими нормами и промыть 95% этанола. Поместите 2-4 хвоста на лед (4 градуса По Цельсию) и держите их покрытыми льдом во время процесса.
  2. Чтобы получить хвостовые сухожилия, закрепите хвост на самых хвостовых позвонках хвоста с помощью гемостата и сжигивите хвост вторым гемостатом, расположенным примерно на 5-7 мм от первого. Разбейте хвост, резко скручивая его обоими гемостатами. Для этого сложите/разверните позвонки несколько раз, пока он не сломается.
  3. Потяните позвонки медленно с hemostat, чтобы отделить сухожилия от их оболочки, как он выходит. В этот момент вырежьте сухожилия мелкими ножницами. Держите эти кусочки сухожилия в стерильной 100 мм чашку Петри на льду.
  4. Повторите зажим и скольжения для остальной части хвоста, пока сухожилия полностью извлечены.
  5. Повторите шаги 1.2-1.4 для всех полученных хвостов.
  6. Наблюдайте сухожилия под микроскопом. Откажитесь от кровеносных сосудов, разрезая мелкими ножницами и держа с прямыми тонкими щипками, чтобы улучшить чистоту сухожилия и промыть сухожилия 3 раза ультрачистой водой.
  7. Соберите 3-4 г влажных сухожилий. Растворите сухожилия в 150 мл 3% ледниковой уксусной кислоты при 4 градусах Цельсия в стеклянной конной колбе 200-250 мл на 24-36 л, под нежным перемешиванием.
  8. Центрифуга при 20 000 х г на 1 ч. Параллельно, подготовить диализ трубме мембраны, разрезая кусок около 10-15 см в длину и варить его в ультрачистой воде, содержащей 1 мМ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) в течение 15 мин. После этого аккуратно промыть мембрану диализа тщательно с ультрачистой водой.
  9. После центрифугации, собирать супернатант в диализе трубной мембраны путем декантации. Гранулы содержат кислый нерастворимый материал (неколлагеновые белки), а супернатант содержит растворимые коллагеновые белки.
  10. Диализ супернатант против 2 л стерильных 0,1x Минимальный основной средний орел (MEM), рН 4.0 в 2-5 L стеклянный стакан. Диализ в течение 3 дней. Изменение решения 0.1x MEM по крайней мере два раза в день проверяя рН при каждом изменении перед использованием. Если рН стал базовым, измените его с помощью нескольких капель уксусной кислоты 0,1 М до 4,0.
  11. После диализа добавьте антибиотики (1,5 мл пенициллина/стрептомицина (Pen-Strep)) в диализированный коллагеновый раствор. Сделать 5 мл aliquots коллагена бульона раствора и хранить при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента все процедуры обработки должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном капоте потока.
  12. Продолжить геляционный тест подготовленного раствора коллагена после следующих шагов.
    1. Так как бульонный коллаген обычно слишком концентрирован, подготовьте 3 рабочих разбавления (75%, 50% и 25% коллагенового раствора) путем разбавления бульона в 0,1x MEM, pH 4.0. Окончательный объем, рекомендованный для каждого рабочего разбавления, составляет 5 мл. В каждом условии, проверить концентрацию белка с помощью белка colorimetric анализ.
    2. Поместите несколько пустых 1,5 мл конических центрифуговых труб (по одному на каждое работающее разбавление), 10-x мем-трубки, 7,5% раствор бикарбоната натрия и различные рабочие разбавления коллагена на льду. Подождите, пока они охлаждаются.
    3. Добавьте 40-50 л 10x MEM в холодную (4 к ВК) центрифугу трубку. Далее, смешайте его осторожно с 7-8 л раствора бикарбоната натрия.
    4. Добавьте в эту трубку 310-330 л одного из различных разбавлений коллагена и аккуратно перемешайте ее с пипеткой, избегающей образования пузырьков. Держите смесь бикарбоната коллагена-МЕм-натрия на льду (4 градуса По Цельсию) в течение не менее 5 мин.
    5. Пипетка 10-25 л смеси в 35 мм чашку Петри.
    6. Поместите чашку Петри в инкубатор CO 2, установленный при 37 градусах По Цельсию, до тех пор, пока не будет наблюдаться гелевание гидрогеля (15-20 мин).
    7. Повторите шаги 1.12.3-1.12.6 для остальных разбавления коллагена в различных блюдах Петри.
    8. Выберите коллаген амракии, который делает лучшие результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучший гелеобразный гидрогель должен иметь однородную полупрозрачную текстуру, серый цвет и не должен быть кусковым или тягучим. По нашему опыту, разбавление 3:1 (Коллаген: 0.1x MEM) генерирует лучшие экспериментальные результаты.

2. Подготовка клеток (COS1) Агрегаты генетически модифицированных, чтобы секретировать молекулу кандидата в 3-D коллагенгидрогели

  1. Плита 2 х 106 COS1 клеток в 35 мм Петри блюда и инкубировать с полной среде культуры состоит из 100 мл D-MEM, содержащий 10% (vol/vol) тепло-инактивированной плода крупного рогатого скота сыворотки, 0,5% (WT/vol) глутамин и 1% (Wt/vol) Pen /Strep в клеточной культуре инкубатор, для того, чтобы достичь 70-80% выпуклости в одночасье. Приготовьте одно блюдо Петри для каждой процедуры трансфекции.
  2. На следующий день трансфектные клетки COS1 с ДНК, кодирующей молекулу-кандидата (Netrin-1 или Sema3E) с использованием метода трансфекции на основе липосомы в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Для этого смешайте 250 л сыворотки среды и ДНК (1-2 мкг на состояние) в 1,5 мл центрифуги трубки (ДНК трубки) и перемешать. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин. Подготовьте вторую трубку (липосомальная трубка), добавив 240 л/с среды, свободной от сыворотки, и 10 л липосомального трансфекционного реагента. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    2. После инкубации добавьте содержимое ДНК-трубки в липосомальную трубку и аккуратно перемешайте. Теперь инкубировать на RT в течение 15 мин. Замените среду на культивированных клетках с 1,5 мл сыворотки свободной среде и добавить ДНК-липосомы смесь в чашку Петри медленно dropwise. Инкубировать 3 ч в инкубаторе культуры CO 2.
  3. После 3 ч трансфекционной инкубации замените среду полной культурой среды и инкубировать на ночь в инкубаторе.
  4. На следующий день, промыть клетки с 0,1 М Dulbecco в фосфат буферных солен (D-PBS), лечить культуры с трипсин-EDTA (800 л на каждое блюдо в течение 5-15 минут в CO2 инкубатора) и собирать отдельные клетки с 15 мл полной среде культуры.
  5. Центрифуги клетки при 4 градусах по Цельсию при 130 х г в течение 5 мин. После центрифугирования удалите носители и сохраните гранулы, содержащие клетки COS1, на льду.
  6. Повторите шаги 1.12.3-1.12.6 для подготовки коллагеновой рабочей смеси.
  7. Добавьте 100-150 л коллагеновой смеси в гранулы трансинфицированных клеток и аккуратно перемешайте, прокладывая вверх и вниз, и распространяйте 45-50 л этой смеси на блюдо Петри (диаметр 35 мм) для формирования единой полосы коллагеновых клеток длиной около 1-1,5 см. Поместите блюдо в инкубатор при состоянии 37градусов по Цельсию (5% CO 2) до гелирования (15-20 мин).
  8. Приготовьте вторую полоску, содержащую контрольные клетки (mock transfection) во второй культуре блюдо и наплитуйте ее в инкубаторе (15-20 мин) и когда гелевание завершится, добавьте 3-4 мл подогретого (37 кВ) COS1 полной культуры среды к каждому блюду, содержащему гелеобразную коллаген-клетки раздевают и держат их в инкубаторе культуры CO 2. После этого вырежьте полоски коллагеновых клеток для генерации небольших квадратных кусочков (от 400 до 500 мкм в длину) с помощью мелкого скальпеля или тканевого измельчителя.
  9. Перенесите все секции из одного и того же трансфекционного состояния в чашку Петри, содержащую 3-3,5 мл нейронной культуры носителей (NCM) и проверьте под микроскопом вскрытия качество деталей. Опять же, держать их в ИНкубатор культуры CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрональная среда культуры состоит из нейробазальной среды, содержащей 1-5% (vol/vol) тепло-инактивированной сыворотки лошади, 2 мМ глутамина, 0,5% (wt/vol) глюкозы, 1% (wt/vol) Pen-Strep решение и 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Убедитесь, что рН находится между 7.2-7.3.

3. Поколение эмбрионального Explant для культуры

  1. Стерилизовать хирургические инструменты (ножницы, ручка лезвия скальпеля, прямые и изогнутые щипцы) путем автоматического автоматического следования обычным правилам стерилизации. Параллельно готовят 500 мл сбалансированного солевого раствора - глюкозного буфера И 4-5 блюд Петри (диаметр 100 мм), содержащего 10 мл HBSS-G. Поместите эти пластины на лед (4 градуса по Цельсию).
  2. Пожертвуйте беременной самкой крысы (эмбриональный день 16.5) за пределами стерильной области, следуя утвержденным этическим процедурам. Вырежьте рога эмбриона ножницами из брюшной полости и поместите его в большое блюдо Петри, содержащее холодный HBSS-G.
  3. Поместите блюдо в ламинарный капот потока и извлечь эмбрионы с прямыми щипками. Поместите их в новое блюдо, содержащее холодный HBSS-G. Далее, удалить кожу эмбриона с помощью небольших щипков и тщательно вскрыть мозг с помощью изогнутых и прямых щипков. Поместите их в блюдо, содержащее холодный HBSS-G.
  4. Под рассекающим микроскопом разрежьте мозг пополам вдоль средней линии, чтобы отделить оба полушария скальпелем или тонкими ножницами и удалить диенцефалон, обезвреживание и кровеносные сосуды из кусочков мозга тонкими щипками.
  5. Повторите шаги 3.3-3.4 с остальными эмбрионами. Не откладывайте вскрытие более чем на 2 ч, чтобы сохранить качество ткани.
  6. Очистите все части тканевого измельчителя 100% этанолом (особенно тритетрафторэтилен (ПТФЕ) режущей пластины и лезвия бритвы). Держите тканевой вертолет в ламинарном пуховом капоте под ультрафиолетовым освещением в течение 15 минут.
  7. Перенесите каждую часть ткани (например, кору с гиппокампом) на режущей пластине тканевого измельчителя. Для гиппокампа, поместите его перпендикулярно лезвию бритвы и получить ткани разделов 450-500 мкм в толщину.
  8. Приготовьте несколько 35 мм посуды Петри с 3-4 мл полного NCM и перенесите кусочки ткани из тарелки тканевого измельчителя в посуду Петри. Многие блюда могут быть необходимы, как регионы, представляющие интерес вскрыты.
  9. Закончите рассечение ткани в полном NCM с помощью тонких вольфрамовых игл. Проверьте качество полученных ломтиков под рассекающимся микроскопом. Убедитесь, что слои четко идентифицируются в оптике темного поля и вскрыть область интереса (например, CA области гиппокампа) с вольфрамовых игл. Отбросьте поврежденные ломтики. Держите гиппокампа explants в полной среде NCM в CO2 инкубатора.

4. Подготовка трехмерных кокультур в коллагеновых гидрогелях

  1. Поместите несколько стерильных 4-колодцев культуры пластин в ламинарный капот потока и подготовить коллагенрабочей смеси, как ранее указывалось в шагах 1.12.2-1.12.6.
  2. Поместите 15-20 л гидрогелевой смеси в дно скважины для получения круглого коллагена. Повторите этот шаг для остальных скважин. Не подготовьте более пяти пластин одновременно, чтобы избежать чрезмерного жидкого испарения из основания гидрогеля.
  3. Храните посуду в инкубаторе до полного гелирования (15-20 мин) и вынимайте тарелки из инкубатора только после завершения гелирования. Проверьте качество гелеобразного коллагена.
  4. Перенесите небольшой кусочек агрегата coS1 с помощью пипетки. Поместите его на основание гидрогеля и поместите кусок ткани на той же основе с пипеткой близко к куску клеток агрегата на один explant размера.
  5. Подготовьте новую рабочую смесь коллагена на льду, как в шагах 1.12.2-1.12.6.
  6. Аккуратно пипетка 15-20 л этой новой смеси и покрыть explant и совокупности клеток. Будет наблюдаться сэндвич-подобная гидрогельная культура. В этот момент, переориентировать explant с тонкой иглой вольфрама (не прикасайтесь к агрегату ячейки COS1!), Так что он сталкивается с совокупностью ячейки на 500-600 мкм.
  7. Вернуть пластину в инкубатор до тех пор, пока не будет наблюдаться гелирование (10-15 мин) и 0,5 мл полного NCM, дополненного дополнением 2% B27и сохраняйте культуры в течение 36-48 ч в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).

5. Фиксация эксплант-клеточных агрегатных кокультур и иммуноцитохимических процедур

  1. После 36-48 ч инкубации, удалить среду и промыть с 0,1 М фосфат буферного соления (PBS), рН 7.3. После этого, исправить культур ы для 1 ч с 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатбуфер (Pb), рН 7,3, при 4 градусах Цельсия.
  2. Удалить фиксатор и аккуратно промыть культуры 3-4 раза (10-15 мин каждый) в 0,1 М ПБ, рН 7,3.
  3. Отсоедините сэндвич с гидрогелем со дна колодца шпателем или щипками. Перенесите коллагеновый блок тонкой кистью в 6-колодую культурную пластину, содержащую 0,1 М ПБС с 0,5% неионическим моющим средством.
  4. Инкубировать свободно плавающие гидрогели в блокирующем растворе (10% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина в 0,1 М ПБС) на 2-3 ч при РТ с нежным возбуждением.
  5. Промыть 3 раза (10-15 мин каждый) с 0,1 М PBS, содержащий 0,5% неионического сурфактанта.
  6. Инкубировать первичными антителами, разбавленными в PBS, содержащей 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта, 0,2% желатина и 0,02% азида натрия. Инкубировать с основным антителом для 36-48 ч при 4 градусах по Цельсию на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно антитела против класса III з-тубулин (З-ТУД-1) (разбавленный 1:2,000) используется для определения аксонального роста в 3-D гидрогелькультур культур.
  7. После инкубации промыть как в шаге 5.5.
  8. Инкубировать вторичными антителами в течение 4 ч при РТ (или 6-7 ч при 4 градусах Цельсия) на шейкере, разбавленном 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина. Лошадь анти-мышь биоинтинилатированных антител (разбавленных 1:200) используется в этом эксперименте.
  9. Промыть культуры, как в 5,5.
  10. Инкубировать культуры в течение 2 дней при 4 градусах Цельсия раствором авидин-биотина (ABC) 1:100, разбавленным в PBS, содержащим 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина. Кроме того, используйте хрен peroxidase (HRP) помечены стрептавидин (разбавленный 1:300-400) в том же буфере.
  11. Промыть культуры, описанные в 5.5.
  12. Промыть культуры несколько раз с 0,1 M Tris-HCl буфер, рН 7,6 для 1 ч.
  13. Инкубировать культуры с 0,03% от 3,3 "-Диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB) раствор в 0,1 М Tris-HCl, рН 7,6.
  14. Добавьте 5-8 л 1% H2O2 и подождите 10-15 мин. Мониторинг развития DAB под микроскопом с помощью 4-10x цели.
  15. Остановите реакцию, удалив раствор DAB с буфером 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6.
  16. Промыть культуры в PBS в течение 30 минут (несколько изменений).
  17. Установите гидрогели на стеклянные горки с помощью водной основе монтажных носителей.
  18. Проанализируйте длину и распределение аксонов внутри гидрогеля с помощью плагина анализа Sholl или с помощью плагина NeuriteJ для программного обеспечения ImageJ30.

Результаты

Здесь мы представляем широко доступную методологию для изучения аксонального роста в 3-D гидрогель коллагеновых культурах эмбриональной нервной системы мыши. С этой целью мы выделили коллаген из хвостов взрослых крыс для генерации 3-D матриц, в которых мы культивировали генетически мод...

Обсуждение

Рост развивающихся аксонов в основном инвазивный и включает в себя деградацию и ремоделирование ECM. Используя представленную здесь процедуру, исследователи могут получить однородную трехмерную матрицу, образованную коллагеном природного типа I, в котором аксоны (или клетки) могут реа?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Тома Иоганнана за редакционную консультацию и М. Сегуру-Фелиу за техническую помощь. Эта работа финансировалась Программой CERCA и Комиссией по университетам и исследованиям Департамента инноваций, университетов и предприятий Общего управления Каталонии (SGR2017-648). Эта работа была профинансирована испанским министерством исследований, инноваций и университета (MEICO) через BFU2015-67777-R и RTI2018-099773-B-100, испанской prion Network (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT), и Институт Карлосiii, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)SigmaD5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 serum-free supplement 50x Invitrogen17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kitPierce23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell linesATTCCRL-1570
D-(+)-GlucoseSigma16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal mediumSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture mediumInvitrogen41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for culturesInvitrogen14200
Ethanol merck108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)SigmaE5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)Electron Microscopy Sciences (EMS)17984-25
Gelatin powder SigmaG1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)Panreac211008
Hank’s balanced salt solution Invitrogen24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum Invitrogen10108-165
Heat-inactivated horse serum Invitrogen26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)Sigma316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 mediumInvitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 ReagentInvitrogen11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 supplement 100x Invitrogen17502-048
Neurobasal medium Invitrogen21103049
ParaformaldehydeMerck1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x Invitrogen15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistryInvitrogenAM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse Vector LabsBA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Sodium azide Panreac162712
Sodium bicarbonate solution 7.5% Invitrogen25080-094
Sterile culture grade H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 SigmaX100
Trizma base SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes Corning or similar
2 haemostats  Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissorsFine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugationNalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates Nunc176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes.Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors)Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membraneSigmaD9402
Dialysis tubing closures SigmaZ37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes Nunc 150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin barsIKA or similar
McIlwain tissue chopperMickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue piecesFine tools Instruments or similar

Ссылки

  1. Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1483 D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены