JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.

Abstract

פרוטוקול זה משתמש טבעי סוג אני קולגן לייצר תלת מימדי (3-D) הידרוג'ל לניטור וניתוח של הצמיחה סיבי. הפרוטוקול ממורכז על פיסות קטנות של המוח העובריים או מוקדם לידלנטאל מכרסמים בתוך 3-D הידרוג'ל שנוצר על ידי גיד הזנב חולדה-נגזר סוג שאני קולגן עם מפרט ספציפי. חתיכות רקמה הם מתורבתים בתוך ההידרוג'ל והתעמת עם שברי מוח ספציפיים או מהונדסים גנטית אגרגטים לייצר ולהפריש מולקולות מתאים ליצירת מעבר הדרגתי בתוך המטריצה הנקבובי. השלבים של פרוטוקול זה הם פשוטים ומיותחים אך כוללים צעדים קריטיים שייחשבו בקפידה במהלך התפתחותו. יתר על כן, התנהגות של אקסונים גדל ניתן לפקח ולנתח ישירות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות או מונו/מיקרוסקופ רב-משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטית לאחר קיבעון על ידי שיטות אימונוטוקוכימיקלים.

Introduction

האקסון העצבי, המסתיים אצטרובלים הצמיחה axons, להעביר מרחקים ארוכים דרך מטריצה החילוץ (ECM) של העובר על מסלולים ספציפיים כדי להגיע למטרות המתאימות שלהם. חרוט הצמיחה הוא החלק המרוחק של אקסון והוא מתמחה לחוש את הסביבה הפיזית והמולקולרית של התא1,2. מבחינה מולקולרית, אצטרובלים הצמיחה מונחים על-ידי לפחות ארבעה מנגנונים מולקולריים שונים: האטרקציה קשר, כימומשיכה, קשר דחייה, ו chemorepulsion מופעל על ידי רמזים שונים הדרכה סיבי3,4 , מיכל 5 , 6. ניתן לעקוב אחר תהליכים בתיווך באופן חלקי בתרבויות דו ממדיות (2d) על גבי מיקרו-מצעים (לדוגמה, עם פסים7,8 או כתמים9 המכילים את המולקולות). עם זאת, אקסונים יכולים לנווט אל היעד שלהם באופן לא מושפע על ידי חישת מספר מולקולות אטרקטיבי ודוחה מתוך הנחיה התאים בסביבה4,5,10. כאן, אנו מתארים שיטה קלה של תרבות תלת-ממדית כדי לבדוק אם המולקולה המופרש גורמת להשפעות של השפעות מושכות או כימוחלות על מפתח אקסונים.

המחקרים המוקדמים ביותר שנועדו לקבוע את ההשפעות של הרמזים אקסון הדרכה השתמשו בתרבויות המחקר תלת מימדי (3-D) מטריצות כדי ליצור מעברי צבע הדמיית בתנאים vivo11,12. גישה זו, יחד עם ניסויים vivo, מותר לזהות ארבע משפחות מרכזיות של רמזים ההנחיה: netrins, חריצים, סמבורנים, והאורגים4,5,6. אלה סימנים מולקולריים וגורמים אחרים13 משולבים על ידי axons גדל, מפעילה את הדינמיקה של מכלולי הדבקה והתמרה כוחות מכניים דרך שלד ציטומה14,15,16. כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים בתרבויות תלת-ממד עבור ניווט סיבי, חוקרים חלוצי השתמשו קריש פלזמה מצעים17, אשר שימש גם עבור ההכנות פרוסה otypic18. עם זאת, בשנת 1958, פרוטוקול חדש להפקת הידרוג'ל קולגן תלת-ממדי דווח ללימוד עם מכשירים ́s מיאטו19, פלטפורמת תרבות, בשימוש במספר מחקרים המתאימים לתצפיות מיקרוסקופיים20. עוד מחקר חלוץ דיווחו על ג'ל קולגן ככלי להטביע את הגידולים האנושיים לחקר הבידול של פיברובמות לתוך מיופיברופיצוצים בתהליך ריפוי הפצע21. במקביל, Lumsden ו דיוויס להחיל קולגן מפני השור הפרה כדי לנתח את ההשפעה הפוטיבית של גורם הגדילה העצבי (NGF) על המנחה סיבי העצב החושי22. עם פיתוח פלטפורמות תרבות חדשות (g., צלחות מרובות) על ידי חברות ומעבדות שונות, תרביות קולגן הותאמו אלה מכשירים חדשים6,23,24,25 ,26. במקביל, תמצית של חומר ECM הנגזר מתוך קו הגידול של הולם-ההולם-נחיל של מהפך להיות זמין מסחרית כדי להרחיב את המחקרים27.

לאחרונה, מספר פרוטוקולים פותחו כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים עם תפקידים בשיטת אקסון הדרכה באמצעות הידרוג תלת-ממדי (למשל, קולגן, פיברוב, וכו ') 28. לחילופין, מולקולת המועמד יכול להיות מנופף בריכוז שונה במטריצה נקבובי (g., ngf29) או שנוצר על ידי culturing באזור קטן של אגרגטים תלת-ממד תא הידרוג'ל הפרשת המולקולה כדי ליצור רדיאלי מעבר צבע4,23,24,25,26. האפשרות האחרונה תהיה מוסברת בפרוטוקול זה.

ההליך המוצג כאן הוא שיטה קלה, מהירה ומאוד מבחינה מעשית המבוססת על ניתוח של צמיחה סיבי בתרבויות תלת-ממד הידרוג'ל של מוח העכבר העובריים. בהשוואה לשיטות אחרות, הפרוטוקול מתאים היטב לחוקרים שאינם מאומנים וניתן לפיתוח מלא לאחר אימון קצר (1-2 שבועות). בפרוטוקול זה, אנחנו הראשון לבודד קולגן מזנבות עכברוש מבוגר כדי ליצור עוד מטריצות תלת-ממד שבו אגרגטים תאים מהונדסים גנטית הם מתורבתים מול רקמת עצבי עובריים. אלה אגרגטים תאים טופס מעברי צבע כימיים רדיאלי של מולקולה מועמד אשר מעורר את התגובה של axons גדל. לבסוף, ניתן לבצע בקלות את הערכת ההשפעות של המולקולה על האקטונים הגדלים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או, לחילופין, שיטות אימונוציטוטוקכימיקלים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו תחת ההנחיות והפרוטוקולים של הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים (CEEA) של אוניברסיטת ברצלונה, ואת הפרוטוקול לשימוש מכרסמים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי CEEA של אוניברסיטת ברצלונה (אישור CEEA276/16 ו 141/15).

1. טיהור זנב של עכברוש קולגן

  1. לאסוף מבוגר ג ' ספראג מבוגרים זנבות עכברוש (8-9 שבועות בן) לאחר להקריב את החיה הבאים הנחיות אתיות ולשטוף ב 95% אתנול. מניחים 2-4 זנבות על הקרח (4 ° c) ולשמור אותם מכוסים בקרח במהלך התהליך.
  2. כדי להשיג גידים הזנב, לתקן את הזנב בחוליות caudal ביותר של הזנב באמצעות הידסטט ולדחוס את הזנב עם הדימום השני ממוקם סביב 5-7 mm מהראשון. לשבור את הזנב על ידי פיתול בחדות עם שני הומוסטטיסטיקה. כדי לעשות זאת, לקפל/להתפתח את החוליות כמה פעמים עד שהוא נשבר.
  3. משוך את החוליות לאט עם הדימום כדי לנתק את הגידים מן הנדן שלהם כפי שהוא יוצא. ברגע זה, חותכים גידים. עם מספריים קטנים שמור את חתיכות הגיד האלה בצלחת פטרי 100 מ"מ על קרח.
  4. חזרו על הפעולה והזזה למשך שאר הזנב עד שהגידים יחולצו לחלוטין.
  5. חזור על שלבים 1.2-1.4 עבור כל הזנבות שהתקבלו.
  6. . שימו לב לגידים שמתחת למיקרוסקופ התעלם כלי דם על ידי גזירה עם מספריים קטנים מחזיק עם מלקחיים בסדר ישר כדי לשפר את הטוהר של הגיד ולשטוף את הגידים 3 פעמים עם מים באולטרטהורים.
  7. לאסוף 3-4 גרם של גידים רטוב. מפזר את הגידים ב 150 mL של 3% חומצה אצטית קרחוני ב 4 ° צ' ב בקבוקון מזכוכית 200-250 mL עבור 24-36 h, תחת ערבוב עדין.
  8. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 1 h. במקביל, להכין את קרום צינור דיאליזה על ידי חיתוך פיסת סביב 10-15 ס מ אורך ומרתיחים אותו במים אלקטרופורזה המכיל 1 מ"מ חומצה ethylenediamאצטט (edta) עבור 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף בעדינות את קרום דיאליזה ביסודיות עם מים באולטרטהורים.
  9. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את הסופרנטנט בקרום אבובים דיאליזה על ידי שפייה. הגלולה מכילה חומר בלתי מסיס חומצי (חלבונים שאינם קולגן) והסופרנטאנט מכיל חלבונים קולגן מסיסים.
  10. Dialyze הסופרנטנט נגד 2 L של סטרילי 0.1 x מינימלי הנשר הבינוני (הזיכרון), pH 4.0 בגביע הזכוכית 2-5 L. Dialyze במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון של 0.1 x לפחות פעמיים ביום בדיקת ה-pH בכל שינוי לפני השימוש. אם ה-pH הפך בסיסי, לשנות אותו עם כמה טיפות של 0.1 M חומצה אצטית עד pH הוא 4.0.
  11. לאחר דיאליזה, להוסיף אנטיביוטיקה (1.5 mL של פניצילין/סטרפטומיצין (עט-דלקת)) לפתרון קולגן דיאליזה. הפוך 5 mL מתוך הפתרון של מלאי הקולגן וחנות ב 4 ° c.
    הערה: מנקודה זו, יש לבצע את כל הליכי הטיפול בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינארי.
  12. המשך עם מבחן gelation של הפתרון מוכן מלאי קולגן לאחר השלבים הבאים.
    1. מאז הקולגן מניות הוא בדרך כלל מרוכז מדי, להכין 3 מדלל עבודה (75%, 50%, ו 25% קולגן פתרון) על ידי דילול המניה 0.1 x, pH 4.0. הכרך האחרון המומלץ לכל דילול עובד הוא 5 מ ל. בכל תנאי, בדוק את ריכוז החלבון באמצעות שיטת הצביעה בחלבון.
    2. מקום מספר ריק 1.5 mL הצינורות צנטריפוגה (אחד עבור הדילול כל עובד), 10x צינורות הזיכרון, 7.5% נתרן ביקרבונט פתרון ומדלל עבודה שונים של קולגן על קרח. . חכה עד שאלה יתקררו
    3. הוסף 40-50 μL של הגברת 10x לצינור הצנטריפוגה הקר (4 ° c). הבא, לערבב אותו בעדינות עם 7-8 μL של תמיסת נתרן ביקרבונט.
    4. הוסף 310-330 μL של אחד מדלל קולגן שונים לצינור זה ולערבב אותו בעדינות עם הפיפטה הימנעות כל היווצרות בועה. שמרו על התערובת של הקולגן-מביקרבונט נתרן על הקרח (4 ° c) לפחות 5 דקות.
    5. פיפטה 10-25 μL של התערובת לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ.
    6. מניחים את צלחת פטרי בחממה CO2 להגדיר ב 37 ° צ' עד הגגנציה של ההידרוג'ל (± 15-20 דקות) הוא נצפתה.
    7. חזרו על שלבים 1.12.3-1.12.6 לדילול הקולגן הנותרים במנות פטרי שונות.
    8. בחר את הקולגן עובד דילול שמעבדת את התוצאות הטובות ביותר.
      הערה: את ההידרוג'ל הטוב ביותר צריך להיות מרקם שקוף אחיד, צבע אפור לא צריך להיות לאמפי או הדים. בניסיון שלנו, דילול של 3:1 (קולגן: הזיכרון 0.1 x) יוצר את התוצאות הנסיוניות הטובות ביותר.

2. הכנת תא (COS1) אגרגטים גנטית-השתנה כדי להפריש מולקולה המועמד 3-D הידרוג'לים קולגן

  1. צלחת 2 x 106 תאים COS1 לתוך 35 mm מנות פטרי ו-דגירה עם מדיום התרבות המלאה מורכב 100 ML של D-הזיכרון המכיל 10% (vol/vol) חום-inactivated פעלה העובר סרום, 0.5% (wt/vol) גלוטמין ו 1% (wt/Vol) עט/דלקת בתרבות התא חממה, כדי להגיע 70-80% השטף בלילה. הכינו צלחת פטרי אחת לכל תהליך החצייה.
  2. למחרת היום transfect COS1 תאים עם ה-DNA קידוד מולקולה המועמד (נטרין-1 או Sema3E) באמצעות שיטת החצייה המבוססת על ליפופי מסוימים בעקבות הוראות היצרן.
    1. כדי לעשות את זה, לערבב 250 μL של סרום ללא מדיום ו-DNA (1-2 μg לכל תנאי) לצינור הצנטריפוגה של ה1.5 mL (צינור DNA) ולערבב. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות. הכינו צינורית שנייה (שפופרת ליפוזומלית) על-ידי הוספת 240 μL של מדיום ללא סרום ו -10 μL של מגיב החצייה ליפוזומבית. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
    2. לאחר דגירה, להוסיף את התוכן של ה-DNA-tube לצינור ליפוזומיום ולערבב בעדינות. עכשיו מודדת ב-RT למשך 15 דקות. החלף את המדיום על תאים מתורבתים עם 1.5 mL של מדיום ללא סרום ולהוסיף את התערובת DNA-ליפוזומים לצלחת פטרי באיטיות dropwise. דגירה עבור 3 שעות בחממה לתרבות התא CO2 .
  3. לאחר 3 שעות של דגירה של הגידול, להחליף את המדיום עם בינונית התרבות המלאה, הדגירה לילה בחממה.
  4. למחרת, לשטוף את התאים עם 0.1 מ ' מלוחים מפוספז פוספט של ביטר M באגירה (D-PBS), לטפל בתרבויות עם טריפסין-EDTA (800 μL לכל מנה עבור 5-15 דקות בחממה CO2 ) ולאסוף תאים מנותקים עם 15 מ ל של מדיום התרבות השלמה.
  5. צנטריפוגה את התאים ב 4 ° צ' ב 130 x g עבור 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר מדיה ולשמר את הגלולה המכילה תאים COS1 על הקרח.
  6. חזור על שלבים 1.12.3-1.12.6 כדי להכין את הקולגן לעבוד תערובת.
  7. הוסף 100-150 μL של תערובת הקולגן את הגלולה של תאים מזוהמים ומערבבים בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה ולהתפשט 45-50 μL של תערובת זו על צלחת פטרי (35 מ"מ קוטר) כדי ליצור להקה אחידה של תאים קולגן של סביב 1-1.5 ס מ אורך. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° צ' (5% CO2) עד הגלציה (± 15-20 דקות) הוא נצפתה.
  8. הכינו רצועה שנייה המכילה תאי בקרה (העברה מדמה) בצלחת תרבות שנייה ולוחית אותו בחממה (± 15-20 min) וכאשר השלמת הגחת הוספת 3-4 mL של מחומם (37 ° צ') COS1 בינונית התרבות המלאה לכל מנה המכילה את הג קולגן תאים רצועות ולשמור אותם ב-CO2 חממה תרבות תא. לאחר מכן, לחתוך את הרצועות בתאי קולגן כדי ליצור חתיכות מרובע קטן (400 כדי 500 יקרומטר באורך) באמצעות אזמל דק או מסוק הרקמה.
  9. העבירו את כל החלקים מאותו מצב מעבר לצלחת פטרי המכילה 3-3.5 מ ל של מדיית תרבות עצבית (NCM) ובדוק תחת מיקרוסקופ לחיתוך איכות החלקים. שוב, לשמור אותם בחממה תרבות תא2 CO.
    הערה: בינוני התרבות העצבי מורכב מדיום נוירובסיס המכיל 1-5% (vol/vol) החום המופעל סרום הסוס, 2 מ"מ גלוטמין, 0.5% (wt/vol) גלוקוז, 1% (wt/vol) עט-דלקת הפתרון ו 0.044% (wt/vol) נחקו3. ודא כי ה-pH הוא בין 7.2-7.3.

3. יצירת ההסבר העובריים לתרבות

  1. לחטא את כלי הניתוח (מספריים, ידית להב אזמל, מלקחיים ישר מעוקל) על ידי אוטוקלינג בעקבות הנחיות עיקור שגרתי. במקביל להכין 500 mL של תמיסת מלח מאוזנת של האנק-מאגר גלוקוז ו 4-5 מנות פטרי (100 מ"מ קוטר) המכיל 10 מ ל של HBSS-G. מניחים את הצלחות על הקרח (4 ° c).
  2. להקריב את העכברוש הנשי ההרה (היום העובריים 16.5) מחוץ לאזור סטרילי, בעקבות ההליכים האתיים שאושרו. חותכים את קרני העובר עם מספריים מחלל הבטן ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי גדולה המכילה את הקור HBSS-G.
  3. מניחים את הצלחת במכסה הזרימה למינארי ומחלצים את העוברים במלקחיים ישרים. מניחים אותם לתוך תבשיל חדש המכיל HBSS-G קר. הבא, להסיר את העור של העובר באמצעות מלקחיים קטנים ובזהירות לנתח את המוח באמצעות מלקחיים מעוקל ישר. מניחים אותם לתוך תבשיל המכיל HBSS-G קר.
  4. מתחת למיקרוסקופ מבתר, חותכים את המוח לשניים לאורך קו האמצע כדי להפריד בין האונות לבין המספריים השזורים או הדקים ולהסיר את הדינצאלון, כלי הקרום וכלי הדם מחלקי המוח עם מלקחיים עדינים.
  5. חזור על שלבים 3.3-3.4 עם שאר העוברים. אין לעכב את הניתוח עבור יותר מ 2 h כדי לשמר את איכות הרקמה.
  6. לנקות את כל החלקים של המסוק רקמות עם 100% אתנול (במיוחד את לוחית החיתוך polyארבאואתילן) ואת להב תער). שמרו על מסוק הטישו בתוך כיסוי השטף המבינארי תחת תאורה UV במשך 15 דקות.
  7. העבר כל פיסת רקמה (למשל, קליפת ההיפוקמפוס) לצלחת חיתוך של המסוק רקמות. עבור היפוקמפוס, מניחים אותו בניצב להב תער ולקבל מקטעים רקמות של 450-500 יקרומטר עובי.
  8. הכינו מספר מנות פטרי 35 מ"מ עם 3-4 mL של NCM מלאה ולהעביר את חתיכות הרקמה מלוחית המסוק של הרקמה אל מנות פטרי. מנות רבות עשויות להיות נחוצות כאשר אזורי עניין הם גזור.
  9. לסיים את הניתוח ברקמות NCM מלאה באמצעות מחטים טונגסטן משובח. בדוק את איכות הפרוסות המתקבלות תחת המיקרוסקופ החותך. ודא כי השכבות ניתנות לזיהוי בבירור בשדה האופטי ולנתח את אזור הריבית (למשל, אזור CA של ההיפוקמפוס) עם מחטים טונגסטן. התעלם מפרוסות פגומות. לשמור על ההיפוקמפוס היפוקמאל במדיום NCM מלאה ב-CO2 חממה.

4. הכנת תרבויות תלת-מימד בהידרוג קולגן

  1. מניחים מספר צלחות סטרילי 4-היטב של התרבות במכסה הזרימה למינארי ולהכין שילוב קולגן עבודה כפי שצוין בעבר בשלבים 1.12.2-1.12.6.
  2. מקום 15-20 μL של תערובת הידרוג'ל לתוך החלק התחתון של באר לייצר בסיס קולגן מעגלי. חזור על שלב זה עבור שאר הבארות. אין להכין יותר מחמישה צלחות באותו זמן כדי למנוע התאיידות נוזלית מוגזמת מבסיס ההידרוג'ל.
  3. שמור את הכלים בחממה עד הגלציה המלאה (± 15-20 דקות) הוא נצפתה ולקחת את הצלחות מתוך החממה רק כאשר השלמת הגלוציה. בדוק את האיכות של הקולגן ג.
  4. העבר חתיכה קטנה של תא COS1 לצבור עם פיפטה. מניחים אותו על בסיס הידרוג'ל ומניחים פיסת רקמות על אותו בסיס עם פיפטה קרוב לפיסת התאים המצטבר בגודל אחד.
  5. להכין תערובת קולגן עבודה חדשה על הקרח כמו בשלבים 1.12.2-1.12.6.
  6. בעדינות פיפטה 15-20 μL של תערובת חדשה זו ולכסות את הסיכום ואת הצבירה של התא. תרבות הידרוג'ל כמו סנדוויץ ' יהיה נצפתה. ברגע זה, re-להתמצא ההסבר עם מחט טונגסטן קנס (לא לגעת הצבירה תא COS1!), כך הוא פונה לצבור תאים ב ± 500-600 μm.
  7. החזר את הצלחת אל החממה עד הגלוציה נצפתה (± 10-15 דקות), ו 0.5 mL של NCM מלאה שיושלם עם 2% B27 תוספת ולשמור על תרבויות עבור 36 כדי 48 h בחממה (37 ° c, 5% CO2).

5. קיבעון של הבדיקה-תאים מצטברים ושיתוף תרבויות והליך אימונוציטוטוכימיה

  1. לאחר 36-48 h של דגירה, להסיר את המדיום לשטוף עם 0.1 M פוספט באגירה מלוחים (PBS), pH 7.3. לאחר מכן, לתקן את התרבויות עבור 1 h עם 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 M פוספט מאגר (PB), pH 7.3, ב 4 ° c.
  2. הסר את הקבע ולשטוף בעדינות את התרבויות 3-4 פעמים (10-15 דקות כל אחד) ב 0.1 M PB, pH 7.3.
  3. נתק את כריך ההידרוג'ל מהחלק התחתון של הבאר עם מרית או מלקחיים. להעביר את לחסום קולגן עם מכחול עדין לצלחת 6-היטב התרבות המכילה 0.1 M PBS עם 0.5% כביסה לא יונית.
  4. דגירה חינם-הידרוטים צף בפתרון חסימה (10% סרום, 0.5% שאינם יוניים, ו 0.2% ג'לטין ב 0.1 M PBS) עבור 2-3 h ב RT עם עצבנות עדינה.
  5. לשטוף 3 פעמים (10-15 דקות כל אחד) עם 0.1 M PBS המכיל 0.5% לא-יוני החומרים.
  6. דגירה עם הנוגדן העיקרי מדולל ב-PBS המכיל 5% סרום, 0.5% non-החומרים הבלתי יוניים, 0.2% ג'לטין, ו 0.02% נתרן azide. דגירה עם הנוגדן העיקרי עבור 36-48 h ב 4 ° c על שייקר.
    הערה: בדרך כלל נוגדן נגד הכיתה III β-טובולין (α-tuj-1) (מדולל 1:2000) משמש כדי להגדיר צמיחה סיבי בתרבויות תלת-ממד הידרוג'ל.
  7. לאחר הדגירה, לשטוף כמו בשלב 5.5.
  8. דגירה עם נוגדן משני עבור 4 h ב RT (או 6-7 h ב 4 ° c) על שייקר מדולל ב 5% סרום, 0.5% לא-יוני החומרים, ו 0.2% ג'לטין. נוגדן ביולוגי נגד עכברים נגד העכבר (מדולל 1:200) משמש בניסוי זה.
  9. לשטוף את התרבויות כמו ב 5.5.
  10. מודלת את התרבויות במשך יומיים ב -4 ° צ' עם מורכבות avidin-biotin (ABC) פתרון 1:100 מדולל ב-PBS המכיל 5% סרום, 0.5% non-החומר הבלתי יוני, ו 0.2% ג'לטין. לחילופין, השתמש חזרת peroxidase (HRP)-מתויג streptavidin (מדולל 1:300-400) באותו מאגר.
  11. לשטוף את התרבויות כמתואר ב 5.5.
  12. לשטוף את התרבויות מספר פעמים עם 0.1 M טריס-HCl מאגר, pH 7.6 עבור 1 h.
  13. מודטה את התרבויות עם 0.03% של 3, 3 ′-Diaminobenzidine (בתוספת) פתרון ב 0.1 M טריס-HCl, pH 7.6.
  14. הוסף 5-8 μL של 1% H2O2 והמתן 10-15 דקות. לנטר את ההתפתחות של הטיפה תחת מיקרוסקופ באמצעות מטרה 4-10x.
  15. להפסיק את התגובה על ידי הסרת פתרון באמצעות 0.1 M טריס-HCl מאגר, pH 7.6.
  16. שטפו את התרבויות ב-PBS במשך 30 דקות (מספר שינויים).
  17. הר את ההידרוג על שקופיות זכוכית באמצעות מימית מבוסס הרכבה מדיה.
  18. לנתח את האורך וההפצה של האקסונים בתוך ההידרוג'ל באמצעות יישום plug-in של שולבה או עם תוסף NeuriteJ לתוכנת ImageJ30.

תוצאות

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה נגישה נרחב לחקר הצמיחה סיבי בתרבויות קולגן הידרוג'ל תלת ממדי של מערכת העצבים עכבר עובריים. למטרה זו, אנו מבודדים קולגן מזנבות עכברוש למבוגרים כדי ליצור מטריצות תלת-ממד שבו אנו מתורבתים מהונדסים גנטית אגרגטים תאים המבטא Netrin-1 או Sema3E התעמת עם רקמת עצבי עובריים (למש?...

Discussion

צמיחת האקסונים המתפתחים היא פולשנית בעיקר וכוללת השפלה ושיפוץ ECM. באמצעות ההליך המוצג כאן, החוקרים יכולים להשיג מטריקס תלת-ממד הומוגנית שנוצר על ידי סוג טבעי אני קולגן שבו אקסונים (או תאים) יכול להגיב מעבר הדרגתי כימי מופרש על ידי תאים גנטית שונה כפי שהם עושים ב vivo. תגובות סיבי שונות מעברי צ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים מודים לטום יוחנן על עצת המערכת ומסיה סגורה-פליקס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו ממומנת על ידי תוכנית CERCA ועל ידי הנציבות עבור אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה לחדשנות, אוניברסיטאות, וארגון של הגנרל לטאת דה קטלוניה (SGR2017-648). עבודה זו מומן על ידי משרד הספרדית של מחקר, חדשנות ואוניברסיטת (MEICO) דרך BFU2015-67777-R ו RTI2018-099773-B-100, הספרדי Prion הרשת (Prion ספרד AGL2017-90665-REDT), ואת המכון קרלוס השלישי, CIBERNED ( חטט-2018-2).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)SigmaD5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 serum-free supplement 50x Invitrogen17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kitPierce23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell linesATTCCRL-1570
D-(+)-GlucoseSigma16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal mediumSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture mediumInvitrogen41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for culturesInvitrogen14200
Ethanol merck108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)SigmaE5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)Electron Microscopy Sciences (EMS)17984-25
Gelatin powder SigmaG1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)Panreac211008
Hank’s balanced salt solution Invitrogen24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum Invitrogen10108-165
Heat-inactivated horse serum Invitrogen26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)Sigma316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 mediumInvitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 ReagentInvitrogen11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 supplement 100x Invitrogen17502-048
Neurobasal medium Invitrogen21103049
ParaformaldehydeMerck1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x Invitrogen15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistryInvitrogenAM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse Vector LabsBA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Sodium azide Panreac162712
Sodium bicarbonate solution 7.5% Invitrogen25080-094
Sterile culture grade H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 SigmaX100
Trizma base SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes Corning or similar
2 haemostats  Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissorsFine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugationNalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates Nunc176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes.Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors)Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membraneSigmaD9402
Dialysis tubing closures SigmaZ37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes Nunc 150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin barsIKA or similar
McIlwain tissue chopperMickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue piecesFine tools Instruments or similar

References

  1. Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1483 Dchemorepulsion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved