نموذج الفئران الرواية والترجمة من ارتجاج الجمع بين القوة والتناوب مع في فيفو الدماغ غسيل الكلى

Summary

تغيير الناقل العصبي هو آلية الخلل العصبي الذي يحدث بعد الارتجاج ويسهم في العواقب على المدى الطويل كارثية في بعض الأحيان. هذا النموذج الفئران يجمع بين غسيل الكلى، مما يسمح في الجسم الحي كمية الناقل العصبي، مع تقنية انخفاض الوزن ممارسة التسارع السريع والتباطؤ في الرأس والجذع، وهو عامل مهم من الصدمة الدماغية البشرية.

Abstract

الأعراض المعرفية والحركية المستمرة هي عواقب معروفة للارتجاجات / إصابات الدماغ الصادمة الخفيفة (mTBIs) التي يمكن أن تعزى جزئيا إلى تغير انتقال الأعصاب. في الواقع، أظهرت دراسات غسيل الكلى الدماغي في القوارض الإفراج المفرط خارج الخلايا الغلوتامات في الحصين في غضون 10 دقيقة الأولى بعد الصدمة. يوفر غسيل الكلى الدقيق ميزة واضحة في أخذ العينات المستمرة للناقل العصبي في الجسم الحي مع عدم الحاجة إلى التضحية بالحيوان. وبالإضافة إلى التقنية المذكورة أعلاه، هناك حاجة إلى نموذج مغلق لإصابة الرأس الذي يمارس التسارع السريع والتباطؤ في الرأس والجذع، لأن هذا العامل غير متوفر في العديد من النماذج الحيوانية الأخرى. نموذج ولاية واين انخفاض الوزن يحاكي هذا العنصر الأساسي من الصدمة الدماغية القحفية البشرية، مما يسمح بتحريض تأثير على رأس القوارض غير المقيدة مع انخفاض الوزن. لدينا رواية ونموذج الفئران الترجمة يجمع بين غسيل الكلى الدماغي مع نموذج ولاية واين إسقاط الوزن لدراسة, في الفئران الكبار التخدير طفيفة وغير المقيدة, التغيرات الحادة في مستويات العصبي خارج الخلية بعد ارتجاج. في هذا البروتوكول، تم إدخال مسبار غسيل الكلى الدقيق داخل الحصين كمنطقة ذات أهمية، وترك إدراجها في الدماغ عند الارتطام. هناك كثافة عالية من المحطات والمستقبلات في الحصين، مما يجعلها منطقة ذات صلة لتوثيق انتقال الأعصاب المتغيرة بعد ارتجاج. عند تطبيقها على الفئران Sprague-Dawley الكبار, لدينا نموذج مجتمعة الزيادات الناجمة عن تركيزات الغلوتامات خارج الخلية فرس النهر في غضون 10 دقيقة الأولى, بما يتفق مع أعراض ما بعد الارتجاج التي تم الإبلاغ عنها سابقا. يوفر هذا النموذج المشترك لإسقاط الوزن أداة موثوقة للباحثين لدراسة الاستجابات العلاجية المبكرة للارتجاجات بالإضافة إلى إصابات الدماغ المتكررة، لأن هذا البروتوكول يحفز على صدمة خفيفة في الرأس المغلق.

Introduction

والغرض من هذه الطريقة هو تزويد الباحثين بأداة موثوقة تستنسخ بأمانة الميكانيكا الحيوية للصدمات الدماغية القحفية البشرية مع السماح بالتوصيف الطولي للآثار الجزيئية للارتجاجات/الدماغ الصادم الخفيف الإصابة (mTBIs). تجمع هذه الطريقة بين غسيل الكلى الدماغي مع نموذج انخفاض الوزن في ولاية واين لتوثيق، في الفئران الكبار المُسِنة وغير المقيدة، والتغيرات الحادة في مستويات العصبي خارج الخلية بعد الارتجاج. مع هذا الأسلوب طفيفة التوغل, الناقلات العصبية مثل الغلوتامات, GABA, تورين, الجلايسين وسيرين يمكن أن تكون كمية بسرعة وباستمرار بعد الصدمة, في الجسم الحي, في حين لا تضطر إلى التضحية الحيوان.

الارتجاج/mTBI هو اضطراب فيفولوجيا ً باثولوجية يؤثر على أداء الدماغ الناجم عن آلية قوة خارجية. ارتجاج / mTBI هو الشكل الأكثر شيوعا من إصابات الدماغ الصادمة، مما يمثل 70-90٪ من الحالات¹. معظم الاختلالات الوظيفية الحادة بعد ارتجاج يمكن أن يعزى إلى إصابة الدماغ الأولية والثانوية^2،3: (1) يتم تسبب إصابة الدماغ الأولية عن طريق التسارع السريع وتباطؤ الرأس والجذع الذي يضر أنسجة الدماغ عن طريق الضغط تليها تمتد وقص المحاور خلال رد فعل^{عنيف 4و5}و⁶ و (2) إصابة الدماغ الثانوية هي الاستجابة الخلوية غير المباشرة للصدمة. يحدث بعد ساعات وأيام من إصابة الدماغ الأولية ويلعب دورا هاما في ضعف المحرك والإدراك لوحظ مع مرور الوقت. العديد من الأعراض يمكن أن تعزى إلى تغيير انتقال الأعصاب مثل الإفراج عن الغلوتامات خارج الخلية المفرطة أظهرت سابقا في أول 10 دقيقة بعد الإصابة^7,8,9. وبالنظر إلى كثافة عالية من المحطات والمستقبلات، والحصين هو بنية الدماغ عرضة بشكل خاص لهذه الاستجابة السامة بعد الإصابة. المشاركة بشكل كبير في الوظيفة المعرفية^10,11, ذكرت الدراسات في القوارض أن تلف فرس النهر المرتبطة بالارتجاج يمكن أن يؤدي إلى العاهات في تكييف الخوف وتعلم الذاكرة المكانية^{12 , 13-}وكان الهدف الرئيسي من هذه المنهجية هو وضع نموذج للجرذان من الارتجاج/الـ mTBI، باستخدام إجراء إسقاط وزن الرأس المغلق في ولاية واين لإعادة إنتاج آليات الإصابة الأولية في الدماغ بأمانة، وإدراج الدماغ غسيل الكلى الدقيق للدراسة في الجسم الحي، والتغيرات العصبية خارج الخلية الحادة بسبب إصابة الدماغ الثانوية بعد ارتجاج. تم قياس تركيزات الغلوتامات خارج الخلية وGABA في الحصين لتكون بمثابة نتائج تمثيلية لأسلوبنا.

وقد جمعت الدراسات السابقة القوارض غسيل الكلى المجهري ونماذج أخرى من الإصابة، مثل انخفاض وزن الجمجمة المفتوحة وتأثير القشرية التي تسيطر عليها، لإثبات التغيرات الحادة في مستويات الناقل العصبي خارج الخلية بعد إصابة متفاوتة الخطورة درجات^{14،15،16،17}. ومع ذلك، بالإضافة إلى درجات عالية من التباين، والقيمة المترجمة لنماذج مثل انخفاض الوزن الجمجمة المفتوحة وتأثير القشرية التي تسيطر عليها يعوقها نقص متأصل في الصلاحية الإيكولوجية بسبب عاملين: (1) هذه النماذج تسبب إصابات كثيرا أكثر شدة من الارتجاجات المتصلة بالرياضة التي يعاني منها في البشر، والتي تنطوي على تحميل الدماغ مباشرة و (2) هذه النماذج تتطلب استئصال الجمجمة أو استئصال الجمجمة، رئيس القوارض يجري تقييدها تماما في إطار مجسم، وعرقلة السريع تسارع وتباطؤ الرأس والجذع، وبالتالي استنساخ سيئة الميكانيكا الحيوية للارتجاج.

غسيل الكلى الدقيق هو طريقة طفيفة التوغل التي توفر ميزة واضحة لأخذ العينات العصبية مثل الغلوتامات, GABA, التورين, الجلايسين وسيرين, في الجسم الحي وباستمرار بعد الصدمة, في حين لا تضطر إلى التضحية الحيوان. بالإضافة إلى المزايا التي تقدمها غسيل الكلى الدقيق، وضعت جامعة ولاية واين نموذج إسقاط الوزن الجمجمة المغلقة (بدلا من الجمجمة المفتوحة من نماذج أخرى)، والذي يسمح بتحريض mTBI على القوارض التخدير طفيفة وغير المقيدة، مما يسمح للتسارع السريع والتباطؤ في الرأس والجذع¹⁸. كما ذكر سابقا، تسارع وتباطؤ الرأس والجذع هو سمة حيوية أساسية من الارتجاجات المتصلة بالرياضة ينظر إليها في البشر أن نماذج mTBI القوارض السابقة فشلت في التصدي. يمكن إجراء عملية إسقاط الوزن بسرعة كبيرة ولا يتطلب أي جراحة مسبقة أو شق فروة الرأس. بعد الحث على الارتجاج ، تستعيد القوارض رد الفعل الصحيح بشكل عفوي تقريبًا ولا تعاني من الشلل أو النوبات أو الضائقة التنفسية بعد تأثير واحد. النزيف داخل الجمجمة وكسور الجمجمة نادرة، ولم يتم الإبلاغ إلا عن حالات عجز طفيفة في التنسيق الحركي في القوارض. هذا النموذج الفئران هو سهل الاستخدام, غير مكلفة ويسهل التحديد الكمي للناقلات العصبية الصادرة في المرحلة الحادة بعد ارتجاج دون إزالة التحقيق غسيل الكلى خلال التأثير.

نموذج الفئران لدينا الجمع بين غسيل الكلى الجزئي والارتجاج هو مناسب للباحثين الذين يسعون إلى توصيف الآثار الجزيئية للارتجاج طوليا ويمكن استخدامها في مجموعة واسعة من الدراسات العلاجية. في الواقع، على الرغم من عدة سنوات من البحوث والحاجة الماسة، لم يمر أي دواء لمنع الآثار الطويلة الأجل للارتجاج المرحلة التجريبية السريرية¹⁹. ويمكن أن يكون أحد الأسباب المحتملة لهذه الإخفاقات هو استخدام النماذج الحيوانية التي لا تستنسخ بأمانة القوى البيوميكانيكية الصادمة للارتجاجات كما يعاني منها البشر. الطريقة المعروضة هنا تفي بتعريف الارتجاجات البشرية التي تحدد أن إصابة الدماغ الأولية ناجمة عن تأثير حاد وكذلك تسارع سريع وتباطؤ في الرأس والجذع^2و3.

وعلاوة على ذلك، لدينا نموذج مجتمعة مناسبة للباحثين دراسة آثار إصابات الدماغ خفيفة خفيفة المتكررة (rmTBI) منذ واحدة من خصائصه الرئيسية التي تميزه عن النماذج الحيوانية الأخرى من ارتجاج هو أنه يجعل من الممكن للحث المتكررة ، وإصابات خفيفة لنفس الحالة¹⁸. في البشر، ويرتبط rmTBI مع أعراض أكثر شدة ما بعد الصدمة، وأطول أوقات الانتعاش، وتفاقم العاهات الحركية والمعرفية التي تميل إلى الانتشار مع مرور الوقت^20،21. كما جعلت النماذج الحيوانية الأخرى ذات الصلة من الممكن فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية ما بعد الصدمة من rmTBI^{22،23،24،25،26،27} . وقد ثبت زيادة ضعف الدماغ في القوارض بعد ما لا يقل عن 5 mTBI في فترات 24 ساعة. التهاب الأعصاب يزيد مع عدد من mTBI من ذوي الخبرة وعلامات التنكّن العصبي تظهر²⁸. ومن شأن تكرار mTBI منع انتقال microglia من وضع proinflammatory إلى وضع طبيعي للانتعاش، مما أدى إلى نشاط السمية المنفعلة لفترات طويلة وتفعيل الآليات العصبية ²⁹. مع نموذجنا، يمكن أن تتعرض الفئران لتأثير 1 يوميا على مدى فترة أسبوع واحد لما مجموعه 5 التعرض. وبالنظر إلى بساطة هذا النموذج الحيواني، فإنه يمكن أن يسهل توصيف الآثار التراكمية لإطلاق الناقل العصبي العشوائي الحاد التي تنشأ مباشرة بعد mTBI.

هذا النموذج يسمح أيضا الحيوانات أن تتعرض بسهولة إلى 2 آثار في اليوم الواحد, مما يجعل من الممكن لدراسة ظروف أكثر شدة مثل عندما يتلقى رياضي تأثير صدمة أخرى في غضون وقت قصير من الضربة الأولى³⁰. كما هو مبين في دراسة سابقة³¹، توقيت ضربة ثانية على الرأس يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الأوعية الدموية وتلف axonal. كلما اقتربت الضربة الثانية من الضربة الأولى، كلما كانت العواقب أكثر ضرراً. هذا النموذج مناسب للتحقيق في كيفية تأثير هذه الحالة بالذات على الإفراج عن ناقل عصبي خارج الخلية.

في هذه الطريقة، تم استخدام الحصين كمنطقة ذات أهمية بسبب أهميتها في أبحاث الارتجاج ولكن يمكن جمع عينات غسيل الكلى الدقيقة من مناطق أخرى ذات أهمية أيضا. ومع ذلك، فإن أي منطقة دماغ أخرى يجب أن تؤخذ في الاعتبار بسبب المساحة التي خلفها موقع الارتطام من قنية الدليل، بما في ذلك الأسمنت الأسنان المحيط به، يمكن أن يستغرق مساحة كبيرة على رأس الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل معلمات غسيل الكلى الدقيقة المعروضة في هذه الطريقة مثل قطع الوزن الجزيئي للغشاء وطول هائجه النشط، والفواصل الزمنية لأخذ العينات ومعدل التدفق وفقا لنوع الجزيء الذي تمت دراسته. على سبيل المثال، تتطلب المجموعة الفعالة من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات المشاركة في الارتجاجات غشاء ًا بحجم مسام أكبر بكثير.

Protocol

وحصل البروتوكول الحيواني لهذا المشروع على موافقة لجنة رعاية الحيوانات التابعة للجنة العناية بالحيوان في مركز مونتريال للصحة الحيوانية امتثالا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوانات.

ملاحظة: يرد في الشكل 1مخطط تخطيطي لبروتوكول البحث .

1. إعداد الحيوانات

1. طلب الفئران سبراغ-دولي من مورد الحيوانات مختبر القياسية ليتم تسليمها بين 43 و 50 يوما من العمر وعلى وزن بين 151 و 200 غرام.
2. منزل جميع الفئران بشكل فردي في دورة من 12:12 ح الضوء: الظلام، في 24-26 درجة مئوية مع إعلان libitum الوصول إلى الماء والغذاء.
3. خلال 2 أسابيع قبل بدء البروتوكول، والتعامل مع الفئران لمدة 5 دقائق على أساس يومي لتسهيل سكنهم في اتصال مع الباحثين. يجب أن يكون عمر الفئران حوالي 10 أسابيع من العمر وينبغي أن يكون وزنها بين 295 و 351 غرام في وقت الارتجاج أو تحريض الإصابة الشامية.

2. جراحة زرع قنية دليل غسيل الكلى المجهري

1. إجراء الجراحة في ظروف معقمة. ارتداء قفازات معقمة، غطاء محرك السيارة الشعر وقناع الجراحية طوال العملية. الأوتوكلاف وتعقيم جميع المواد والأدوات الجراحية مسبقا. تنظيف وتطهير منطقة العمل وجهاز stereotaxic تماما مع حل الإيثانول (70٪).
2. التخدير الحيوانات عن طريق حقن كوكتيل من الكيتامين (70 ملغ / كغ) وxylazine (10 ملغ / كغ) داخل اقابي. الحمير عمق التخدير عن طريق اختبار رد الفعل إلى قرصة اصبع القدم.
3. إزالة الفراء من رأس الحيوان باستخدام المقصات الكهربائية. تنظيف حليق الرأس باستخدام حل من الكحول ايزوبروبيل 2٪ و 2٪ كلورهيكسيدين غلوكونات (3 مرات). تطبيق مرهم العين التشحيم أثناء التخدير لمنع الجفاف.
4. الستائر قبالة المجال الجراحي بحيث يتعرض فقط رأس الحيوان. وضع رأس الفئران في جهاز مجسم، إدراج قضبان الأذن في قنوات الأذن بعناية كبيرة ثم تشديد المشبك الأنف. إصلاح 26 G الفولاذ المقاوم للصدأ دليل قنية إلى ذراع حامل على جهاز stereotaxic.
5. حقن محليا كوكتيل مخدر من bupivacaine (1.5 ملغ / كغ) وليدوكاين (1.5 ملغ / كغ) تحت الجلد على الرأس، 10 دقيقة قبل شق.
6. الحفاظ على التخدير خلال العملية برمتها عن طريق تقديم إيسوفلوران الصوديوم (2.5٪) في 0.5 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين مع مخروط الأنف.
7. قم بعمل شق خط الوسط (3 سم) على طول فروة الرأس مع مشرط. اترك الجمجمة واضحة عن طريق تركيب 4 المشابك حول الشق.
8. كشط بحزم periosteum من الجمجمة مع شفرة الجراحية حتى الغرز Bregma ولامدا مرئية. الحفاظ على ضغط ثابت على الجمجمة مع وسادة الشاش أو القطن يميل قضيب إذا كان هناك نزيف.
9. تأكد مما إذا كانت الجمجمة متوائمة بشكل صحيح على جهاز الاستريوتاكسي عن طريق مقارنة إحداثيات dorsoventral من الغرز Bregma و Lambda. تحديد الإحداثيات الخلفية والجانبية والظهرية لخياطة بريغا كنقاط مرجعية لإحداثيات قنية الدليل.
10. أخذ إحداثيات خياطة Bregma كمراجع، وحساب إحداثيات موقع زرع قنية دليل في الحصين.
    ملاحظة: حدّدت الإحداثيات تالي كان وفقا ل الفأرة دماغ أطلس من [بكسنوس] وواطسون ([أنتيرووإكسبر]: -0.60 [كم]; [ميديولتر]: ±0.58 [كم]; [دورسوفونورل]: -0.16 [كم], شكل 2[أ])³².
11. وضع علامة على موقع الزرع الدقيق باستخدام علامة.
12. حفر ثقب 0.5 ملم من خلال الجمجمة في الموقع المستهدف من قنية دليل. حفر 3 ثقوب أخرى ما يقرب من 5 ملم حول هذه النقطة إلى خيوط 3 مسامير مرساة في الجمجمة التي من شأنها ترسيخ قنية بعد تطبيق الاسمنت الأسنان الاكريليك.
13. أدخلي القنية في الحصين وأصلحها بأسمنت الأسنان. سيتم استخدام هذه القنية لإدخال التحقيق في المنطقة ذات الأهمية بعد 7 أيام خلال إجراء غسيل الكلى. كن حذرا ً لعدم سكب الأسمنت الزائد على الأسنان حول الموقع حيث سيتم إسقاط الوزن.
14. اترك الأسمنت ليجف لمدة دقيقتين، ثم قم بإزالة ذراع الحامل من القنية. أدخل جهاز obturator قابل للإزالة من الفولاذ المقاوم للصدأ في القنية لتجنب تسرب السائل النخاعي ومخاطر العدوى.
15. إزالة المشابك 4، وسحب الجلد تراجع وغرزة مع خيط خياطة الجراحية 4-0.
16. إزالة الفئران من الجهاز وحقن البوبرينورفين تحت الجلد لعلاج الألم (0.05 ملغ / كغ، بعد الجراحة ثم مرة واحدة في اليوم خلال اليومين التاليين). وضع القوارض مرة أخرى في قفصها مع وسادة التدفئة تحت حتى يصبح واعيا، ثم إعادته إلى مرفق رعاية الحيوان لمدة 7 أيام فترة الانتعاش تحت مراقبة وثيقة.

3. إجراء غسيل الكلى الدقيق

1. أثناء إجراء إجراء غسيل الكلى الدقيق، ارتداء قفازات معقمة، غطاء محرك السيارة الشعر وقناع الجراحية. بعد سبعة أيام من جراحة زرع قنية، التخدير الفئران مع إيزوفيلوران الصوديوم (2.5٪) في 0.5 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين.
2. إزالة obturator من قنية وإدراج ببطء مسبار غسيل الكلى، وغرست مع السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) (26 مليمول / لتر NaHCO_3،3 مليمول / لتر NaH₂PO_4،1.3 مليمول / لتر ملغ كل_2،2.3 مليمول / لتر كاليفورنيا_2،3.0 مليمول / L ككل، 126 مليمول / لتر نسك، 0.2 مليمول / L L-حمض الاسكوربيك)، من خلال قنية في الحصين أو منطقة أخرى من الفائدة.
   ملاحظة: الفئران تحتاج إلى التخدير فقط أثناء إزالة obturator وإدراج التحقيق غسيل الكلى، وأثناء الحث على ارتجاج أو إصابة وهمية. المسبارات المستخدمة هنا هي مختبرية شيدت، على شكل حرف I، وتتألف من خطوط مدخل السيليكا المنصهرجنبا إلى جنب [القطر الداخلي (ID): 50 ميكرومتر] مغلفة في أنابيب البولي ايثيلين (ID: 0.58-0.38 مم). يتم تأمين نهاية قنية مع طول غشاء السليلوز جوفاء مجدد [قطع الوزن الجزيئي: 13 kDa, القطر الخارجي (OD): 216 ميكرومتر; ID: 200 μm] باستخدام لاصق سيانوكريلات وطرف مختومة مع الايبوكسي. يقيس الغشاء النشط 2.5 مم للزرع في الحصين ولكن يمكن تعديله وفقًا لعمق المنطقة ذات الاهتمام. يتم تأمين اتصال قنية السكن من الفئران إلى التحقيق مع المجهزة، مترابطة طوق الفولاذ المقاوم للصدأ.
3. إصلاح الجمعية التحقيق إلى ربيع الفولاذ المقاوم للصدأ المربوطة إلى قطب السائل وذراع رافعة موازنة علقت فوق القفص مع موقف حلقة والمشابك بحيث يمكن للحيواني التحرك بحرية داخل قفصه. الفئران المربوطة تنفق كامل مدة إجراء غسيل الكلى مع ad libitum الوصول إلى الماء والغذاء.
4. استخدام مضخة التسريب الدقيق لإرسال perfusate إلى تحقيقات، وجمع dialysate من خط منفذ السيليكا تنصهر (حجم ميت: 0.79 درجة مئوية).
5. على الأقل 1 ساعة و 30 دقيقة قبل بدء الإجراء، بدوره حتى التحقيق إلى معدل تدفق العمل (1 درجة مئوية / دقيقة). تحقق من أن معدل تدفق المسبار متسق عن طريق قياس الحجم مع مرور الوقت باستخدام ماصة.
   ملاحظة: يمكن أن يكون معدل التدفق أكثر أو أقل اعتمادا على الناقلات العصبية عينات ومنطقة الدماغ من الفائدة. تؤخذ عينات غسيل الكلى قبل وأثناء وبعد الارتجاج أو تحريض الإصابة الشامية. الفاصل الزمني لأخذ العينات يعتمد على منطقة الدماغ ذات الاهتمام، والناقلات العصبية التي يجري تحليلها، وتركيزات الأناليت، وحساسية معدات الكيمياء التحليلية المستخدمة. مراحل جمع القيام به هنا في الحصين لأخذ العينات الغلوتامات وGABA هي كما يلي:
   1. خط الأساس: في بداية التجربة، وجمع عينات غسيل الكلى في 10 فترات دقيقة لمدة 60 دقيقة.
   2. بعد الارتجاج أو الإصابة الشام: بعد ارتجاج أو إصابة وهمية، وجمع عينات لمدة 90 دقيقة إضافية (9 عينات).
6. جمع كل عينة dialysate في قارورة كسر محملة مسبقا مع 1 ميكرولتر من 0.25 مول / لتر حمض البيركلوريك لمنع تدهور analyte. تخزين العينات في 4 درجة مئوية لتحليللاحق.
7. بعد جمع عينة الدياليسات الأخيرة، إعادة التخدير الفئران مع مخروط الأنف تسليم isoflurane الصوديوم (2.5٪) في 0.5 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين.
8. إزالة مسبار غسيل الكلى الدقيق من قنية، وإعادة إدراج obturator ومن ثم إعادة الفئران إلى مرفق رعاية الحيوان.

4. تركيب جهاز الارتجاج

1. قبل بدء الإجراء، نحت الوزن لاستخدامها في إلحاق ارتجاج (19 ملم في القطر) من النحاس الصلب للحصول على كتلة من 450 غرام إدراج حلقة معدنية في الجزء العلوي من الوزن النحاسي. حفر ثقوب الأولية على مسافة 1.0 متر داخل عمودي بولي فينيل كلوريد (PVC) دليل أنبوب.
2. شق ورقة الألومنيوم مع شفرة الحلاقة حادة. يجب أن تدعم ورقة الألومنيوم المشقوق وزن الفئران (295 إلى 351 غرام) دون التدخل في تسارع جسدها بعد تأثير الرأس من الوزن النحاسي.
3. قم بلصق ورقة الألومنيوم المشقوقة بإحكام على إطار زجاج شبكي على شكل حرف U (38 سم بطول × 27 سم بعرض × 30 سم، الشكل 3A،B)الذي يحتوي على وسادة رغوة (37 سم طويلة × 26 سم واسعة × 12 سم عميق).
4. ضع إطار زجاج شبكي تحت أنبوب دليل بولي كلوريد الفينيل (قطر20 مم × 1.5 م طول).
5. عقد أنبوب دليل PVC في مكان مع موقف المشبك 3.5 سم فوق الألومنيوم مشقوق.
6. إرفاق خط الصيد يطير النايلون (قدرة 9.1 كجم، 0.46 مم قطرها) من خلال حلقة معدنية بحيث الجزء السفلي من الوزن معلقة 2.5 سم على الألومنيوم مشقوق لمنع يضرب متعددة عندما يسقط الفئران على وسادة رغوة بعد تأثير.
7. إرفاق النايلون يطير خط الصيد إلى موقف المشبك.
8. سحب ما يصل الوزن من خلال أنبوب PVC مع النايلون يطير خط الصيد ثم يبقيه في مكانه عن طريق إدراج مفتاح عرافة من خلال الثقوب حفر الأولية في 1.0 م.

5. ارتجاج التعريفي

1. بعد المرحلة الأساسية لجمع عينات غسيل الكلى، إعادة التخدير الفئران طفيفة عن طريق وضع مخروط الأنف تسليم isoflurane الصوديوم (2.5٪ isoflurane في 0.5 L / دقيقة تدفق الأكسجين) حتى أنه لا استجابة لقرصة اصبع القدم (كما هو مذكور في القسم 3.1).
2. وضع الحيوان على صدره على ورقة الألومنيوم مشقوق بحيث يتم وضع رأسه مباشرة في مسار الوزن النحاسي (الشكل3C،D). الحفاظ على التخدير مع مخروط الأنف للتأكد من أن الفئران لا تتحرك أو الاستيقاظ قبل أن يضرب الوزن عليه.
3. إزالة مخروط الأنف وسحب مفتاح عرافة. سوف يسقط الوزن عموديا من خلال أنبوب PVC وتؤثر على رأس الفئران. وسوف يخضع الجرذ لدوران سريع 180 درجة ويهبط على ظهره (الشكل3E).
4. إزالة الفئران من وسادة رغوة ووضعها على ظهرها في قفصها.
5. استخدم جهاز ضبط وقت رقمي لقياس وقت رد الفعل الصحيح كعلامة على الانتعاش وشدة الإصابة. الوقت المنعكس تصحيح هو الوقت الإجمالي من تأثير حتى القوارض يستيقظ وتلقائيا الحق أنفسهم إلى موقف عرضة من موقف supine، أو البدء في المشي. لاحظ أي علامات على الوفاة أو الكسر أو النزيف.
   ملاحظة: يمكن تكرار الإجراء في نفس الموضوع في نقاط زمنية مختلفة للارتجاجات المتكررة.

6. تعريف الشام

1. بعد المرحلة الأساسية لجمع عينات غسيل الكلى، إعادة التخدير الفئران طفيفة عن طريق وضع مخروط الأنف تسليم isoflurane الصوديوم (2.5٪) عند 0.5 لتر/دقيقة تدفق الأكسجين حتى لا يكون أي استجابة لقرصة اصبع القدم (كما هو مذكور في القسم 3.1).
2. وضع الحيوان على صدره على ورقة الألومنيوم مشقوق بحيث يضع رأسه مباشرة في مسار الوزن النحاسي. الحفاظ على التخدير مع مخروط الأنف للتأكد من أن الفئران لا تتحرك أو الاستيقاظ.
3. إزالة مخروط الأنف وإزالة الحيوان من ورقة الألومنيوم دون سحب مفتاح عرافة. لن يخضع الجرذ لدوران سريع بزاوية 180 درجة.
4. ضع الجرذ على ظهرها في قفصها
5. استخدام جهاز ضبط الوقت الرقمي لقياس الوقت المناسب كمؤشر لاستعادة العصبية.

7. عالية الأداء اللونية السائلة

1. تحديد مستويات الناقل العصبي (أي الغلوتامات وGABA) عن طريق اشتقاق ما قبل العمود باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء مع الكشف عن الفلورة فصل سريع، ونظام يتكون من autosampler فصل سريع ومضخة مقترنة إلى عمود تحليلي 3.0 × 50 مم 5 ميكرومتر.
2. إعداد مرحلة متنقلة مع 100 مليمول / لتر فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na₂HPO_4)،3.5٪ أسيتوتريل و 20٪ الميثانول. ضبط الحموضة إلى 6.7 مع حمض الفوسفوريك (85٪) حسب الحاجة.
3. تعيين معدل التدفق إلى 0.5 مل / دقيقة.
4. إعداد الكواشف والاشتقاق اتّعاقات يومية جديدة ومعايير عمل (100 نانوغرام/مل) من حلول الأسهم. قم بتحميلها في عينة تلقائية فصل سريع مبردة (10 درجة مئوية) مع عينات.
5. خلط كل كسر بالتتابع في العمود التحليلي مع 20 ميكرولتر من حمض 3-mercaptopropionic (0.071 مول / لتر) المخفف مع H₂O و 20 ميكرولتر من o-phthaldehyde (0.0143 مول / لتر) المخففة مع 0.1 مول / لتر تترابورات الصوديوم. السماح 10 دقيقة لهذا المزيج للرد.
6. لمنع تلوث العينات التالية، امسح حلقة الحقن بالميثانول (20٪)، بعد كل حقنة.
   ملاحظة: سيكون وقت الاحتفاظ بالغلوتامات من 1 دقيقة تقريبا في هذا البروتوكول، لإجمالي وقت التشغيل من 30 دقيقة لكل عينة.
7. أثناء تحليل القمم الكروماتوغرافية، حدد قمم غير معروفة باستخدام عينات مطابقة وفقاً لوقت الاحتفاظ بالمعايير المعروفة. مستويات صريحة من analytes كما μg / مل.

8. علم الأنسجة

1. بعد شهر من إجراء غسيل الكلى المجهري والارتجاج أو تحريض إصابة الشام، يتم التخدير للالحيوانات عن طريق حقن كوكتيل من الكيتامين (70 ملغم/كغم) والإكسيلازين (10 ملغم/كغم) داخل اقوابيها وإضفاء الطابع الرحيم عليها بواسطة البارافورمالهايد (4٪) والتسريب داخل القلب المالحة.
2. قطع رأس القوارض ثم تشريح العقول.
3. تخزين العقول في البارافورمالهايد (4٪) وبالتالي cryoprotect لهم في حل من السكروز (30٪).
4. شريحة العقول في أقسام الإكليل من 50 ميكرومتر مع cryostat.
5. وصمة عار شرائح الدماغ مع البنفسج الكسيل للتحقق النسيجي من الإصابة ووضع التحقيق (Nissl تلطيخ).

النتائج

باستخدام نموذجنا من الارتجاج الذي يجمع بين القوة والتناوب مع في الغسيل المجهري الدماغي في الجسم الحي، تم التحقيق في الغلوتامات خارج الخلية الحادة والتغييرات GABA مع مرور الوقت بعد ارتجاج أو إصابة وهمية في 21 الذكور، والكبار، والفئران سبراغ-دولي من قبل زرع قنية دليل في منطقة CA1 من الحصين.

التحقق النسيجي من وضع التحقيق والإصابة
لم يتم الإبلاغ عن أي تغييرات مورفولوجية مثل النزيف داخل الدماغ الهائل أو الكدمات بعد التحقق النسيجي من تلف أنسجة الحصين على أقسام ملطخة بالبنفسج الكريسل. دليل زرع قنية وmicrodialysis التحقيق الإدراج الناجمة عن الأضرار البسيطة والمماثلة بين الحالات المصابة والشام. وعلاوة على ذلك، لا إزالة التحقيق الحق قبل إصابة الشام أو ارتجاج التعريفي لم تسفر عن أي ضرر أنسجة الحصين مميزة كما رأينا تحت المجهر (الشكل2B،C، على التوالي)، مع غشاء التحقيق لا تزال سليمة بعد ذلك (الشكل2D،E). الارتجاج والدماغ إصابة الشام الممزوجة بالبارافورمالهايد (4٪) 1 شهر بعد إجراءات غسيل الكلى الدقيقة لا يمكن تمييزها عند التفتيش البصري (الشكل2F،G).

تصحيح الوقت المنعكس
الحيوانات من المجموعة المصابة كان لها زيادة كبيرة في وقت تصحيح في المتوسط مقابل حالات الشام (الطالب t-اختبار، ص = 0.042801) (الشكل4) وبدا مذهولا عند استعادة الوعي. ومن بين الحالات العشر من مجموعة الارتجاج، أظهر أحد الحيوانات علامات بسيطة على النزيف تحت موقع الارتطام بعد انخفاض الوزن. ولم تلاحظ أي علامات أخرى على كسر الجمجمة أو النزيف داخل الجمجمة.

في الجسم الحي المجهري الدماغي
لتكون بمثابة نتائج تمثيلية لطريقتنا، تم استخراج خمسة عشر عينة 10 ميكرولتر من الدياليسات، في الجسم الحي، على فترات من 10 دقيقة ومعدل تدفق 1 ميكرولتر / دقيقة. 60 دقيقة) ومن 9 عينات بعد تحريض من إصابة الشام أو ارتجاج (90 دقيقة).

تركيزات خارج الخلية من الغلوتامات
ولوحظت زيادات كبيرة في تركيزات الغلوتامات خارج الخلية في منطقة CA1 من الحصين خلال أول 10 دقائق بعد الحث على الصدمة مقارنة بالإصابةالشامية (Mann-Whitney U Test, p = 0.009175) (الشكل 5). ولم يلاحظ أي فرق آخر في تركيزات الغلوتامات بين المجموعات في أي نقطة زمنية أخرى.

تركيزات خارج الخلية من GABA
لم يلاحظ أي تغيير كبير في تركيزات GABA في منطقة CA1 من الحصين خلال أول 10 دقيقة بعد الحث على الصدمة مقارنة بإصابةالشام (مان ويتني U اختبار، ص = 0.943861) (الشكل 6). لم يكن هناك فرق كبير آخر في تركيزات GABA في أي نقطة زمنية أخرى بين حالات الارتجاج وحالات الإصابة الشامية.

الشكل 1: الخطوط العريضة التخطيطية لبروتوكول البحث. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التحقق النسيجي من موضع التحقيق والإصابة. (أ) عرض كورونا لمسبار غسيل الكلى الدقيق ودليل موقع وضع قنية في الحصين باستخدام أطلس مجسم من Paxinos وWatson. (ب) التصوير الضوئي التمثيلي لتلف أنسجة الحصين (البنفسج الكريسل) التي تنتجها مسبار غسيل الكلى الدقيق ودليل قنية من حالة إصابة وهمية. (C) التصوير الضوئي التمثيلي لتلف أنسجة الحصين (البنفسج الكريسل) التي تنتجها مسبار غسيل الكلى الدقيق ودليل قنية من حالة ارتجاج. (د) التصوير الضوئي التمثيلي لمسبار غسيل الكلى الدقيق قبل الحث على الارتجاج. (E) التصوير الضوئي التمثيلي لمسبار غسيل الكلى الدقيق بعد تحريض الارتجاج. الغشاء لا يزال سليما. (F-G). التصوير الضوئي التمثيلي للشام (F) والارتجاج (G) أصيب الدماغ بعد التسريب مع 4٪ بارافورمالدهايد في 1-شهر بعد إصابة الشام أو إجراء ارتجاج. عند الفحص البصري، العقول 2 لا يمكن تمييزها. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: جهاز الارتجاج وأدوات غسيل الكلى الدقيقة المكونات الأساسية تصوير. (أ) صورة للجمعية بأكملها تتألف من أنبوب دليل البولي فينيل عمودي (PVC) لسقوط الوزن تقع فوق مرحلة الفئران، إطار زجاج شبكي، وسادة رغوة، ومضخة التسريب الصغير التي تسيطر عليها الكمبيوتر، والمحاقن الغازية، السائل يدور، وجنبا إلى جنب تنصهر السيليكا مدخل منفذ خطوط. (B) التمثيل التخطيطي للإطار زجاج شبكي وسادة رغوة مع جميع الأبعاد ذات الصلة. (C) صورة للقطعة المشقوقة من رقائق الألومنيوم التي تعمل كمرحلة الفئران فوق وسادة الرغوة. (د) صورة تظهر وضع الجرذ على المسرح مباشرة قبل ارتطام الرأس بالوزن الهابط. (E) صورة تظهر الجرذ بعد ارتطام الرأس، توضح الدوران الأفقي 180 درجة لجسم الجرذ بعد ارتطام الرأس وما يترتب عليه من تسارع ودوران. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تصحيح الوقت. تمثيلات الرسم البياني للوقت الذي يستغرقه الفئران للاستيقاظ من التخدير والوجه من موقف supine إلى موقف عرضة أو البدء في المشي بعد ارتجاج (الماس الأحمر، ن = 10) أو إصابة الشام (المربعات الزرقاء، ن = 11). الفئران من مجموعة ارتجاج استغرق وقتا أطول بكثير لتصحيح أنفسهم بالمقارنة مع مجموعة إصابة وهمية. يتم تمثيل القيم المتوسطة كخط أفقي في كل رسم بياني. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تركيزات خارج الخلية من الغلوتامات. متوسط التركيزات خارج الخلية من الغلوتامات (ميكروغرام/ مل) تقاس بغسيل الكلى الدقيق في الحصين أثناء خط الأساس (60 دقيقة) وبعد الارتجاج (الماس الأحمر، ن = 10) أو إصابة الشام (المربعات الزرقاء، ن = 11) الظروف (90 دقيقة). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تركيزات خارج الخلية من GABA. متوسط تركيزات خارج الخلية من GABA (ميكروغرام / مل) تقاس عن طريق غسيل الكلى في الحصين خلال خط الأساس (60 دقيقة) وبعد ارتجاج (الماس الأحمر، ن = 10) أو إصابة الشام (المربعات الزرقاء، ن = 11) الظروف (90 دقيقة). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من IO Masse 2018. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
ولتوليد نتائج موثوقة، تتطلب الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول اهتماما خاصا. خلال جراحة زرع قنية، وتجنب استخدام المزيد من الاسمنت من الضروري، وخاصة عندما يكون السائل جدا لمنع تسرب فوق موقع الارتطام. لتجنب حجب موقع الزرع، استخدم مُعَلّبًا بنفس طول القنية. أثناء إجراء غسيل الكلى الدقيق، أدخل المسبار ببطء في القنية وتأكد من أنه يتم إدراجه بالكامل لأخذ العينات. قبل الحث ارتجاج، تأكد من أن ورقة الألومنيوم هو مشقوق بشكل صحيح مع شفرة الحلاقة حادة. خلاف ذلك، فإن تأثير من الوزن النحاسي لن تكون كافية لتمزيق ورقة الألومنيوم والفئران سوف تبقى الصدر إلى أسفل بدلا من الخضوع لدوران 180 درجة والهبوط على ظهره. إذا كان هذا هو الحال، فإن الإصابات الناجمة عن تأثير حادة، وليس على عكس ما ينظر إليه في نماذج انخفاض الوزن الجمجمة المفتوحة وتكون أكثر شدة بكثير. خلال تحريض ارتجاج، وتجنب التأثير على قنية مع الوزن لأن هذا من شأنه أن يولد ضررا بالغا في جمجمة الفئران. من المستحسن للغاية العمل في فرق من 2 لتقييد أخطاء التلاعب أثناء التجربة.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
خلال إجراء غسيل الكلى الدقيق، يجب أن يكون التدفق ثابتًا وينتج حجمًا مناسبًا لمعدل التسريب، بمجرد ربط المسبار بالمضخة. يمكن أن تشير أحجام أقل إلى وجود انسداد في غشاء التحقيق أو فقاعات الهواء في الخطوط. وفي حالة الانسداد، ينبغي التخلص من المسبار واستبداله. ومع ذلك، يمكن إخراج فقاعات الهواء عن طريق تعميم ACSF في الخطوط. إذا لم يكن هناك انسداد أو فقاعات الهواء لاحظت وليس هناك حتى الآن أي تدفق، يمكن خفض جزء صغير من أنبوب تدفق أقرب إلى النهاية.

قيود الأسلوب
وقد قيمت دراسات أخرى باستخدام جامعة ولاية واين انخفاض الوزن بعض التغييرات الهيكلية والجزيئية الأساسية¹⁸. غير أن إجراء تحقيق أوسع نطاقا من شأنه أن يحافظ على شرعية هذا الإجراء. ومن شأن المعلومات المتعلقة بالتغيرات البيولوجية والعصبية التشريحية التي تحدث على المستويين الجيني والخلوي أن تزيد من ترسيخ القيمة الموثوقة والترجمة لأسلوبنا. وعلاوة على ذلك، تقييم الوظيفة المعرفية هو مقياس موثوق به للنتائج المتعلقة mTBI في نماذج القوارض³³. في حين تم قياس الوقت إلى اليمين في هذا البروتوكول وتأخر كثيرا في الحالات المصابة بالمقارنة مع الحالات الشامية، ينبغي أن تركز الدراسات في المستقبل على قياس منهجي للوظيفة المعرفية بعد الحث على الصدمة في القوارض.

أهمية الأسلوب فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة.
الأهمية الرئيسية للطريقة ذات شقين: أولا، فإنه يسمح الحث الناجح للارتجاج مع إجراء جامعة ولاية واين، والذي يسمح بالتسارع السريع والتباطؤ في الرأس والجذع. وبهذه الطريقة، تم تجنب نتائج الإصابات الخطيرة مثل الاعتقالات القلبية التنفسية، وكسر الجمجمة، وارتفاع معدل الوفيات، وعلامات الكدمات الدماغية المرئية في موقع الارتطام. ثانيا، هذه التقنية microdialysis بنجاح تكرار أظهرت سابقا حادة وقصيرة الأجل الإفراج عن الغلوتامات خارج الخلية التي تجري في غضون 10 دقيقة الأولى بعد الحث الصدمة^14،16. وعلاوة على ذلك، فإن الحفاظ على التحقيق المدرج في جميع أنحاء الإجراء بأكمله يقلل بشكل كبير من احتمال إحداث ضرر لحاجز الدم في الدماغ الحساس ة والحساسة من قبل mTBI المرتبطة بإدراج مسبار غسيل الكلى المجهري المتكرر³⁴.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات للطريقة.
وبالنظر إلى الجوانب السهلة الاستخدام لإجراء تخفيض الوزن في جامعة ولاية واين والتغيرات الحادة في مستوى العصبيخارج الخلايا التي تقاس بغسيل الكلى الدقيق، فإن نموذج الفئران الذي يجمع بين غسيل الكلى الدقيق والارتجاج يوفر للباحثين مستوى موثوق به أداة لإعادة إنتاج بأمانة الميكانيكا الحيوية للصدمة الدماغية القحفية البشرية وتميز طوليا الآثار الجزيئية للارتجاجات. ويمكن أيضا أن تستخدم لدينا نموذج الفئران في مجموعة واسعة من الدراسات العلاجية كما أنه يوفر فرصة قيمة لدراسة آلية وفعالية العوامل الدوائية في الجسم الحي، باستمرار ودون الحاجة إلى التضحية الحيوان. وعلاوة على ذلك، فإن توافر نموذج الفئران مثل النموذج المعروض هنا يمكن أن يسهل إلى حد كبير فهم أفضل للعلاقة بين الاختلالات العصبية والعواقب السلوكية للارتجاجات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer