Un nouveau modèle de rat translationnel de commotion combinant la force et la rotation avec la microdialyse cérébrale in vivo

Résumé

L'altération de neurotransmetteur est un mécanisme de dysfonctionnement neural qui se produit après la commotion et contribue aux conséquences à long terme parfois-catastrophiques. Ce modèle de rat combine la microdialyse, permettant la quantification in vivo de neurotransmetteur, avec une technique de poids-goutte exerçant l'accélération et la décélération rapides de la tête et du torse, un facteur important du trauma craniocerebral humain.

Résumé

Les symptômes cognitifs et moteurs persistants sont des conséquences connues de commotions cérébrales ou de lésions cérébrales traumatiques légères (MTBIs) qui peuvent être partiellement attribuables à une neurotransmission altérée. En effet, les études de microdialyse cérébrale chez les rongeurs ont démontré une libération extracellulaire excessive de glutamate dans l'hippocampe dans les 10 premières minutes suivant le trauma. La microdialyse offre l'avantage évident de l'échantillonnage continu des neurotransmetteurs in vivo tout en n'ayant pas à sacrifier l'animal. En plus de la technique susmentionnée, un modèle de traumatisme crânien fermé qui exerce une accélération et une décélération rapides de la tête et du torse est nécessaire, car un tel facteur n'est pas disponible dans de nombreux autres modèles animaux. Le modèle de chute de poids de l'État de Wayne imite cette composante essentielle du traumatisme craniocerebral humain, permettant l'induction d'un impact sur la tête d'un rongeur sans retenue avec un poids en baisse. Notre nouveau modèle de rat translationnel et translationnel combine la microdialyse cérébrale avec le modèle de poids-goutte de l'état de Wayne pour étudier, dans les rats adultes légèrement anesthésiés et sans retenue, les changements aigus des niveaux extracellulaires de neurotransmetteur suivant la commotion. Dans ce protocole, la sonde de microdialyse a été insérée à l'intérieur de l'hippocampe comme région d'intérêt, et a été laissée insérée dans le cerveau à l'impact. Il y a une forte densité de terminaux et de récepteurs dans l'hippocampe, ce qui en fait une région pertinente pour documenter la neurotransmission altérée après une commotion cérébrale. Lorsqu'il est appliqué aux rats adultes de Sprague-Dawley, notre modèle combiné a induit des augmentations des concentrations extracellulaires hippocampal de glutamate dans les 10 premières minutes, compatibles avec la symptomologie post-commotion précédemment rapportée. Ce modèle combiné de perte de poids fournit un outil fiable pour que les chercheurs étudient les réponses thérapeutiques précoces aux commotions cérébrales en plus des lésions cérébrales répétitives, puisque ce protocole induit un traumatisme léger à tête fermée.

Introduction

Le but de cette méthode est de fournir aux chercheurs un outil fiable qui reproduit fidèlement la biomécanique du traumatisme crânien humain tout en permettant la caractérisation longitudinale des effets moléculaires des commotions cérébrales/cerveau traumatique léger (mTBIs). Cette méthode combine la microdialyse cérébrale avec le modèle de chute de poids de l'état de Wayne pour documenter, chez les rats adultes légèrement anesthésiés et sans retenue, les changements aigus des niveaux extracellulaires de neurotransmetteur suivant la commotion. Avec cette méthode mini-invasive, les neurotransmetteurs tels que le glutamate, le GABA, la taurine, la glycine et la sérine peuvent être rapidement et continuellement quantifiés après un traumatisme, in vivo, tout en n'ayant pas à sacrifier l'animal.

La commotion/mTBI est une perturbation pathophysiologique qui affecte le fonctionnement du cerveau causée par un mécanisme de force externe. Les commotions cérébrales/ITM sont la forme la plus courante de lésions cérébrales traumatiques, représentant 70 à 90 % des cas¹. La plupart des perturbations fonctionnelles aigues à la suite d'une commotion cérébrale peuvent être attribuées à une lésion cérébrale primaire et secondaire^2,3: (1) le traumatisme crânien primaire est induit par l'accélération et la décélération rapides de la tête et du torse qui endommage les tissus cérébraux par compression suivie de l'étirement et le tonte des axones pendant le contrecoup^4,5,6 et (2) la lésion cérébrale secondaire est la réponse cellulaire indirecte au traumatisme. Il a lieu des heures et des jours après la lésion cérébrale primaire et joue un rôle important dans la déficience motrice et cognitive observée au fil du temps. Beaucoup des symptômes peuvent être attribués à la neurotransmission altérée telle que la libération extracellulaire excessive précédemment démontrée de glutamate dans les 10 premières minutes suivant la blessure^7,8,9. Compte tenu de sa forte densité de terminaux et de récepteurs, l'hippocampe est une structure cérébrale particulièrement vulnérable à cette réponse excitotoxique à la suite de blessures. Étant fortement impliqué dans la fonction cognitive^10,11, les études chez les rongeurs ont rapporté que les dommages hippocampiques associés à la commotion cérébrale peuvent mener aux affaiblissements dans le conditionnement de crainte et la mémoire spatiale d'apprentissage^{12 , 13}. L'objectif principal de cette méthodologie était d'élaborer un modèle de rat de commotion/mTBI, en utilisant la procédure de chute de poids de la tête fermée de l'État de Wayne pour reproduire fidèlement les mécanismes de la lésion cérébrale primaire, et incorporer le cerveau microdialyse à étudier in vivo, le neurotransmetteur extracellulaire aigu change dû à la lésion cérébrale secondaire à la suite d'une commotion cérébrale. Des concentrations de glutamate extracellulaire et de GABA ont été mesurées dans l'hippocampe pour agir en tant que résultats représentatifs de notre méthode.

Des études antérieures sur les rongeurs ont combiné la microdialyse et d'autres modèles de blessures, comme la baisse de poids du crâne ouvert et l'impact cortical contrôlé, pour démontrer les changements aigus des niveaux de neurotransmetteurextracellulaire à la suite d'une blessure de gravité variable. degrés^14,15,16,17. Cependant, en plus des degrés élevés de variabilité, la valeur translationnelle des modèles comme la baisse de poids du crâne ouvert et l'impact cortical contrôlé est entravée par un manque inhérent de validité écologique en raison de 2 facteurs : (1) ces modèles induisent beaucoup de blessures plus graves que les commotions cérébrales liées au sport subies chez l'homme, impliquant une charge cérébrale directe et (2) ces modèles nécessitent une cranictomie ou une craniotomie, la tête du rongeur étant complètement retenue dans un cadre stéréotaxique, empêchant la l'accélération et la décélération de la tête et du torse, reproduisant ainsi mal la biomécanique des commotions cérébrales.

La microdialyse est une méthode peu invasive qui offre l'avantage évident de l'échantillonnage de neurotransmetteurs tels que le glutamate, le GABA, la taurine, la glycine et la sérine, in vivo et continuellement après un traumatisme, tout en n'ayant pas à sacrifier l'animal. En plus des avantages offerts par la microdialyse, l'Université d'État de Wayne a développé un modèle de chute de poids à crâne fermé (par opposition à la crâne ouvert d'autres modèles), qui permet l'induction d'un mTBI sur un rongeur légèrement anesthésié et sans retenue, permettant ainsi l'accélération rapide et la décélération de la tête et du torse¹⁸. Comme mentionné précédemment, l'accélération et la décélération de la tête et du torse est une caractéristique biomécanique de base des commotions cérébrales liées au sport observées chez l'homme que les modèles mTBI des rongeurs précédents n'ont pas abordé. La procédure de chute de poids peut être faite très rapidement et ne nécessite aucune chirurgie préalable ou l'incision du cuir chevelu. Après l'induction de la commotion cérébrale, les rongeurs récupèrent le réflexe de redressement presque spontanément et ne souffrent pas de paralysie, de convulsions ou de détresse respiratoire après un seul impact. Les saignements intracrâniens et les fractures du crâne sont rares, et seuls des déficits mineurs dans la coordination motrice ont été signalés chez les rongeurs. Ce modèle de rat est facile à utiliser, peu coûteux et facilite la quantification des neurotransmetteurs libérés dans la phase aigue à la suite d'une commotion cérébrale sans enlever la sonde de microdialyse pendant l'impact.

Notre modèle de rat combinant microdialyse et commotion est approprié pour les chercheurs qui cherchent à caractériser longitudinalement les effets moléculaires de la commotion cérébrale et pourrait être utilisé dans une grande variété d'études thérapeutiques. En effet, malgré plusieurs années de recherche et un besoin écrasant, aucun médicament pour prévenir les effets à long terme des commotions cérébrales n'a passé la phase d'essai clinique¹⁹. L'une des raisons possibles de ces échecs pourrait être l'utilisation de modèles animaux qui ne reproduisent pas fidèlement les forces biomécaniques traumatiques des commotions cérébrales telles qu'elles ont été vécues par les humains. La méthode présentée ici répond à la définition des commotions cérébrales humaines qui précise que le traumatisme crânien primaire est induit par un impact brutal ainsi que par une accélération et une décélération rapides de la tête et du torse^2,3.

En outre, notre modèle combiné est approprié pour les chercheurs qui étudient les effets des lésions cérébrales traumatiques légères répétées (RMTBI) puisque l'une de ses caractéristiques clés qui le distingue des autres modèles animaux de commotion est qu'il permet d'induire blessures répétées et légères au même cas¹⁸. Chez l'homme, le rmTBI est associé à des symptômes post-traumatiques plus graves, à des temps de récupération plus longs et à des déficiences motrices et cognitives aggravées qui ont tendance à se propager au fil du temps^20,21. D'autres modèles animaux pertinents ont également permis de mieux comprendre la physiopathologie post-traumatique de rmTBI^{22,23,24,25,26,27} . Une vulnérabilité cérébrale accrue a été démontrée chez les rongeurs après un minimum de 5 mTBI à 24 heures d'intervalle. La neuroinflammation augmente avec le nombre de mTBI expérimentés et les marqueurs de neurodégénérescence apparaissent²⁸. Le mTBI répété empêcherait la transition des microglies d'un mode proinflammatoire à un mode normal de rétablissement, ayant pour résultat l'activité excitotoxic prolongée et l'activation des mécanismes neurodegenerative ^29. Avec notre modèle, les rats pourraient être exposés à 1 impact par jour sur une période de 1 semaine pour un total de 5 expositions. Compte tenu de la simplicité de ce modèle animal, il pourrait faciliter la caractérisation des effets cumulatifs de la libération de neurotransmetteur s'agit d'un neurotransmetteur indiscriminé aigu surgissant immédiatement après un MTBI.

Ce modèle permet également aux animaux d'être facilement exposés à 2 impacts par jour, ce qui permet d'étudier des conditions encore plus graves, comme lorsqu'un athlète reçoit un autre impact traumatique dans un court laps de temps à partir du premier coup³⁰. Comme démontré dans une étude précédente³¹, le moment d'un deuxième coup à la tête peut affecter considérablement les dommages vasculaires et axonaux. Plus le second coup est proche du premier coup, plus les conséquences sont dommageables. Ce modèle est approprié pour étudier comment cette condition particulière affecte la libération extracellulaire de neurotransmetteur.

Dans cette méthode, l'hippocampe a été utilisé comme région d'intérêt en raison de sa pertinence dans la recherche sur les commotions cérébrales, mais des échantillons de microdialyse peuvent être prélevés dans d'autres régions d'intérêt ainsi. Cependant, toute autre région du cerveau doit être considérée en raison de l'espace laissé par le site d'impact de la canule guide, y compris le ciment dentaire qui l'entoure, peut prendre une quantité considérable d'espace sur la tête du rat. En outre, les paramètres de microdialyse présentés dans cette méthode tels que le seuil de poids moléculaire de la membrane et la longueur active, les intervalles de temps d'échantillonnage et le débit peuvent être ajustés en fonction du type de molécule étudiée. La collecte efficace des cytokines pro-inflammatoires impliquées dans des commotions cérébrales, par exemple, exigerait une membrane avec une taille beaucoup plus grande de pores.

Protocole

Le protocole animalier de ce projet a obtenu l'approbation du Comité de protection des animaux du Hopital du Sacre-Cœur de Montréal, conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux.

REMARQUE : Un aperçu schématique du protocole de recherche est présenté à la figure 1.

1. Préparation des animaux

1. Commandez des rats Sprague-Dawley auprès d'un fournisseur d'animaux de laboratoire standard pour qu'ils soient livrés entre 43 et 50 jours et à un poids compris entre 151 et 200 g.
2. Loger tous les rats individuellement dans un cycle de 12:12 h de lumière: l'obscurité, à 24-26 oC avec un accès ad libitum à l'eau et la nourriture.
3. Pendant les 2 semaines avant le début du protocole, manipulez les rats pendant 5 minutes sur une base quotidienne pour faciliter leur accoutumance en contact avec des chercheurs. Les rats doivent être âgés d'environ 10 semaines et leur poids devrait être entre 295 et 351 g au moment de la commotion cérébrale ou l'induction de blessures simulées.

2. Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery

1. Effectuez la chirurgie dans des conditions stériles. Portez des gants stériles, un bonnet de cheveux et un masque chirurgical tout au long de l'intervention. Autoclave et stériliser tous les matériaux et instruments chirurgicaux à l'avance. Nettoyez et désinfectez soigneusement la zone de travail et l'appareil stéréotaxique avec une solution d'éthanol (70 %).
2. Anesthésiez les animaux en injectant un cocktail de kétamine (70 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritone. Asses profondeur anesthésique en testant le réflexe à une pincée d'orteil.
3. Retirer la fourrure de la tête de l'animal à l'aide de tondeuses électriques. Tête rasée propre à l'aide d'une solution de 2% d'alcool isopropyl et 2% de chlorhexidine gluconate (3 fois). Appliquer une pommade lubrifiante pour les yeux pendant l'anesthésie pour prévenir la sécheresse.
4. Drape-off le champ chirurgical de sorte que seule la tête de l'animal est exposée. Placez la tête du rat dans un appareil stéréotaxique, insérez les barres d'oreille dans les canaux auditifs avec beaucoup de soin, puis serrez la pince nasale. Fixer une canule guide en acier inoxydable de 26 G au bras du support de l'appareil stéréotaxique.
5. Injecter localement un cocktail anesthésique de bupivacaine (1,5 mg/kg) et de lidocaïne (1,5 mg/kg) sous-cutané sur la tête, 10 min avant l'incision.
6. Maintenir l'anesthésie pendant toute la procédure en livrant de l'isoflurane de sodium (2,5%) à 0,5 L/min d'oxygène avec un cône nasal.
7. Faire une incision médiane (3 cm) le long du cuir chevelu avec un scalpel. Laissez le crâne dégagé en installant 4 pinces autour de l'incision.
8. Grattez fermement le périosteume du crâne avec une lame chirurgicale jusqu'à ce que les sutures Bregma et Lambda soient visibles. Maintenir une pression ferme sur le crâne à l'égard d'un tampon de gaze ou d'un applicateur à pointe de coton s'il y a des saignements.
9. Confirmer si le crâne est correctement aligné sur l'appareil stéréotaxique en comparant les coordonnées dorsoventrales des sutures Bregma et Lambda. Identifiez les coordonnées antéropostérieures, médiolatérales et dorsoventrales de la suture Bregma comme points de référence pour les coordonnées de la canule guide.
10. En prenant les coordonnées de suture de Bregma comme références, calculez les coordonnées du site d'implantation de canules de guide dans l'hippocampe.
    REMARQUE: Les coordonnées suivantes ont été déterminées selon l'atlas du cerveau des rats de Paxinos et Watson (antéropostérieur: -0,60 cm; médiolatéral: 0,58 cm; dorsoventral: -0,16 cm, Figure 2A)³².
11. Marquez le site d'implantation précis à l'aide d'un marqueur.
12. Percer un trou de 0,5 mm à travers le crâne à l'emplacement cible de la canule guide. Percer 3 autres trous d'environ 5 mm autour de ce point pour enfiler 3 vis d'ancrage dans le crâne qui solidifiera la canule après l'application du ciment dentaire acrylique.
13. Insérez la canule dans l'hippocampe et fixez-la avec du ciment dentaire. Cette canule sera utilisée pour insérer la sonde dans la région d'intérêt 7 jours plus tard au cours de la procédure de microdialyse. Veillez à ne pas renverser l'excès de ciment dentaire autour de l'emplacement où le poids sera abandonné.
14. Laisser sécher le ciment pendant 2 min, puis retirer le bras du support de la canule. Insérez un obturateur détaliénable en acier inoxydable dans la canule pour éviter l'infiltration de liquide céphalo-rachidien et les risques d'infection.
15. Retirez les 4 pinces, retirez la peau rétractée et coudre avec un fil de suture chirurgicale 4-0.
16. Retirer le rat de l'appareil et injecter de la buprénorphine sous-cutanée pour traiter la douleur (0,05 mg/kg, après la chirurgie, puis une fois par jour pendant les 2 jours suivants). Placez le rongeur dans sa cage avec un coussin chauffant sous jusqu'à ce qu'il devienne conscient, puis retournez-le à l'établissement de soins aux animaux pour une période de récupération de 7 jours sous surveillance étroite.

3. Procédure de microdialyse

1. Pendant l'exécution de la procédure de microdialyse, portez des gants stériles, un bonnet de cheveux et un masque chirurgical. Sept jours après la chirurgie d'implantation de canules, anesthésier le rat avec de l'isoflurane de sodium (2,5%) à 0,5 L/min d'oxygène.
2. Retirez l'obturateur de la canule et insérez lentement une sonde de microdialyse, perfusée de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (26 mmol/L NaHCO₃, 3 mmol/L NaH₂PO₄, 1,3 mmol/L MgCl₂, 2,3 mmol/L CaCl₂, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-ascorbic acid), à travers la canule dans l'hippocampe ou toute autre région d'intérêt.
   REMARQUE: Les rats doivent être anesthésiés seulement en enlevant l'obturateur et en insérant la sonde de microdialyse, et pendant l'induction de la commotion ou de la blessure de faux. Les sondes utilisées ici sont construites en laboratoire, en forme de I, et composées de lignes d'inlet-sortie de silice fusionnées côte à côte [diamètre interne (ID) : 50 m] enfermés dans des tubes en polyéthylène (ID : 0,58-0,38 mm). L'extrémité de la canule est fixée par une longueur de membrane de cellulose creuse régénérée [coupure de poids moléculaire : 13 kDa, diamètre extérieur (OD) : 216 m ; ID: 200 m] à l'aide d'adhésif cyanoacrylate et la pointe scellée avec époxy. La membrane active mesure 2,5 mm pour l'implantation dans l'hippocampe mais peut être ajustée en fonction de la profondeur de la région d'intérêt. La connexion de la canule d'habitation du rat à la sonde est fixée avec un collier en acier inoxydable ajusté et fileté.
3. Fixez l'assemblage de la sonde à un ressort en acier inoxydable attaché à un bras pivotant liquide et à un levier de contrepoids suspendu au-dessus de la cage avec un anneau et des pinces afin que l'animal puisse se déplacer librement dans sa cage. Les rats attachés passent toute la durée de la procédure de microdialyse avec un accès ad libitum à l'eau et à la nourriture.
4. Utilisez une pompe à microinfusion pour envoyer du perfusate aux sondes et collectez le dialysate de la ligne de sortie de silice fusionnée (volume mort : 0,79 L).
5. Au moins 1 h et 30 min avant le début de la procédure, tourner la sonde à son débit de travail (1 l/min). Vérifier que le débit de la sonde est compatible en mesurant le volume au fil du temps avec une pipette.
   REMARQUE: Le débit peut être plus ou moins dépendant des neurotransmetteurs échantillonnés et de la région d'intérêt du cerveau. Des échantillons de dialyse sont prélevés avant, pendant et après une commotion cérébrale ou une intronisation par une blessure fictive. L'intervalle d'échantillonnage dépend de la région d'intérêt du cerveau, des neurotransmetteurs analysés, des concentrations dialysées de l'analyte et de la sensibilité de l'équipement de chimie analytique utilisé. Les phases de collecte effectuées ici dans l'hippocampe pour l'échantillonnage du glutamate et du GABA sont les suivantes :
   1. Ligne de base : Au début de l'expérience, prélever des échantillons de dialyse à intervalles de 10 min pendant 60 min.
   2. Après une commotion ou une blessure fictive : Après une commotion cérébrale ou une blessure fictive, prélever des échantillons pour 90 min (9 échantillons supplémentaires).
6. Recueillir chaque échantillon de dialysate dans un flacon fractionpréchargé avec 1 l de 0,25 mol/L d'acide perchlorique pour prévenir la dégradation de l'analyte. Conserver les échantillons à 4 oC pour une analyse ultérieure.
7. Après la collecte du dernier échantillon de dialysate, réanester le rat avec un cône nasal livrant de l'isoflurane de sodium (2,5 %) à 0,5 L/min d'oxygène.
8. Retirez la sonde de microdialyse de la canule, réinsérez l'obturateur, puis retournez le rat à l'établissement de soins aux animaux.

4. Installation d'apparatus de commotion

1. Avant le début de la procédure, taillez un poids à utiliser pour infliger la commotion (19 mm de diamètre) de laiton massif pour obtenir une masse de 450 g. Insérez une boucle métallique au sommet du poids en laiton. Percer les trous préliminaires à une distance de 1,0 m à l'intérieur d'un tube de guidage vertical de polyvinyle (PVC).
2. Émincer une feuille d'aluminium avec une lame de rasoir pointue. La feuille d'aluminium à fentes doit supporter le poids du rat (295 à 351 g) sans interférer avec l'accélération de son corps après l'impact de la tête du poids en laiton.
3. Tapez la feuille d'aluminium à fentes sur un cadre en plexiglas en forme de U (38 cm de long x 27 cm de large x 30 cm de profondeur, Figure 3A,B) qui contient un coussin en mousse (37 cm de long x 26 cm de large x 12 cm de profondeur).
4. Placez le cadre en plexiglas sous un tube guide en PVC (20 mm de diamètre x 1,5 m de longueur).
5. Maintenez le tube de guidage en PVC en place avec un support de pince 3,5 cm au-dessus de l'aluminium à fentes.
6. Fixez une ligne de pêche à la mouche en nylon (capacité de 9,1 kg, 0,46 mm de diamètre) à travers la boucle métallique de sorte que le fond du poids se bloque 2,5 cm au-dessus de l'aluminium fente afin d'éviter de multiples coups lorsque le rat tombe sur le coussin de mousse après l'impact.
7. Fixez la ligne de pêche à la mouche en nylon au stand de pince.
8. Tirez le poids à travers le tube en PVC avec la ligne de pêche à la mouche en nylon, puis gardez-le en place en insérant une clé hexagonale à travers les trous forés préliminaires à 1,0 m.

5. Induction de commotion

1. Après la phase de référence de la collecte des échantillons de dialyse, réanester légèrement le rat en plaçant un cône nasal livrant de l'isoflurane de sodium (2,5 % d'isoflurane à 0,5 L/min d'oxygène) jusqu'à ce qu'il n'interapcise pas de réponse à une pincée d'orteil (comme mentionné à la section 3.1).
2. Placez l'animal sur sa poitrine sur la feuille d'aluminium à fentes de sorte que sa tête soit placée directement dans le chemin du poids en laiton (Figure 3C,D). Maintenir l'anesthésie avec le cône nasal pour s'assurer que le rat ne bouge pas ou ne se réveille pas avant que le poids ne le frappe.
3. Retirez le cône nasal et tirez la clé hexagonale. Le poids tombera verticalement à travers le tube en PVC et aura un impact sur la tête du rat. Le rat subira une rotation rapide de 180 degrés et atterrira sur son dos (figure 3E).
4. Retirez le rat du coussin en mousse et placez-le sur le dos dans sa cage.
5. Utilisez une minuterie numérique pour mesurer le temps réflexe de redressement comme signe de récupération et de gravité des blessures. Le temps réflexe de redressement est le temps total de l'impact jusqu'à ce que les rongeurs se réveillent et se droit spontanément à la position couchée de la position de supine, ou commencer à marcher. Notez tout signe de décès, de fracture ou de saignement.
   REMARQUE: La procédure peut être répétée sur le même sujet à différents moments pour les commotions cérébrales répétées.

6. Induction Sham

1. Après la phase de référence de la collecte des échantillons de dialyse, réanester légèrement le rat en plaçant un cône nasal livrant de l'isoflurane de sodium (2,5 %) à 0,5 L/min de flux d'oxygène jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de réponse à une pincée d'orteil (comme mentionné à la section 3.1).
2. Placez l'animal sur sa poitrine sur la feuille d'aluminium à fentes de sorte que sa tête se trouve directement dans le chemin du poids en laiton. Maintenir l'anesthésie avec le cône nasal pour s'assurer que le rat ne bouge pas ou ne se réveille pas.
3. Retirez le cône nasal et retirez l'animal de la feuille d'aluminium sans tirer la clé de hexagone. Le rat ne subira pas une rotation rapide de 180 degrés.
4. Placer le rat sur le dos dans sa cage.
5. Utilisez une minuterie numérique pour mesurer le temps de redressement comme indicateur de la restauration neurologique.

7. Chromatographie liquide haute performance

1. Déterminer les niveaux de neurotransmetteurs (c.-à-d. le glutamate et le GABA) par dérivatisation de précolonnes à l'aide d'une chromatographie liquide à haute performance avec détection rapide de la fluorescence par séparation, et d'un système composé d'un autosampler de séparation rapide et d'une pompe couplée à une colonne analytique de 3,0 x 50 mm 5 m.
2. Préparer une phase mobile avec 100 mmol/L de phosphate de sodium dibasic (Na₂HPO₄), 3,5% d'acétonitrile et 20% de méthanol. Ajuster le pH à 6,7 avec de l'acide phosphorique (85%) au besoin.
3. Définir le débit à 0,5 ml/min.
4. Préparer de nouveaux réactifs de dérivatisation quotidienne et des normes de travail (100 ng/mL) à partir de solutions de stock. Chargez-les dans un autosampler de séparation rapide réfrigéré (10 oC) avec des échantillons.
5. Mélanger chaque fraction de façon séquentielle dans la colonne analytique avec 20 l d'acide 3-mercaptopropionionic (0,071 mol/L) dilué avec H₂O et 20 O 'L d'o-phthaldéhyde (0,0143 mol/L) dilué avec 0,1 mol/L de tétraborate de sodium. Laisser réagir 10 min pour que le mélange réagisse.
6. Pour éviter la contamination des échantillons suivants, rincer la boucle d'injection avec du méthanol (20 %), après chaque injection.
   REMARQUE: Le temps de rétention du glutamate serait d'environ 1 min dans ce protocole, pour un temps de course total de 30 min pour chaque échantillon.
7. Au cours de l'analyse des pics chromatographiques, identifier les pics inconnus à l'aide d'échantillons assortis selon l'heure de rétention à partir de normes connues. Exprimer les niveaux d'analytes en tant que g/mL.

8. Histologie

1. Un mois après la procédure de microdialyse et l'induction de commotions cérébrales ou de blessures fictives, anesthésier les animaux en injectant un cocktail de kétamine (70 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritone et de les euthanasier par paraformaldéhyde (4 %) perfusion intracardiaque saline.
2. Décapiter les rongeurs puis disséquer le cerveau.
3. Conserver le cerveau dans le paraformaldéhyde (4 %) et par la suite les cryoprotéger dans une solution de saccharose (30%).
4. Trancher le cerveau en sections coronales de 50 m avec un cryostat.
5. Tainer les tranches de cerveau avec la violette cresyl pour la vérification histologique des blessures et le placement de sonde (coloration de Nissl).

Résultats

À l'aide de notre modèle de commotion cérébrale qui combine la force et la rotation avec la microdialyse cérébrale in vivo, les changements aigus de glutamate extracellulaire et de GABA au fil du temps suivant une commotion ou une blessure fictive ont été étudiés chez 21 rats mâles, adultes, Sprague-Dawley par le implantation d'une canule de guide dans la région CA1 de l'hippocampe.

Vérification histologique du placement et des blessures de la sonde
Aucun changement morphologique tel que des hémorragies intracérébrales massives ou des contusions n'a été rapporté après la vérification histologique des dommages de tissu d'hippocampe sur des sections souillées avec la violette de cresyl. L'implantation de canule de guide et l'insertion de sonde de microdialyse ont induit des dommages mineurs et semblables entre les cas blessés et faux. De plus, le fait de ne pas enlever la sonde juste avant une blessure fictive ou une induction de commotion cérébrale n'a pas donné de dommages distincts aux tissus de l'hippocampe, comme on le voit au microscope (figure2B,C, respectivement), la membrane de la sonde étant toujours intacte. par la suite (Figure 2D,E). Cerveaude de commotion et de dommages simulés perfused avec le paraformaldehyde (4%) 1 mois après les procédures de microdialyse sont indiscernables lors de l'inspection visuelle (Figure 2F, G).

Temps réflexe de redressement
Les animaux du groupe blessé ont eu un temps de ciblage sensiblement augmenté en moyenne par rapport aux cas fictifs (test t de l'étudiant, p - 0,042801) (figure 4) et semblaient stupéfaits à la reprise de conscience. Des 10 cas du groupe de commotion, un animal simple a montré des signes mineurs de saignement sous le site d'impact suivant la chute de poids. Aucun autre signe de fracture du crâne ou de saignement intracrânien n'a été observé.

Microdialyse cérébrale in vivo
Pour agir comme résultats représentatifs de notre méthode, quinze échantillons de dialysat de 10 L ont été extraits de l'hippocampe, in vivo, à des intervalles de 10 min et un débit de 1 l/min. Des niveaux extracellulaires de glutamate et de GABA ont été mesurés à partir de 6 échantillons au cours de la ligne de base ( 60 min) et à partir de 9 échantillons à la suite de l'induction d'une blessure ou d'une commotion cérébrale (90 min).

Concentrations extracellulaires de glutamate
Des augmentations significatives des concentrations extracellulaires de glutamate ont été observées dans la région CA1 de l'hippocampe au cours des 10 premières minutes suivant l'induction d'un traumatisme par rapport aux blessures fictives (Mann-Whitney U Test, p - 0,009175) (Figure 5). Aucune autre différence dans les concentrations de glutamate n'a été observée entre les groupes à un autre moment.

Concentrations extracellulaires de GABA
Aucun changement significatif des concentrations de GABA n'a été observé dans la région CA1 de l'hippocampe au cours des 10 premières min suivant l'induction d'un traumatisme par rapport aux blessures fictives (Mann-Whitney U Test, p - 0,943861) (Figure 6). Il n'y avait aucune autre différence significative dans les concentrations de GABA à n'importe quel autre point de temps entre les cas de commotion et les cas de dommages fictifs.

Figure 1 : Esquisse schématique du protocole de recherche. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Vérification histologique du placement et des blessures de la sonde. (A) Vue coronale de la sonde de microdialyse et du site de placement de canule de guide dans l'hippocampe utilisant l'atlas stéréotaxique de Paxinos et Watson. (B) Photomicrographe représentatif des dommages de tissu d'hippocampe (violet de cresyl) produit par une sonde de microdialyse et canule de guide d'un cas de blessure de faux. (C) Photomicrographe représentatif des dommages de tissu d'hippocampe (violet de cresyl) produit par une sonde de microdialyse et canule de guide d'un cas de commotion. (D) Photomicrographe représentatif d'une sonde de microdialyse avant l'induction de la commotion cérébrale. (E) Photomicrographe représentatif d'une sonde de microdialyse après induction de la commotion. La membrane est toujours intacte. (F-G). Photomicrographe représentatif d'une feinte (F) et d'une commotion cérébrale (G) blessé au cerveau après perfusion avec 4 % de paraformaldéhyde à 1 mois après une blessure fictive ou une commotion cérébrale. Lors de l'inspection visuelle, les 2 cerveaux sont indiscernables. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Appareil de commotion et microdialyse instruments représentations des composants essentiels. (A) Une photographie de l'ensemble de l'assemblage composé d'un tube de guidage vertical de chlorure de polyvinyle (PVC) pour le poids tombant situé au-dessus du stade de rat, cadre en plexiglas, coussin en mousse, pompe à microinfusion commandée par ordinateur, seringues à gaz, liquide pivots, et côte à côte fusionné esquive lignes d'inlet-outlet. (B) Représentation schématique du cadre en plexiglas et coussin en mousse avec toutes les dimensions pertinentes. (C) Une photographie du morceau de papier d'aluminium à fentequi sert de scène de rat au-dessus du coussin en mousse. (D) Une photographie montrant le positionnement du rat sur la scène immédiatement avant l'impact de la tête par la chute de poids. (E) Une photographie montrant le rat après l'impact de la tête, illustrant la rotation horizontale de 180 degrés du corps du rat après l'impact de la tête et l'accélération et la rotation qui s'ensuivent. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Temps de ricien. Représentations histogrammes du temps pris par les rats pour se réveiller de l'anesthésique et basculer de la position de supine à la position couchée ou commencer à marcher après une commotion cérébrale (diamants rouges, n ' 10) ou des blessures simulées (carrés bleus, n - 11). Les rats du groupe de commotion ont pris beaucoup plus de temps pour se redresser par rapport au groupe de blessures simulées. Les valeurs moyennes sont représentées comme une ligne horizontale dans chaque graphique. p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 0.001. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Concentrations extracellulaires de glutamate. Concentrations extracellulaires moyennes de glutamate (g/mL) mesurées par microdialyse dans l'hippocampe pendant la ligne de base (60 min) et après une commotion cérébrale (diamants rouges, n - 10) ou des blessures fictives (carrés bleus, n - 11) conditions (90 min). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. P lt; 0,05, P et lt; 0,01, P et lt; 0,001. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Concentrations extracellulaires de GABA. Concentrations extracellulaires moyennes de GABA (g/mL) mesurées par microdialyse dans l'hippocampe pendant les conditions de base (60 min) et après une commotion cérébrale (diamants rouges, n - 10) ou des blessures fictives (carrés bleus, n - 11) conditions (90 min). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. P lt; 0,05, P et lt; 0,01, P et lt; 0,001. Ce chiffre a été modifié par IO Masse 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Étapes critiques du protocole
Pour la génération de résultats fiables, les étapes critiques de ce protocole nécessitent une attention particulière. Pendant la chirurgie d'implantation de canules, évitez d'utiliser plus de ciment que nécessaire, surtout lorsqu'il est très liquide pour éviter de se renverser sur le site d'impact. Pour éviter de bloquer le site d'implantation, utilisez un obturateur de la même longueur que la canule. Pendant la procédure de microdialyse, insérez la sonde lentement dans la canule et assurez-vous qu'elle est insérée complètement pour l'échantillonnage de dialysat. Avant l'induction de la commotion cérébrale, assurez-vous que la feuille d'aluminium est correctement insérée avec une lame de rasoir pointue. Dans le cas contraire, l'impact du poids en laiton ne sera pas suffisant pour déchirer la feuille d'aluminium et le rat restera poitrine vers le bas au lieu de subir une rotation de 180 degrés et l'atterrissage sur son dos. Si tel est le cas, les blessures induites résulteront de l'impact brutal, un peu comme ce qui est vu dans les modèles de chute de poids à crâne ouvert et être significativement plus grave. Pendant l'induction de commotion, évitez d'impacter la canule avec le poids car ceci produirait des dommages critiques au crâne du rat. Il est fortement recommandé de travailler en équipe de 2 pour limiter les erreurs de manipulation pendant l'expérience.

Modifications et dépannage
Pendant la procédure de microdialyse, le débit doit être constant et produire un volume approprié au taux de perfusion, une fois que la sonde est liée à la pompe. Des volumes plus faibles peuvent indiquer la présence d'engorgement dans la membrane de la sonde ou de bulles d'air dans les lignes. En cas de colmatage, la sonde doit être jetée et remplacée. Cependant, les bulles d'air peuvent être éjectées en circulant ACSF dans les lignes. S'il n'y a pas de colmatage ou de bulles d'air notés et qu'il n'y a toujours pas d'écoulement, une petite partie du tube d'écoulement le plus proche de l'extrémité peut être coupée.

Limites de la méthode
D'autres études utilisant la baisse de poids de l'Université Wayne State ont évalué certains changements structurels et moléculaires fondamentaux¹⁸. Cependant, une enquête plus approfondie maintiendrait la légitimité de cette procédure. L'information concernant les changements biologiques et neuroanatomiques qui ont lieu aux niveaux épigénétique et cellulaire solidifierait davantage la valeur fiable et translationnelle de notre méthode. En outre, l'évaluation de la fonction cognitive est une mesure fiable des résultats liés à l'ITM chez les modèles de rongeurs³³. Tandis que le temps-à-droite a été mesuré dans ce protocole et a été sensiblement retardé dans les cas blessés comparés aux cas fictifs, les études à l'avenir devraient se concentrer sur mesurer méthodiquement la fonction cognitive suivant l'induction de trauma chez les rongeurs.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives.
La principale signification de la méthode est double: Tout d'abord, il permet l'induction réussie d'une commotion cérébrale avec la procédure Wayne State University, qui permet une accélération rapide et la décélération de la tête et le torse. Avec cette méthode, les résultats sérieux de blessure tels que des arrêts cardiorespiratoires, la rupture de crâne, la mortalité élevée et les signes des contusions cérébrales visibles au site d'impact ont été évités. Deuxièmement, cette technique de microdialyse a reproduit avec succès la libération extracellulaire de glutamate aigu et de courte durée qui a eu lieu dans les 10 premières minutes suivant l'induction de trauma^14,16. En outre, garder la sonde insérée tout au long de la procédure entière réduit considérablement la probabilité d'induire des dommages à la barrière hémato-encéphalique sensible à l'ATM liée à l'insertion répétée de sonde de microdialyse³⁴.

Applications futures ou directions de la méthode.
Étant donné les aspects faciles à utiliser de la procédure de baisse de poids de l'Université Wayne State et les changements aigus de niveau de neurotransmetteur extracellulaire mesurés par microdialyse, notre modèle de rat combinant microdialyse et commotion cérébrale fournit aux chercheurs un l'outil pour reproduire fidèlement la biomécanique du trauma craniocerebral humain et caractériser longitudinalement les effets moléculaires des commotions cérébrales. Notre modèle de rat pourrait également être utilisé dans une grande variété d'études thérapeutiques car il offre une occasion précieuse d'étudier le mécanisme et l'efficacité des agents pharmacologiques in vivo, en continu et sans avoir à sacrifier l'animal. En outre, la disponibilité d'un modèle de rat tel que celui présenté ici pourrait grandement faciliter la meilleure compréhension de la relation entre les déséquilibres de neurotransmetteur et les conséquences comportementales des commotions cérébrales.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer