Ein neuartiges und translationales Rattenmodell der Gehirnerschütterung, das Kraft und Rotation mit der zerebralen Mikrodialyse in Vivo kombiniert

Zusammenfassung

Neurotransmitter-Änderung ist ein Mechanismus der neuronalen Dysfunktion, die nach einer Gehirnerschütterung auftritt und trägt zu den manchmal katastrophalen langfristigen Folgen. Dieses Rattenmodell kombiniert mikrodialyse, ermöglicht in vivo Neurotransmitter Quantifizierung, mit einer Gewicht-Tropfen-Technik, die schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Rumpf, ein wichtiger Faktor des menschlichen Schädel-Traumas.

Zusammenfassung

Anhaltende kognitive und motorische Symptome sind bekannte Folgen von Gehirnerschütterungen/leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs), die teilweise auf eine veränderte Neurotransmission zurückzuführen sind. Tatsächlich haben zerebrale Mikrodialysestudien an Nagetieren eine übermäßige extrazelluläre Glutamatfreisetzung im Hippocampus innerhalb der ersten 10 min nach einem Trauma gezeigt. Die Mikrodialyse bietet den klaren Vorteil der kontinuierlichen Probenahme des Neurotransmitters in vivo, ohne das Tier opfern zu müssen. Zusätzlich zu der oben genannten Technik ist ein geschlossenes Kopfverletzungsmodell erforderlich, das eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper ausübt, da ein solcher Faktor in vielen anderen Tiermodellen nicht verfügbar ist. Das Wayne State Gewichtstropfenmodell imitiert diesen wesentlichen Bestandteil des menschlichen Schädel-Hirn-Traumas und ermöglicht die Induktion eines Aufpralls auf den Kopf eines hemmungslosen Nagetiers mit sinkendem Gewicht. Unser neuartiges und translationales Rattenmodell kombiniert die zerebrale Mikrodialyse mit dem Wayne State Gewichtstropfenmodell, um bei leicht anästhesisierten und hemmungslosen erwachsenen Ratten die akuten Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter-Spiegel nach einer Gehirnerschütterung zu untersuchen. In diesem Protokoll wurde die Mikrodialysesonde als Interessengebiet in den Hippocampus eingeführt und beim Aufprall in das Gehirn eingeführt. Es gibt eine hohe Dichte von Terminals und Rezeptoren im Hippocampus, so dass es eine relevante Region ist, um veränderte Neurotransmission nach einer Gehirnerschütterung zu dokumentieren. Bei anwendung auf erwachsene Sprague-Dawley Ratten induzierte unser kombiniertes Modell Erhöhungen der hippocampalen extrazellulären Glutamatkonzentrationen innerhalb der ersten 10 min, im Einklang mit der zuvor berichteten Post-Concussion-Symptomologie. Dieses kombinierte Gewicht-Tropfen-Modell bietet ein zuverlässiges Werkzeug für Forscher, um frühe therapeutische Reaktionen auf Gehirnerschütterungen zusätzlich zu sich wiederholenden Hirnverletzungen zu untersuchen, da dieses Protokoll ein leichtes Trauma mit geschlossenem Kopf induziert.

Einleitung

Der Zweck dieser Methode ist es, Forschern ein zuverlässiges Werkzeug zur Verfügung zu stellen, das die Biomechanik des menschlichen Schädel-Hirn-Traumas originalgetreu reproduziert und gleichzeitig eine Längscharakterisierung der molekularen Wirkungen von Gehirnerschütterungen/mildem schädelischem Gehirn ermöglicht. (mTBIs). Diese Methode kombiniert zerebrale Mikrodialyse mit dem Wayne State Gewichtstropfenmodell, um bei leicht anästhesisierten und hemmungslosen erwachsenen Ratten die akuten Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter-Spiegel nach einer Gehirnerschütterung zu dokumentieren. Mit dieser minimal-invasiven Methode können Neurotransmitter wie Glutamat, GABA, Taurin, Glycin und Serin nach einem Trauma in vivo schnell und kontinuierlich quantifiziert werden, ohne das Tier opfern zu müssen.

Concussion/mTBI ist eine pathophysiologische Störung, die die Gehirnfunktion durch einen externen Kraftmechanismus beeinflusst. Concussion/mTBI ist die häufigste Form traumatischer Hirnverletzungen, auf die 70-90% der Fälle¹entfallen. Die meisten akuten funktionellen Störungen nach einer Gehirnerschütterung können auf eine primäre und eine sekundäre Hirnverletzung zurückgeführt werden^2,3: (1) die primäre Hirnverletzung wird durch die schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper induziert die Hirngewebe durch Kompression schädigt, gefolgt von der Dehnung und dem Scheren von Axonen während des Spiels^4,5,6 und (2) die sekundäre Hirnverletzung ist die indirekte zelluläre Reaktion auf das Trauma. Es findet Stunden und Tage nach der primären Hirnverletzung statt und spielt eine wichtige Rolle bei der motorischen und kognitiven Beeinträchtigung im Laufe der Zeit beobachtet. Viele der Symptome können auf veränderte Neurotransmission enthoben werden, wie die zuvor nachgewiesene übermäßige extrazelluläre Glutamat-Freisetzung in den ersten 10 min nach Verletzung^7,8,9. Aufgrund seiner hohen Dichte an Terminals und Rezeptoren ist der Hippocampus eine Gehirnstruktur, die besonders anfällig für diese exzitotoxische Reaktion nach Verletzungen ist. Stark in die kognitive Funktion^10,11, Studien an Nagetieren berichteten, dass Hippocampus-Schäden im Zusammenhang mit Gehirnerschütterung kann zu Beeinträchtigungen in Angst Konditionierung und Lernen räumliches Gedächtnis führen^{12 , 13}. Das primäre Ziel dieser Methode war es, ein Rattenmodell von Gehirnerschütterung/mTBI zu erarbeiten, indem das Wayne State Closed Head Weight-Drop-Verfahren verwendet wird, um die Mechanismen der primären Hirnverletzung originalgetreu zu reproduzieren und zerebrale Mikrodialyse in vivo zu studieren, der akute extrazelluläre Neurotransmitter ändert sich aufgrund der sekundären Hirnverletzung nach einer Gehirnerschütterung. Konzentrationen von extrazellulärem Glutamat und GABA wurden im Hippocampus gemessen, um als repräsentative Ergebnisse unserer Methode zu fungieren.

Frühere Nagetierstudien haben Mikrodialyse und andere Verletzungsmodelle kombiniert, wie den Gewichtsverlust des offenen Schädels und die kontrollierte kortikale Wirkung, um die akuten Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter-Spiegel nach einer Verletzung unterschiedlicher Schwere zu demonstrieren. Grad^14,15,16,17. Neben den hohen Variabilitätsgraden wird jedoch der Translationswert von Modellen wie dem Gewichtsverlust des offenen Schädels und der kontrollierten kortikalen Wirkung durch einen inhärenten Mangel an ökologischer Gültigkeit aufgrund von 2 Faktoren behindert: (1) Diese Modelle induzieren Verletzungen schwerer als sportbedingte Gehirnerschütterungen, die beim Menschen erlitten wurden, wobei eine direkte Gehirnbelastung mit sich gebracht wird, und (2) diese Modelle eine Kraniektomie oder eine Kraniotomie erfordern, da der Kopf des Nagetiers in einem stereotaxic-Rahmen vollständig zurückgehalten wird, was die Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper, wodurch die Biomechanik der Gehirnerschütterung schlecht reproduziert wird.

Mikrodialyse ist eine minimal-invasive Methode, die den klaren Vorteil der Probenahme Neurotransmitter wie Glutamat, GABA, Taurin, Glycin und Serin, in vivo und kontinuierlich nach Trauma bietet, während nicht das Tier opfern. Zusätzlich zu den Vorteilen der Mikrodialyse entwickelte die Wayne State University ein Modell mit geschlossenem Schädelgewichtdrop (im Gegensatz zu Open-Skull von anderen Modellen), das die Induktion eines mTBI an einem leicht anästhesierten und hemmungslosen Nagetier ermöglicht, ermöglicht so eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper¹⁸. Wie bereits erwähnt, ist die Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper ein biomechanisches Kernmerkmal sportbedingter Gehirnerschütterungen beim Menschen, die frühere mTBI-Modelle nicht ansprechen konnten. Das Gewicht-Tropfen-Verfahren kann sehr schnell durchgeführt werden und erfordert keine vorherige Operation oder Kopfhautschnitt. Nach der Induktion der Gehirnerschütterung erholen sich Die Nagetiere fast spontan und erleben nach einem einzigen Aufprall keine Lähmungen, Krampfanfälle oder Atemnot. Intrakranielle Blutungen und Schädelfrakturen sind selten, und bei Nagetieren wurden nur geringfügige Defizite in der motorischen Koordination gemeldet. Dieses Rattenmodell ist einfach zu bedienen, kostengünstig und erleichtert die Quantifizierung von Neurotransmittern, die in der akuten Phase nach einer Gehirnerschütterung freigesetzt werden, ohne die Mikrodialysesonde während des Aufpralls zu entfernen.

Unser Rattenmodell, das Mikrodialyse und Gehirnerschütterung kombiniert, eignet sich für Forscher, die längs die molekularen Wirkungen einer Gehirnerschütterung charakterisieren möchten und könnte in einer Vielzahl von therapeutischen Studien verwendet werden. In der Tat, trotz mehrjähriger Forschung und einem überwältigenden Bedarf, kein Medikament, um die langfristigen Auswirkungen von Gehirnerschütterungen zu verhindern, hat die klinische Studienphase¹⁹bestanden. Einer der möglichen Gründe für diese Misserfolge könnte der Einsatz von Tiermodellen sein, die die traumatischen biomechanischen Kräfte von Gehirnerschütterungen, wie sie der Mensch erlebt, nicht originalgetreu wiedergeben. Die hier vorgestellte Methode entspricht der Definition menschlicher Gehirnerschütterungen, die angibt, dass die primäre Hirnverletzung durch einen stumpfen Aufprall sowie eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper induziert wird^2,3.

Darüber hinaus eignet sich unser kombiniertes Modell für Forscher, die die Auswirkungen wiederholter leichter traumatischer Hirnverletzungen (rmTBI) untersuchen, da eine ihrer Hauptmerkmale, die es von anderen Tiermodellen der Gehirnerschütterung unterscheidet, darin besteht, dass es möglich ist, wiederholte, leichte Verletzungen im gleichen Fall¹⁸. Beim Menschen ist rmTBI mit schwereren posttraumatischen Symptomen, längeren Erholungszeiten und verschärften motorischen und kognitiven Beeinträchtigungen verbunden, die sich im Laufe der Zeit ausbreiten^20,21. Andere relevante Tiermodelle haben es auch möglich gemacht, die posttraumatische Pathophysiologie von rmTBI^{22,23,24,25,26,27 besser zu verstehen} . Erhöhte Anfälligkeit des Gehirns wurde bei Nagetieren nach mindestens 5 mTBI in 24-Stunden-Intervallen nachgewiesen. Neuroinflammation erhöht sich mit der Anzahl der erlebten mTBI und Marker der Neurodegeneration erscheinen²⁸. Wiederholtes mTBI würde den Übergang von Mikroglia von einem proinflammatorischen Modus zu einem normalen Erholungsmodus verhindern, was zu einer längeren exzitotoxischen Aktivität und Aktivierung neurodegenerativer Mechanismen führen würde ²⁹. Mit unserem Modell könnten Ratten 1 Schlag pro Tag über den Zeitraum von 1 Woche für insgesamt 5 Expositionen ausgesetzt werden. Angesichts der Einfachheit dieses Tiermodells könnte es die Charakterisierung der kumulativen Auswirkungen der akuten wahllosen Neurotransmitter-Freisetzung erleichtern, die unmittelbar nach einem mTBI entsteht.

Dieses Modell ermöglicht es auch, Dass Tiere leicht 2 Stößen pro Tag ausgesetzt werden können, was es ermöglicht, noch schwerere Bedingungen zu untersuchen, z. B. wenn ein Athlet innerhalb kurzer Zeit nach dem ersten Schlag³⁰einen weiteren traumatischen Aufprall erhält. Wie in einer früheren Studie³¹gezeigt, kann das Timing eines zweiten Schlages auf den Kopf dramatische Auswirkungen auf vaskuläre und axonale Schäden haben. Je näher der zweite Schlag dem ersten Schlag ist, desto schädlicher sind die Folgen. Dieses Modell eignet sich für die Untersuchung, wie diese besondere Bedingung wirkt sich auf extrazelluläre Neurotransmitter Freisetzung.

Bei dieser Methode wurde der Hippocampus aufgrund seiner Relevanz in der Gehirnerschütterungsforschung als Interessengebiet verwendet, aber Mikrodialyseproben können auch aus anderen Regionen von Interesse entnommen werden. Allerdings muss jede andere Hirnregion aufgrund des Platzes berücksichtigt werden, der von der Aufprallstelle aus der Führungskanüle, einschließlich des zahnärztlichen Zements, der sie umgibt, eine beträchtliche Menge an Platz auf dem Kopf der Ratte einnehmen kann. Darüber hinaus können die bei dieser Methode dargestellten Mikrodialyseparameter wie die Molekulargewichtsabschaltung und aktive Länge der Membran, die Abtastzeitintervalle und die Durchflussrate je nach Art des untersuchten Moleküls angepasst werden. Die effiziente Sammlung von pro-inflammatorischen Zytokinen, die beispielsweise an Gehirnerschütterungen beteiligt sind, würde eine Membran mit einer viel größeren Porengröße erfordern.

Protokoll

Das Tierprotokoll für dieses Projekt erhielt die Genehmigung des Animal Care Committee des Hopital du Sacre-Céur de Montreal in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care.

ANMERKUNG: Eine schematische Darstellung des Forschungsprotokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Tierzubereitung

1. Bestellen Sie Sprague-Dawley-Ratten bei einem Standard-Labortierlieferanten, die zwischen 43 und 50 Tagen und einem Gewicht zwischen 151 und 200 g geliefert werden.
2. Haus alle Ratten einzeln in einem Zyklus von 12:12 h Licht: Dunkelheit, bei 24-26 °C mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.
3. Während der 2 Wochen vor dem Start des Protokolls, behandeln Sie die Ratten für 5 min auf einer täglichen Basis, um ihre Gewöhnung in Kontakt mit Forschern zu erleichtern. Ratten sollten etwa 10 Wochen alt sein und ihr Gewicht sollte zwischen 295 und 351 g zum Zeitpunkt der Gehirnerschütterung oder Scheinverletzung Induktion sein.

2. Mikrodialyse-Leitfaden Cannula Implantationchirurgie

1. Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen durch. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs sterile Handschuhe, eine Haarhaube und eine chirurgische Maske. Autoklav und sterilisieren alle Materialien und chirurgischen Instrumente im Voraus. Reinigen und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich und stereotaxic Apparat gründlich mit einer Lösung von Ethanol (70%).
2. Anästhesisieren Sie die Tiere, indem Sie einen Cocktail aus Ketamin (70 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal injizieren. Esbein Anästhesie Tiefe durch das Testen des Reflexes zu einer Zehenprise.
3. Entfernen Sie Fell aus dem Kopf des Tieres mit elektrischen Clippers. Sauberer rasierter Kopf mit einer Lösung aus 2% Isopropylalkohol und 2% Chlorhexidingluconat (3 mal). Tragen Sie während der Anästhesie Schmieraugensalbe auf, um Trockenheit zu vermeiden.
4. Das Operationsfeld abziehen, so dass nur der Kopf des Tieres ausgesetzt ist. Legen Sie den Kopf der Ratte in ein stereotaxic Gerät, setzen Sie die Ohrbügel in die Gehörgänge mit großer Sorgfalt, dann ziehen Sie die Nasenklammer. Befestigen Sie eine 26 G Führungskanüle aus Edelstahl am Halterarm des stereotaxic-Geräts.
5. Lokal einen Anästhetikum-Cocktail aus Bupivacain (1,5 mg/kg) und Lidocain (1,5 mg/kg) subkutan auf den Kopf injizieren, 10 min vor dem Einschnitt.
6. Halten Sie die Anästhesie während des gesamten Verfahrens durch die Lieferung von Natriumisofluran (2,5%) bei 0,5 l/min Sauerstoffstrom mit einem Nasenkegel.
7. Machen Sie einen Mittellinienschnitt (3 cm) entlang der Kopfhaut mit einem Skalpell. Lassen Sie den Schädel frei, indem Sie 4 Klammern um den Schnitt installieren.
8. Das Periost aus dem Schädel mit einer chirurgischen Klinge fest kratzen, bis die Nähte Bregma und Lambda sichtbar sind. Halten Sie festen Druck auf den Schädel mit einem Gazepad oder Baumwolle gekippt Applikator, wenn es Blutungen.
9. Bestätigen Sie, ob der Schädel korrekt auf dem stereotaxic-Gerät ausgerichtet ist, indem Sie die dorsoventralen Koordinaten der Nahtnähte Bregma und Lambda vergleichen. Identifizieren Sie die anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Koordinaten der Bregma-Naht als Bezugspunkte für die Koordinaten der Führungskanüle.
10. Unter Herannahme der Bregma-Nahtkoordinaten als Referenzen berechnen Sie die Koordinaten der Guide Cannula Implantationsstelle im Hippocampus.
    HINWEIS: Die folgenden Koordinaten wurden nach dem Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson ermittelt (Anteroposterior: -0,60 cm; mediolateral: 0,58 cm; dorsoventral: -0,16 cm, Abbildung 2A)³².
11. Markieren Sie die genaue Implantationsstelle mit einem Marker.
12. Bohren Sie ein 0,5 mm Loch durch den Schädel an der Zielstelle der Führungskanüle. Bohren Sie 3 weitere Löcher ca. 5 mm um diesen Punkt, um 3 Ankerschrauben in den Schädel einzufädeln, die die Kanüle verfestigen, nachdem Acryl-Zahnzement aufgetragen wurde.
13. Setzen Sie die Kanüle in den Hippocampus ein und fixieren Sie sie mit Zahnzement. Diese Kanüle wird verwendet, um die Sonde in den Bereich von Interesse 7 Tage später während des Mikrodialyse-Verfahrens einfügen. Achten Sie darauf, überschüssigen Zahnzement nicht um die Stelle zu verschütten, wo das Gewicht fallen gelassen wird.
14. Lassen Sie den Zement 2 min trocknen und entfernen Sie dann den Halterarm aus der Kanüle. Setzen Sie einen abnehmbaren Obturator aus Edelstahl in die Kanüle ein, um das Versickern von Zerebrospinalflüssigkeit und Infektionsrisiken zu vermeiden.
15. Entfernen Sie die 4 Klemmen, ziehen Sie die zurückgezogene Haut zurück und nähen Sie sie mit einem chirurgischen Nahtfaden 4-0.
16. Entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und injizieren Sie Buprenorphin subkutan zur Behandlung von Schmerzen (0,05 mg/kg, nach der Operation dann einmal täglich während der folgenden 2 Tage). Legen Sie das Nagetier mit einem Heizkissen wieder in seinen Käfig, bis es bei Bewusstsein ist, und bringen Sie es dann für eine 7-tägige Erholungsphase unter genauer Beobachtung in die Tierpflegeeinrichtung zurück.

3. Mikrodialyseverfahren

1. Tragen Sie während der Mikrodialyse sterile Handschuhe, eine Haarhaube und eine chirurgische Maske. Sieben Tage nach der Cannula-Implantationsoperation die Ratte mit Natriumisofluran (2,5%) befeuchten bei 0,5 l/min Sauerstoffdurchfluss.
2. Entfernen Sie den Obturator aus der Kanüle und setzen Sie langsam eine Mikrodialysesonde ein, durchsetzt mit künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) (26 mmol/L NaHCO₃, 3 mmol/L NaH₂PO₄, 1.3 mmol/L MgCl₂, 2.3 mmol/L CaCl₂, 3.0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-Ascorbinsäure), durch die Kanüle in den Hippocampus oder eine andere Interessenregion.
   HINWEIS: Ratten müssen nur beäscht werden, wenn der Obturator entfernt und die Mikrodialysesonde eingesetzt wird, und während der Induktion einer Gehirnerschütterung oder Einer Scheinverletzung. Die hier verwendeten Sonden sind laborkonstruiert, I-förmig und bestehen aus verschmolzenen seitlichen Kieselsäure-Einlass-Auslasslinien [Innendurchmesser (ID): 50 m] in Polyethylenschläuche (ID: 0,58-0,38 mm). Das Ende der Kanüle ist mit einer Länge der regenerierten Hohlzellulosemembran gesichert [Molekulargewichtsabschaltung: 13 kDa, Außendurchmesser (OD): 216 m; ID: 200 m] mit Cyanoacrylat-Klebstoff und der mit Epoxid versiegelten Spitze. Die aktive Membran misst 2,5 mm für die Implantation im Hippocampus, kann aber entsprechend der Tiefe des Interessenbereichs eingestellt werden. Die Verbindung der innewohnenden Kanüle der Ratte mit der Sonde ist mit einem eingerüsteten, gefädelten Edelstahlkragen gesichert.
3. Befestigen Sie die Sondenbauanbaugruppe an einer Edelstahlfeder, die an einen Flüssigkeitsschwenk- und Gegenausgleichshebelarm gebunden ist, der mit einem Ringständer und Klemmen über dem Käfig aufgehängt ist, damit sich das Tier innerhalb seines Käfigs frei bewegen kann. Tethered Ratten verbringen die gesamte Dauer des Mikrodialyse-Verfahrens mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.
4. Verwenden Sie eine Mikroinfusionspumpe, um Perfusate an die Sonden zu senden, und sammeln Sie das Dialysat aus der geschmolzenen Kieselsäure-Auslassleitung (Totvolumen: 0,79 l).
5. Mindestens 1 h und 30 min vor Beginn des Eingriffs drehen Sie die Sonde auf ihre Arbeitsdurchflussrate (1 l/min). Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der Sonde konsistent ist, indem Sie das Volumen im Zeitverlauf mit einer Pipette messen.
   HINWEIS: Die Durchflussrate kann mehr oder weniger abhängig von den Neurotransmittern gesampelt und der Gehirnregion von Interesse sein. Dialyseproben werden vor, während und nach einer Gehirnerschütterung oder Einer Schandverletzung entnommen. Das Probenahmeintervall hängt von der von Interesse entoselnden Hirnregion, den analysierten Neurotransmittern, den Dialysatkonzentrationen des Analyten und der Empfindlichkeit der verwendeten analytischen Chemiegeräte ab. Die Sammelphasen, die hier im Hippocampus für Glutamat- und GABA-Proben durchgeführt werden, sind wie folgt:
   1. Baseline: Zu Beginn des Experiments Dialyseproben in 10 min Intervallen für 60 min sammeln.
   2. Nach der Gehirnerschütterung oder Scheinverletzung: Sammeln Sie nach einer Gehirnerschütterung oder einer Scheinverletzung Proben für weitere 90 min (9 Proben).
6. Sammeln Sie jede Dialysatprobe in einer Bruchdurchstechflasche, die mit 1 l 0,25 mol/L Perchlorsäure vorbelastet ist, um einen Analytabbau zu verhindern. Bewahren Sie die Proben bei 4 °C für die nachfolgende Analyse auf.
7. Nach der Entnahme der letzten Dialysatprobe die Ratte mit einem Nasenkegel, der Natriumisofluran (2,5%) enthält, erneut anieren bei 0,5 l/min Sauerstoffdurchfluss.
8. Entfernen Sie die Mikrodialysesonde aus der Kanüle, setzen Sie den Obturator wieder ein und bringen Sie die Ratte dann in die Tierpflegeeinrichtung zurück.

4. Installation von Gehirnerschütterungsgeräten

1. Vor Beginn des Verfahrens, schnitzen Sie ein Gewicht verwendet werden, um die Gehirnerschütterung (19 mm im Durchmesser) aus massivem Messing zuzufügen, um eine Masse von 450 g zu erhalten. Legen Sie eine Metallschlaufe an der Oberseite des Messinggewichts. Bohrlöcher vorläufig in einem Abstand von 1,0 m in einem vertikalen Polyvinylchlorid (PVC) Führungsrohr.
2. Schlitzen Sie ein Aluminiumblech mit einer scharfen Rasierklinge. Das geschlitzte Aluminiumblech sollte das Gewicht der Ratte (295 bis 351 g) unterstützen, ohne die Beschleunigung ihres Körpers nach einem Kopfschlag vom Messinggewicht zu stören.
3. Verkleben Sie das geschlitzte Aluminiumblech fest an einem U-förmigen Plexiglasrahmen (38 cm lang x 27 cm breit x 30 cm tief, Figur 3A,B),das ein Schaumstoffkissen (37 cm lang x 26 cm breit x 12 cm tief) enthält.
4. Positionieren Sie den Plexiglasrahmen unter einem PVC-Führungsrohr (20 mm Durchmesser x 1,5 m Länge).
5. Halten Sie das PVC-Führungsrohr mit einem Klemmständer 3,5 cm über dem geschlitzten Aluminium an Ort und Stelle.
6. Befestigen Sie eine Nylonfliegenangelschnur (Kapazität von 9,1 kg, 0,46 mm Durchmesser) durch die Metallschlaufe, so dass der Boden des Gewichts 2,5 cm über dem geschlitzten Aluminium hängt, um mehrere Schläge zu verhindern, wenn die Ratte nach dem Aufprall auf das Schaumkissen fällt.
7. Befestigen Sie die Nylonfliege Angelschnur am Klemmständer.
8. Ziehen Sie das Gewicht durch das PVC-Rohr mit der Nylonfliege Angelschnur dann halten Sie es an Ort und Stelle, indem Sie einen Hex-Schlüssel durch die vorläufigen bohrungen Löcher bei 1,0 m.

5. Gehirnerschütterung Induktion

1. Nach der Ausgangsphase der Dialyseprobenentnahme die Ratte leicht anieren, indem Sie einen Nasenkegel mit Natriumisofluran (2,5 % Isofluran bei 0,5 l/min Sauerstofffluss) so lange auf eine Zehenklemme (wie in Abschnitt 3.1 erwähnt) setzen.
2. Legen Sie das Tier auf die Brust auf das geschlitzte Aluminiumblech, so dass sein Kopf direkt im Pfad des Messinggewichts positioniert ist (Abbildung 3C,D). Halten Sie die Anästhesie mit dem Nasenkegel aufrecht, um sicherzustellen, dass sich die Ratte nicht bewegt oder aufwacht, bevor das Gewicht sie trifft.
3. Entfernen Sie den Nasenkegel und ziehen Sie den Sechskantschlüssel. Das Gewicht fällt vertikal durch das PVC-Rohr und trifft den Kopf der Ratte. Die Ratte wird eine schnelle 180°-Drehung durchlaufen und auf dem Rücken landen (Abbildung 3E).
4. Entfernen Sie die Ratte aus dem Schaumstoffkissen und legen Sie sie auf den Rücken in ihren Käfig.
5. Verwenden Sie einen digitalen Timer, um die richtige Reflexzeit als Zeichen für Erholung und Verletzungsschwere zu messen. Die richtige Reflexzeit ist die gesamtzeitliche Zeit vom Aufprall bis die Nagetiere aufwachen und sich spontan aus der Supine-Position in die anfällige Position besteigen oder mit dem Gehen beginnen. Beachten Sie alle Anzeichen von Tod, Fraktur oder Blutungen.
   HINWEIS: Das Verfahren kann zu einem anderen Thema zu verschiedenen Zeitpunkten für wiederholte Gehirnerschütterungen wiederholt werden.

6. Scheininduktion

1. Nach der Ausgangsphase der Dialyseproben-Entnahme die Ratte leicht anieren, indem Sie einen Nasenkegel mit Natriumisofluran (2,5%) bei 0,5 l/min Sauerstoffstrom, bis er keine Reaktion auf eine Zehenklemme (wie in Abschnitt 3.1 erwähnt) enthält.
2. Legen Sie das Tier auf die Brust auf das geschlitzte Aluminiumblech, so dass sein Kopf direkt im Weg des Messinggewichts liegt. Halten Sie die Anästhesie mit dem Nasenkegel aufrecht, um sicherzustellen, dass sich die Ratte nicht bewegt oder aufwacht.
3. Entfernen Sie den Nasenkegel und entfernen Sie das Tier vom Aluminiumblech, ohne den Sechskantschlüssel zu ziehen. Die Ratte wird keine schnelle 180°-Drehung durchlaufen.
4. Legen Sie die Ratte auf den Rücken in ihren Käfig.
5. Verwenden Sie einen digitalen Timer, um die richtige Zeit als Indikator für die neurologische Wiederherstellung zu messen.

7. Hochleistungs-Flüssigchromatographie

1. Bestimmen Sie die Neurotransmitter-Spiegel (d. h. Glutamat und GABA) durch präkolonnische Derivatisierung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit schneller Fluoreszenzdetektion und einem System, das aus einem schnell getrennten Autosampler und einer gekoppelten Pumpe besteht. auf eine analytische Säule von 3,0 x 50 mm 5 m.
2. Bereiten Sie eine mobile Phase mit 100 mmol/L Natriumphosphatdibasis (Na₂HPO₄), 3,5% Acetonitril und 20% Methanol vor. PH auf 6,7 mit Phosphorsäure einstellen (85%) nach Bedarf.
3. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,5 ml/min ein.
4. Bereiten Sie frische tägliche Derivatisierungsreagenzien und Arbeitsnormen (100 ng/ml) aus Lagerlösungen vor. Mit Proben in einen gekühlten (10 °C) Schnelltrenn-Autosampler geben.
5. Mischen Sie jede Fraktion sequenziell in die analytische Säule mit 20 l 3-Mercaptopropionsäure (0,071 mol/L) verdünnt mit H₂O und 20 l O-Phthaldehyd (0,0143 mol/L) mit 0,1 mol/L Natriumtetraborat verdünnt. Lassen Sie 10 min für die Mischung reagieren.
6. Um eine Kontamination der nächsten Proben zu verhindern, spülen Sie die Injektionsschleife nach jeder Injektion mit Methanol (20 %).
   HINWEIS: Die Glutamat-Retentionszeit würde in diesem Protokoll etwa 1 min betragen, für eine Gesamtlaufzeit von 30 min für jede Probe.
7. Identifizieren Sie bei der Analyse chromatographischer Spitzen unbekannte Spitzen mithilfe von Proben, die dem Zeitpunkt der Aufbewahrung von bekannten Standards entsprechen. Express-Pegel von Analyten als g/mL.

8. Histologie

1. Einen Monat nach dem Mikrodialyseverfahren und der Induktion von Gehirnerschütterungen oder Scheinverletzungen die Tiere durch Injektion eines Cocktails aus Ketamin (70 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal ansien und durch Paraformaldehyd (4%) einschläfern und saline intrakardiale Perfusion.
2. Enthaupten Sie die Nagetiere dann sezieren die Gehirne.
3. Speichern Sie die Gehirne in Paraformaldehyd (4%) und anschließend in einer Saccharoselösung kryoprotectieren (30%).
4. Schneiden Sie die Gehirne in koronalen Abschnitten von 50 m mit einem Kryostat.
5. Färben Sie die Gehirnscheiben mit Kresylviolett zur histologischen Verifizierung von Verletzungen und Sondenplatzierung (Nissl-Färbung).

Ergebnisse

Mit unserem Modell der Gehirnerschütterung, die Kraft und Rotation mit in vivo zerebralen Mikrodialyse kombiniert, wurden die akuten extrazellulären Glutamat- und GABA-Änderungen im Laufe der Zeit nach einer Gehirnerschütterung oder Einer Scheinverletzung bei 21 männlichen, erwachsenen, Sprague-Dawley-Ratten Implantation einer Führungskanüle im CA1-Bereich des Hippocampus.

Histologische Überprüfung der Sondenplatzierung und -verletzung
Nach der histologischen Überprüfung von Hippocampus-Gewebeschäden an Abschnitten, die mit Kresylviolett befleckt sind, wurden keine morphologischen Veränderungen wie massive intracererale Blutungen oder Prellungen berichtet. Guide Cannula Implantation und Mikrodialyse Sonde Insertion induzierte kleinere und ähnliche Schäden zwischen verletzten und Scheinfällen. Darüber hinaus führte das Nichtentfernen der Sonde unmittelbar vor einer Scheinverletzung oder einer Gehirnerschütterungsinduktion zu keiner unterscheidbaren Hippocampus-Gewebeschädigung, wie sie unter dem Mikroskop zu sehen ist (Abbildung2B,Cbzw.), wobei die Membran der Sonde noch intakt ist. danach (Abbildung 2D,E). Gehirnerschütterungen und Scheinverletzungen mit Paraformaldehyd durchsetzt (4%) 1 Monat nach der Mikrodialyse sind die Verfahren bei der Sichtprüfung nicht zu unterscheiden (Abbildung 2F,G).

Richtige Reflexzeit
Tiere aus der verletzten Gruppe hatten eine signifikant erhöhte Richtigeimzeit im Durchschnitt im Vergleich zu Scheinfällen (Studenten-t-Test, p = 0,042801) (Abbildung 4) und schienen fassungslos, als sie das Bewusstsein wiedererlangten. Von den 10 Fällen aus der Gehirnerschütterungsgruppe zeigte ein einzelnes Tier nach dem Gewichtsverlust unter der Aufprallstelle leichte Blutungen. Es wurden keine anderen Anzeichen einer Schädelfraktur oder intrakraniellen Blutung beobachtet.

In vivo zerebrale Mikrodialyse
Als repräsentative Ergebnisse unserer Methode wurden fünfzehn 10-L-Proben von Dialysat aus dem Hippocampus, in vivo, in Intervallen von 10 min und einer Durchflussrate von 1 l/min extrahiert. Extrazelluläre Glutamat- und GABA-Werte wurden aus 6 Proben während der Baseline gemessen ( 60 min) und von 9 Proben nach Induktion von Scheinverletzungen oder Gehirnerschütterung (90 min).

Extrazelluläre Konzentrationen von Glutamat
In den ersten 10 min nach der Induktion eines Traumas wurden in den ersten 10 min nach der Induktion eines Traumas signifikante Anstiege der extrazellulären Glutamatkonzentrationen beobachtet (Mann-Whitney U Test, p = 0.009175) (Abbildung 5). Zu keinem anderen Zeitpunkt wurden weitere Unterschiede in den Glutamatkonzentrationen zwischen den Gruppen beobachtet.

Extrazelluläre Konzentrationen von GABA
In den ersten 10 min nach der Induktion eines Traumas wurden keine signifikante Veränderung der GABA-Konzentrationen im CA1-Bereich des Hippocampus beobachtet (Mann-Whitney U Test, p = 0,943861) (Abbildung 6). Es gab keinen anderen signifikanten Unterschied in gabA-Konzentrationen zu einem anderen Zeitpunkt zwischen Gehirnerschütterung Fälle und Schein-Verletzung Fälle.

Abbildung 1: Schematische Gliederung des Forschungsprotokolls. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Histologische Überprüfung der Sondenplatzierung und -verletzung. (A) Koronale Ansicht der Mikrodialysesonde und der Leiterkanülenplatzierungsstelle im Hippocampus unter Verwendung des stereotaxic Atlas von Paxinos und Watson. (B) Repräsentative Photomik der Hippocampus-Gewebeschädigung (Cresylviolett), die von einer Mikrodialysesonde und einer Führungskanüle aus einem Scheinverletzungsfall erzeugt wird. (C) Repräsentative Photomik der Hippocampus-Gewebeschädigung (Kresylviolett), die von einer Mikrodialysesonde und einer Führungskanüle aus einem Gehirnerschütterungsfall erzeugt wird. (D) Repräsentativer Photomikroskop einer Mikrodialysesonde vor der Induktion einer Gehirnerschütterung. (E) Repräsentativer Photomikroskop einer Mikrodialysesonde nach Induktion einer Gehirnerschütterung. Die Membran ist noch intakt. (F-G). Repräsentative Photomikroskopie eines Scheins (F) und einer Gehirnerschütterung (G) verletzte das Gehirn nach perfusionmit 4% Paraformaldehyd bei 1 Monat nach Einer Scheinverletzung oder gehirnerschütterung. Bei der Sichtkontrolle sind die beiden Gehirne nicht zu unterscheiden. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Gehirnerschütterungsapparat und Mikrodialyse instrumente wesentliche Komponenten Darstellungen. (A) Ein Foto der gesamten Baugruppe bestehend aus einem vertikalen Polyvinylchlorid (PVC) Führungsrohr für das fallende Gewicht oberhalb der Rattenstufe, Plexiglasrahmen, Schaumstoffkissen, computergesteuerte Mikroinfusionspumpe, gasdichte Spritzen, Flüssigkeit Schwenks und side-by-side verschmolzene Kieselsäure-Einlass-Outlet-Linien. (B) Schematische Darstellung des Plexiglasrahmens und Schaumkissens mit allen relevanten Abmessungen. (C) Ein Foto des geschlitzten Stücks Ausaluminiumfolie, das als Rattenstufe über dem Schaumstoffkissen dient. (D) Ein Foto, das die Positionierung der Ratte auf der Bühne unmittelbar vor dem Kopfaufprall durch das fallende Gewicht zeigt. (E) Ein Foto, das die Ratte nach einem Kopfaufprall zeigt, das die 180° horizontale Drehung des Körpers der Ratte nach dem Kopfaufprall und der anschließenden Beschleunigung und Drehung veranschaulicht. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Richtige Zeit. Histogrammdarstellungen der Zeit, die Ratten nehmen, um aus dem Anästhetikum aufzuwachen und von der Supine-Position in die anfällige Position zu kippen oder nach einer Gehirnerschütterung (rote Diamanten, n = 10) oder Scheinverletzungen (blaue Quadrate, n = 11) zu gehen. Ratten aus der Gehirnerschütterungsgruppe brauchten im Vergleich zur Scheinverletzungsgruppe deutlich länger, um sich zu rechtzufinden. Mittelwerte werden in jedem Diagramm als horizontale Linie dargestellt. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Extrazelluläre Konzentrationen von Glutamat. Mittlere extrazelluläre Konzentrationen von Glutamat (g/ml), gemessen durch Mikrodialyse im Hippocampus während der Ausgangsbasis (60 min) und nach einer Gehirnerschütterung (rote Diamanten, n = 10) oder Scheinverletzungen (blaue Quadrate, n = 11) Bedingungen (90 min). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Extrazelluläre Konzentrationen von GABA. Mittlere extrazelluläre Konzentrationen von GABA (g/ml), gemessen durch Mikrodialyse im Hippocampus während der Ausgangsbasis (60 min) und nach einer Gehirnerschütterung (rote Diamanten, n = 10) oder Scheinverletzungen (blaue Quadrate, n = 11) Bedingungen (90 min). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Diese Zahl wurde von IO Masse 2018 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Für die Generierung zuverlässiger Ergebnisse erfordern kritische Schritte in diesem Protokoll besondere Aufmerksamkeit. Vermeiden Sie während der Cannula-Implantationsoperation die Verwendung von mehr Zement als nötig, insbesondere wenn es sehr flüssig ist, um ein Übergreifen der Aufprallstelle zu verhindern. Um eine Blockierung der Implantationsstelle zu vermeiden, verwenden Sie einen Obturator, der die gleiche Länge wie die Kanüle hat. Legen Sie die Sonde während des Mikrodialyseverfahrens langsam in die Kanüle ein und stellen Sie sicher, dass sie vollständig für die Dialysatprobe eingesetzt wird. Stellen Sie vor der Gehirnerschütterungsinduktion sicher, dass das Aluminiumblech ordnungsgemäß mit einer scharfen Rasierklinge geschlitzt ist. Andernfalls wird der Aufprall aus dem Messinggewicht nicht ausreichen, um das Aluminiumblech zu reißen und die Ratte bleibt Brust nach unten, anstatt eine 180°-Drehung zu durchlaufen und auf dem Rücken zu landen. Wenn dies der Fall ist, werden die induzierten Verletzungen durch den stumpfen Aufprall resultieren, nicht unähnlich dem, was in den Open-Skull-Gewichtsabfallmodellen zu sehen ist und deutlich schwerer sein. Vermeiden Sie während der Gehirnerschütterung sukzesse, die Kanüle mit dem Gewicht zu beeinflussen, da dies zu kritischen Schäden am Schädel der Ratte führen würde. Es wird dringend empfohlen, in Teams von 2 zu arbeiten, um Manipulationsfehler während des Experiments zu beschränken.

Änderungen und Fehlerbehebung
Während des Mikrodialyseverfahrens sollte der Durchfluss konstant sein und ein Volumen ergeben, das der Perfusionsrate entspricht, sobald die Sonde mit der Pumpe verbunden ist. Geringere Volumina können auf das Vorhandensein von Verstopfungen in der Membran der Sonde oder Luftblasen in den Leitungen hinweisen. Im Falle einer Verstopfung sollte die Sonde verworfen und ersetzt werden. Luftblasen können jedoch durch zirkulierendes ACSF in den Leitungen ausgestoßen werden. Wenn keine Verstopfung oder Luftblasen festgestellt werden und es immer noch keinen Durchfluss gibt, kann ein kleiner Teil des Abflussrohrs, das am Ende liegt, geschnitten werden.

Einschränkungen der Methode
Andere Studien mit dem Gewicht-Drop der Wayne State University haben einige grundlegende strukturelle und molekulare Veränderungen bewertet¹⁸. Eine umfassendere Untersuchung würde jedoch die Legitimität dieses Verfahrens aufrechterhalten. Informationen über die biologischen und neuroanatomischen Veränderungen, die auf epigenetischer und zellulärer Ebene stattfinden, würden den zuverlässigen und translationalen Wert unserer Methode weiter verfestigen. Darüber hinaus ist die Bewertung der kognitiven Funktion ein zuverlässiges Maß für das Ergebnis im Zusammenhang mit mTBI in Nagetiermodellen³³. Während die Rechtszeit in diesem Protokoll gemessen wurde und sich in Verletztenfällen im Vergleich zu Scheinfällen signifikant verzögerte, sollten sich Die Studien in Zukunft auf die methodische Messung der kognitiven Funktion nach der Traumainduktion bei Nagetieren konzentrieren.

Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden.
Die Hauptbedeutung der Methode ist zweifach: Erstens ermöglicht es die erfolgreiche Induktion einer Gehirnerschütterung mit dem Wayne State University Verfahren, das eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper ermöglicht. Bei dieser Methode wurden schwerwiegende Verletzungen wie Herz-Kreislauf-Absetzen, Schädelfraktur, hohe Sterblichkeit und Anzeichen von sichtbaren Hirnvertiefungen an der Aufprallstelle vermieden. Zweitens hat diese Mikrodialysetechnik die zuvor nachgewiesene akute und kurzlebige extrazelluläre Glutamatfreisetzung innerhalb der ersten 10 min nach Traumainduktion^14,16erfolgreich repliziert. Darüber hinaus reduziert die Beibehaltung der Sonde während des gesamten Verfahrens die Wahrscheinlichkeit, dass die mTBI-empfindliche Blut-Hirn-Schranke im Zusammenhang mit wiederholter Mikrodialyse-Sonde^{Insertion 34}beschädigt wird, erheblich.

Zukünftige Anwendungen oder Anweisungen der Methode.
Angesichts der einfach zu bedienenden Aspekte des Gewichtsabnahmeverfahrens der Wayne State University und der akuten extrazellulären Neurotransmitter-Niveauänderungen, die durch Mikrodialyse gemessen werden, bietet unser Rattenmodell, das Mikrodialyse und Gehirnerschütterung kombiniert, Forschern eine zuverlässige Werkzeug, um die Biomechanik des menschlichen Schädel-Hirn-Traumas originalgetreu zu reproduzieren und die molekularen Wirkungen von Gehirnerschütterungen längs zu charakterisieren. Unser Rattenmodell könnte auch in einer Vielzahl von therapeutischen Studien verwendet werden, da es eine wertvolle Gelegenheit bietet, den Mechanismus und die Wirksamkeit von pharmakologischen Wirkstoffen in vivo kontinuierlich und ohne das Tier opfern zu müssen. Darüber hinaus könnte die Verfügbarkeit eines Rattenmodells wie des hier vorgestellten das bessere Verständnis der Beziehung zwischen den Neurotransmitter-Ungleichgewichten und den Verhaltensfolgen von Gehirnerschütterungen erheblich erleichtern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer