Роман и переводная модель крысы сотрясения, сочетающая силу и вращение с микродиализом в Vivo

Резюме

Нейромедиатор изменения является механизмом нервной дисфункции, которая возникает после сотрясения мозга и способствует иногда катастрофические долгосрочные последствия. Эта крысиная модель сочетает в себе микродиализ, позволяя in vivo нейромедиатор количественной оценки, с падением веса техника оказывает быстрое ускорение и замедление головы и туловища, важный фактор травмы черепно-мозговой травмы человека.

Аннотация

Устойчивые когнитивные и двигательные симптомы известны последствия сотрясения мозга / мягкой черепно-мозговой травмы (MTBIs), которые могут быть частично связаны с измененной нейротрансмиссии. Действительно, исследования микродиализа головного мозга у грызунов продемонстрировали чрезмерное внеклеточное высвобождение глутамата в гиппокампе в течение первых 10 минут после травмы. Микродиализ предлагает явное преимущество in vivo нейромедиатора непрерывной выборки, не жертвуя животным. В дополнение к вышеупомянутой технике, закрытая модель травмы головы, которая оказывает быстрое ускорение и замедление головы и туловище не требуется, так как такой фактор не доступен во многих других животных моделей. Модель падения веса штата Уэйн имитирует этот важный компонент черепно-мозговой травмы человека, что позволяет индукцию воздействия на голову безудержного грызуна с падающим весом. Наша новая и переводная модель крыс сочетает в себе микродиализ головного мозга с моделью падения веса штата Уэйн для изучения, в слегка обезболиваенных и безудержных взрослых крыс, острые изменения в внеклеточных уровнях нейромедиатора после сотрясения мозга. В этом протоколе, микродиализ зонд был вставлен внутри гиппокампа, как область интереса, и был оставлен вставлен в мозг при ударе. Существует высокая плотность терминалов и рецепторов в гиппокампе, что делает его соответствующим регионом для документирования измененной нейротрансмиссии после сотрясения мозга. При применении к взрослым Крысам Спраг-Доули, наша комбинированная модель индуцированных увеличивается в гиппокампе внеклеточного концентрации глутамата в течение первых 10 минут, в соответствии с ранее сообщалось после сотрясения симптомологии. Эта комбинированная модель падения веса обеспечивает надежный инструмент для исследователей для изучения ранних терапевтических реакций на сотрясения мозга в дополнение к повторяющейся травмы головного мозга, так как этот протокол вызывает закрытую голову легкой травмы.

Введение

Цель этого метода заключается в предоставлении исследователям надежного инструмента, который точно воспроизводит биомеханику черепно-мозговой травмы человека, позволяя продольную характеристику молекулярных эффектов сотрясения мозга/мягкого черепно-мозгового мозга травмы (MTBIs). Этот метод сочетает в себе микродиализ головного мозга с Уэйн государство падение веса модели документ, в слегка обезображенных и безудержных взрослых крыс, острые изменения в внеклеточных уровней нейромедиатора после сотрясения мозга. С помощью этого минимально инвазивного метода, нейротрансмиттеров, таких как глутамат, ГАМК, таурин, глицин и серин может быть быстро и непрерывно количественно после травмы, in vivo, в то время как не жертвуют животным.

Сотрясение мозга/mTBI является патофизиологическим нарушением, которое влияет на функционирование мозга, вызванное внешним механизмом силы. Сотрясение мозга/мТБИ является наиболее распространенной формой черепно-мозговойтравмы, на которую приходится 70-90% случаев 1. Большинство острых функциональных нарушений после сотрясения мозга можно отнести к первичной и вторичной черепно-мозговой травме^2,3: (1) первичная черепно-мозговая травма вызвана быстрым ускорением и замедлением головы и туловища который повреждает ткани мозга путем сжатия с последующим растяжением и стрижки аксонов во время реакции^4,5,6 и (2) вторичной черепно-мозговой травмы является косвенной клеточной реакции на травму. Оно осуществляет часы и дни после первичной ушиба мозга и играет важную роль в моторике и познавательных ухудшения наблюдаемых над временем. Многие из симптомов можно отнести к измененной нейротрансмиссии, такие как ранее продемонстрировали чрезмерное внеклеточное глутамата релиз в первые 10 минут после травмы^7,8,9. Учитывая высокую плотность терминалов и рецепторов, гиппокамп является структурой мозга, особенно уязвимой к этой excitotoxic ответ после травмы. Будучи активно участвует в когнитивной функции^10,11, исследования у грызунов сообщили, что гиппокампа ущерб, связанный с сотрясением мозга может привести к нарушениям в страхе кондиционирования и обучения пространственной памяти^{12 , 13}. Основная цель этой методологии заключалась в том, чтобы выработать крысиную модель сотрясения мозга/mTBI, используя процедуру падения веса штата Уэйн, чтобы точно воспроизвести механизмы первичной черепно-мозговой травмы, и включить церебральный микродиализ для изучения in vivo, острый внеклеточный нейромедиатор изменяется из-за вторичной черепно-мозговой травмы после сотрясения мозга. Концентрации внеклеточного глутамата и ГАМК были измерены в гиппокампе, чтобы выступать в качестве репрезентативного результата нашего метода.

Предыдущие исследования грызунов объединили микродиализ и другие модели травм, таких как падение веса с открытым черепом и контролируемое корковое воздействие, чтобы продемонстрировать острые изменения в внеклеточных уровнях нейромедиатора после травмы различной степени тяжести степени^14,15,16,17. Однако, в дополнение к высокой степени изменчивости, переводное значение моделей, таких как падение веса с открытым черепом и контролируемое воздействие корковой, сдерживается присущим ему отсутствием экологической достоверности из-за 2 факторов: (1) эти модели вызывают травмы более тяжелым, чем связанные со спортом сотрясения пострадали у людей, с участием прямой загрузки мозга и (2) эти модели требуют краниэктомии или краниотомии, голова грызуна полностью сдерживается в стереотаксической раме, препятствуя быстрой ускорение и замедление головы и туловище, тем самым плохо воспроизводя биомеханику сотрясения мозга.

Микродиализ является минимально инвазивным методом, который предлагает явное преимущество проб нейротрансмиттеров, таких как глутамат, ГАМК, таурин, глицин и серин, in vivo и непрерывно после травмы, при этом не жертвуя животным. В дополнение к преимуществам, предлагаемым микродиализом, Университет штата Уэйн разработал модель падения веса с закрытым черепом (в отличие от открытых черепов из других моделей), которая позволяет индукцию mTBI на слегка обезглавленном и безудержном грызуне, таким образом, что позволяет быстрое ускорение и замедление головы и туловище¹⁸. Как упоминалось ранее, ускорение и замедление головы и туловища является основной биомеханической особенностью спортивных сотрясений, наблюдаемых у людей, которые предыдущие модели грызунов mTBI не смогли решить. Процедура падения веса может быть выполнена очень быстро и не требует предварительной операции или разреза головы. После индукции сотрясения мозга грызуны восстанавливают выправляющийся рефлекс почти спонтанно и не испытывают паралича, судорог или дыхательного дистресса после одного удара. Внутричерепные кровотечения и переломы черепа встречаются редко, и у грызунов были зарегистрированы лишь незначительные дефициты двигательной координации. Эта модель крыс проста в использовании, недорогой и облегчает количественную оценку нейротрансмиттеров, выпущенных в острой фазе после сотрясения мозга без удаления микродиализа зонда во время удара.

Наша крысиная модель, сочетающая микродиализ и сотрясение мозга, подходит для исследователей, стремящихся охарактеризовать продольно молекулярные эффекты сотрясения мозга и может быть использована в самых разнообразных терапевтических исследованиях. Действительно, несмотря на несколько лет исследований и подавляющее потребность, ни один препарат для предотвращения долгосрочных последствий сотрясения мозга прошел фазу клинических испытаний¹⁹. Одной из потенциальных причин этих неудач может быть использование моделей животных, которые не точно воспроизводят травматические биомеханические силы сотрясений, как это испытывают люди. Представленный здесь метод соответствует определению сотрясений мозга человека, которое указывает на то, что первичная черепно-мозговая травма вызвана тупым ударом, а также быстрым ускорением и замедлением головы и туловища^2,3.

Кроме того, наша комбинированная модель подходит для исследователей, изучающих последствия повторной легкой черепно-мозговой травмы (rmTBI), так как одна из его ключевых характеристик, которая отличает его от других животных моделей сотрясения мозга является то, что это позволяет вызвать повторяется, легкие травмы в том же случае¹⁸. У людей, rmTBI связано с более тяжелыми посттравматическими симптомами, больше времени восстановления, и отягчающих двигательных и когнитивных нарушений, которые, как правило, распространяются в течение времени^20,21. Другие соответствующие модели животных также позволили лучше понять посттравматическую патофизиологию rmTBI^{22,23,24,25,26,27} . Повышенная уязвимость мозга была продемонстрирована у грызунов после минимум 5 мТБС с интервалом 24 ч. Нейровоспаление увеличивается с числом mTBI опытных и маркеры нейродегенерации появляются²⁸. Повторный mTBI предотвратит переход микроглии из провоспалительного режима в нормальный режим восстановления, что приводит к длительной экзитототостоксической активности и активации нейродегенеративных механизмов ^29. С нашей моделью, крысы могут подвергаться 1 воздействие в день в течение 1 недели в общей сложности 5 экспозиций. Учитывая простоту этой модели животных, это может облегчить характеристику кумулятивного воздействия острого неизбирательного высвобождения нейромедиатора, возникающего сразу после mTBI.

Эта модель также позволяет животным быть легко подвержены 2 воздействия в день, что позволяет изучить еще более тяжелые условия, такие как, когда спортсмен получает еще одно травматическое воздействие в течение короткого времени с первого удара³⁰. Как было продемонстрировано в предыдущем исследовании³¹, сроки второго удара по голове может резко повлиять на повреждения сосудов и аксональных. Чем ближе второй удар к первому удару, тем более разрушительные последствия. Эта модель подходит для исследования, как это конкретное условие влияет на внеклеточный нейромедиатор релиз.

В этом методе, гиппокамп был использован в качестве региона интереса из-за его релевантности в исследованиях сотрясения мозга, но пробы микродиализа могут быть собраны из других регионов, представляющих интерес, а также. Тем не менее, любой другой области мозга должен быть рассмотрен из-за пространства, оставленного место удара от руководства канюли, в том числе зубной цемент вокруг него, может занять значительное количество места на голове крысы. В дополнение к этому, параметры микродиализа, представленные в этом методе, такие как молекулярное отсечение веса мембраны и активная длина, интервалы отбора проб и скорость потока могут быть скорректированы в зависимости от типа изученной молекулы. Эффективная коллекция провоспалительных цитокинов, участвующих в сотрясениямозга, например, потребует мембраны с гораздо большим размером пор.

протокол

Протокол для этого проекта получил одобрение Комитета по уходу за животными Хопитал дю Сакре-Кур-де-Монреаль в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический контур протокола исследования представлен на рисунке 1.

1. Подготовка животных

1. Закажите крыс Sprague-Dawley у стандартного поставщика лабораторных животных, который будет доставлен в возрасте от 43 до 50 дней и весом от 151 до 200 г.
2. Дом все крысы индивидуально в цикле 12:12 ч свет: темнота, при 24-26 градусов по Цельсию с ад libitum доступ к воде и пище.
3. В течение 2 недель до начала протокола, обрабатывать крыс в течение 5 минут на ежедневной основе, чтобы облегчить их привыкание в контакте с исследователями. Крысы должны быть в возрасте около 10 недель, и их вес должен быть между 295 и 351 г во время сотрясения мозга или фиктивной индукции травмы.

2. Микродиализ Руководство Каннула имплантации хирургии

1. Выполните операцию в стерильных условиях. Носите стерильные перчатки, капот для волос и хирургическую маску на протяжении всей процедуры. Автоклав и стерилизовать все материалы и хирургические инструменты заранее. Чистота и дезинфекция рабочей области и стереотаксического аппарата тщательно с раствором этанола (70%).
2. Анестезия животных путем введения коктейля из кетамина (70 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) интраперитоне. Осас обезопаживглубин глубину, проверяя рефлекс на нос.
3. Удалить мех с головы животного с помощью электрических клиперов. Чистая бритая голова с помощью раствора 2% изопропилового спирта и 2% хлоргексидина глюконата (3 раза). Нанесите смазочную глазную мазь во время анестезии, чтобы предотвратить сухость.
4. Drape-офф хирургического поля так, что только голова животного подвергается. Поместите голову крысы в стереотаксический аппарат, вставьте ушные прутья в ушные каналы с большой осторожностью, а затем затяните зажим носа. Исправить 26 G нержавеющей стали направляющий канюля на держатель руку на стереотаксическом аппарате.
5. Местно вводят анестезируемый коктейль из бупивакаина (1,5 мг/кг) и лидокаина (1,5 мг/кг) подкожно на голову, за 10 мин до разреза.
6. Поддержание анестезии в течение всей процедуры путем доставки изофруран натрия (2,5%) при 0,5 л/мин поток кислорода с носовым конусом.
7. Сделайте разрез средней линии (3 см) вдоль кожи головы скальпелем. Оставьте череп ясным, установив 4 зажимы вокруг разреза.
8. Очистите твердо периостеум из черепа с хирургическим лезвием, пока брегма и Ламбда швы видны. Поддерживайте твердое давление на череп с марлевой подушечкой или хлопчатобумажным наконечником аппликатора, если есть кровотечение.
9. Подтвердите, правильно ли выровнен череп на стереотаксическом аппарате, сравнив дорсовентальные координаты швов Брегмы и Ламбды. Определите anteroposterior, посредственые и дорсовентральные координаты шова Брегма в качестве ориентиров для координат направляющей канюли.
10. Принимая координаты шва Брегма в качестве справок, вычислите координаты сайта имплантации направляющей канюли в гиппокампе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие координаты были определены в соответствии с атласом мозга крысы от Paxinos и Watson (anteroposterior: -0.60 cm; посредственными: 0.58 cm; dorsoventral: -0.16 cm, Рисунок 2A)³².
11. Отметьте точное место имплантации с помощью маркера.
12. Просверлите отверстие калибра 0,5 мм через череп в целевом месте направляющей канюли. Просверлите 3 других отверстия приблизительно 5 мм вокруг этой точки к винтам резьбы 3 якоря в череп который затвердеет канюли после того как акриловый зубной цемент приложен.
13. Вставьте канюлю в гиппокамп и зафиксировать его зубным цементом. Эта канюля будет использоваться для вставки зонда в область интереса 7 дней спустя во время процедуры микродиализа. Будьте осторожны, чтобы не пролить избыток зубного цемента вокруг сайта, где вес будет сброшен.
14. Оставьте цемент высохнуть в течение 2 мин, затем снимите руку держателя из канюли. Вставьте нержавеющей стали удаления обтуратора в канюле, чтобы избежать просачивания спинномозговой жидкости и риски заражения.
15. Удалите 4 зажимы, отодвить втягиваенные кожи и сшить его с хирургическим швом нить 4-0.
16. Удалить крысу из аппарата и ввести бупренорфин подкожно для лечения боли (0,05 мг/кг, после операции, то один раз в день в течение следующих 2 дней). Поместите грызуна обратно в клетку с грелкой под, пока он не станет сознательным, а затем вернуть его в животное учреждение в течение 7 дней периода восстановления под тщательный контроль.

3. Процедура микродиализа

1. Во время выполнения процедуры микродиализа носите стерильные перчатки, капот для волос и хирургическую маску. Через семь дней после операции по имплантации канюли, анестезия крысы с изофруран натрия (2,5%) при 0,5 л/мин потока кислорода.
2. Удалить обтуратор из канюли и вставить медленно микродиализ зонд, посыпанной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) (26 ммоль / L NaHCO₃, 3 ммоль / Л₂PO₄, 1,3 мольта / L MgCl₂, 2,3 ммоль / L CaCl₂, 3.0 ммоль/L KCl, 126 ммоль/L NaCl, 0,2 ммоль/Л-аскорбиновая кислота), через канюлю в гиппокамп или другой интересуемый регион.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы должны быть под анестезией только при удалении обтуратора и вставки микродиализа зонд, а также во время индукции сотрясение мозга или фиктивные травмы. Используемые здесь зонды построены в лабораторных рамках, i-образные, и состоят из слитых бок о бок линий выхода кремнезема (внутренний диаметр) 50 мкм, заключенных в полиэтиленовые трубки (ID: 0,58-0,38 мм). Конец канюли закреплен длиной регенерированной полой целлюлозной мембраны «молекулярный вес отсечения: 13 кДа, внешний диаметр (OD): 216 мкм; ID: 200 мкм с использованием цианоакрилата клея и наконечника запечатаны эпоксидной смолой. Активная мембрана измеряет 2,5 мм для имплантации в гиппокампе, но может быть скорректирована в зависимости от глубины интересуемых регионов. Соединение обитающей канюли крысы с зондом закреплено с помощью установленного, резьбового воротника из нержавеющей стали.
3. Исправить сборку зонда из нержавеющей стали весной привязывается к жидкой поворотной и противовес рычаг рычага приостановлено над клеткой с кольцом стенд и зажимы, так что животное может свободно перемещаться в своей клетке. Привязанные крысы проводят всю продолжительность процедуры микродиализа с доступом к воде и пище ad libitum.
4. Используйте микроинфузионный насос, чтобы отправить perfusate к зондам, и собирать диализат от сливки розетки линии (мертвый объем: 0,79 л).
5. По крайней мере, за 1 ч и 30 мин до начала процедуры, включите зонд к его скорости рабочего потока (1 л/мин). Убедитесь, что скорость потока зонда соответствует измерению объема с течением времени с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока может быть более или менее в зависимости от нейротрансмиттеров выборки и области мозга, представляющих интерес. Образцы диализа берутся до, во время и после сотрясения мозга или фиктивной индукции. Интервал отбора зависит от области мозга, представляющих интерес, нейротрансмиттеров анализируется, диализируют концентрации анализа, и чувствительность аналитического химического оборудования используется. Сбор фаз, сделанных здесь, в гиппокампе для пролитамата и ГАМК выборки являются следующими:
   1. Базовый униза: В начале эксперимента собирайте образцы диализа с интервалом 10 минут в течение 60 минут.
   2. После сотрясения мозга или фиктивной травмы: После сотрясения мозга или фиктивной травмы, собирать образцы для дополнительных 90 мин (9 образцов).
6. Соберите каждый образец диализата в фракционный флакон, предварительно загруженный 1 л 0,25 мл/л перхлорной кислоты, чтобы предотвратить деградацию анализатора. Храните образцы при 4 градусах по Цельсию для последующего анализа.
7. После сбора последнего образца диализата, повторно анестезируйте крысу конусом носа, доставляющим изофруран натрия (2,5%) при 0,5 л/мин потока кислорода.
8. Удалить микродиализ зондиз из канюли, повторно вставить обтуратор, а затем вернуть крысу в животное учреждение.

4. Установка аппарата сотрясения мозга

1. Перед началом процедуры, вырезать вес, который будет использоваться для нанесения сотрясение мозга (19 мм в диаметре) из твердой латуни для получения массы 450 г. Вставьте металлическую петлю в верхней части латуни вес. Просверлить отверстия предварительно на расстоянии 1,0 м внутри вертикальной поливинилхлорида (ПВХ) направляющей трубки.
2. Прорезай алюминиевый лист острым лезвием бритвы. Прорези алюминиевый лист должен поддерживать вес крысы (295 до 351 г), не мешая ускорению ее тела после удара головой от веса латуни.
3. Лента прорези алюминиевый лист плотно U-образный plexiglas кадр (38 см в длину х 27 см в ширину х 30 см глубиной, рисунок 3A,B), который содержит пену подушку (37 см в длину х 26 см в ширину х 12 см в глубину).
4. Расположите раму Plexiglas под направляющей трубкой из ПВХ (диаметр 20 мм x 1,5 м длины).
5. Держите направляя трубку ПВХ на месте с зажимом стенда 3,5 см выше прорези алюминия.
6. Прикрепите леску на нейлоновой мухе (емкость 9,1 кг, диаметр 0,46 мм) через металлическую петлю так, чтобы дно веса висело на 2,5 см над прорезом алюминия, чтобы предотвратить несколько попаданий, когда крыса падает на подушку пены после удара.
7. Прикрепите нейлоновую леску к зажимной.
8. Поднимите вес через трубку ПВХ с нейлоновой летать лески затем держать его на месте, вставив ключ hex через предварительные пробуренные отверстия на 1,0 м.

5. Индукция сотрясения мозга

1. После базовой фазы сбора образцов диализа, повторно анестезируйте крысу слегка, поставив носовой конус доставки изофлуран натрия (2,5% изолюран на 0,5 л / мин кислородного потока) до тех пор, пока он как никакой ответ на щепотку ног (как упоминалось в разделе 3.1).
2. Поместите животное на грудь на прорези алюминиевого листа так, что его голова расположена непосредственно на пути вес латуни(Рисунок 3C,D). Поддержание анестезии с конусом носа, чтобы убедиться, что крыса не двигаться или пробуждения, прежде чем вес поражает его.
3. Снимите конус носа и потяните ключ hex. Вес будет падать вертикально через трубку ПВХ и удар по голове крысы. Крыса будет проходить быстрое 180 "вращение и приземлиться на спине (Рисунок 3E).
4. Снимите крысу с пенной подушки и поместите ее на спину в клетке.
5. Используйте цифровой таймер для измерения правильного рефлектологического времени в знак тяжести восстановления и травмы. Выпрыгивая рефлекс время общее время от удара, пока грызуны проснуться и спонтанно право себя в положение склонен от положения на спине, или начать ходить. Обратите внимание на любые признаки смерти, перелома или кровотечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть повторена на том же предмете в разные моменты времени для повторных сотрясений мозга.

6. Шам Индукция

1. После базовой фазы сбора образцов диализа, повторно анестезируйте крысу слегка, поставив носовой конус, доставляющий изолюран натрия (2,5%) на 0,5 л/ мин потока кислорода до тех пор, пока он не будет реагировать на щепотку нос (как упоминалось в разделе 3.1).
2. Поместите животное на грудь на прорези алюминиевого листа так, что его голова лежит прямо на пути латуни веса. Поддержание анестезии с конусом носа, чтобы убедиться, что крыса не двигается или пробуждения.
3. Снимите конус носа и удалите животное из алюминиевого листа, не потянув ключ hex. Крыса не будет проходить быстрое вращение 180 градусов.
4. Поместите крысу на спину в клетку.
5. Используйте цифровой таймер для измерения времени исправления в качестве индикатора неврологического восстановления.

7. Высокопроизводительная жидкая хроматография

1. Определить уровни нейромедиатора (т.е. глутамата и ГАМК) путем предварительной производно-производно-продиспантатора с использованием высокопроизводительной жидкой хроматографии с быстрым обнаружением флуоресценции разделения, а также системы, состоящей из быстрого разделения автосэмпера и насоса в сочетании до аналитической колонки 3,0 х 50 мм 5 мкм.
2. Подготовьте мобильную фазу с дибасцией фосфата натрия 100 ммоль/л (Na₂HPO_4),3,5% ацетонитрила и 20% метанола. Отрегулируйте рН до 6,7 с помощью фосфорной кислоты (85%) по мере необходимости.
3. Установите скорость потока до 0,5 мл/мин.
4. Подготовка свежих ежедневных реагентов и рабочих стандартов (100 нг/мл) из биржевых растворов. Загрузите их в рефрижераторный (10 градусов по Цельсию) быстрый автоматический сечение с образцами.
5. Смешайте каждую фракцию последовательно в аналитическую колонку с 20 qL 3-меркаптопропионной кислоты (0,071 моль/л), разбавленной H₂O и 20 Л о-фальдегида (0,0143 мол/л), разбавленной 0,1 моль/л тетраборатна натрия. Разрешить 10 минут для смеси реагировать.
6. Чтобы предотвратить загрязнение следующих образцов, промойте петлю инъекций метанолом (20%), после каждой инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время удержания глутамата будет 1 мин примерно в этом протоколе, для общего времени выполнения 30 минут для каждого образца.
7. При анализе хроматографических пиков выявлять неизвестные пики с использованием образцов, соответствующих времени удержания от известных стандартов. Экспресс-уровни аналитов как мкг/мл.

8. Гистология

1. Через месяц после процедуры микродиализа и сотрясения мозга или индукции прививок от прививок, анестезируя животных путем введения коктейля из кетамина (70 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) интраперитонеи и эвтаназии их параформальдегидом (4%) и солевые интракардиа.
2. Обезглавить грызунов, а затем вскрыть мозг.
3. Храните мозги в параформальдегиде (4%) и впоследствии криозащиту их в растворе сахарозы (30%).
4. Нарежьте мозги в корональных сечениях 50 мкм криосатом.
5. Пятно мозг ломтиками с кресилфиолетовым для гистологической проверки травмы и зонд размещения (Nissl окрашивания).

Результаты

Используя нашу модель сотрясения мозга, которая сочетает в себе силу и вращение с in vivo мозгового микродиализа, острый внеклеточный глутамат и ГАМК изменения с течением времени после сотрясения мозга или фиктивной травмы были исследованы в 21 мужчин, взрослых, Sprague-Dawley крыс имплантация направляющей канюли в регионе CA1 гиппокампа.

Гистологическая проверка размещения зонда и травмы
Никаких морфологических изменений, таких как массовые внутримозговые кровоизлияния или ушибы не было зарегистрировано после гистологической проверки повреждения тканей гиппокампа на участках, окрашенных крезилфийным. Руководство канюли имплантации и микродиализа зонда вставки индуцированных незначительные и аналогичные повреждения между ранеными и фиктивных случаях. Кроме того, не удаление зонда прямо перед фиктивной травмы или сотрясение индукции не дают каких-либо различимых повреждений тканей гиппокампа, как видно под микроскопом(Рисунок 2B, C, соответственно), с мембраной зонда по-прежнему нетронутыми потом(Рисунок 2D,E). Сотрясение мозга и притязание мозги пронизано параформальдегидом (4%) 1 месяц после процедур микродиализа неотличимы при визуальном осмотре(рисунок 2F,G).

Правильное рефлекторное время
У животных из пострадавшей группы было значительно увеличенное время выпрямляния в среднем по сравнению с фиктивными случаями (Студенческий t-тест, р 0,042801) (Рисунок 4) и, казалось, ошеломлен, придя в сознание. Из 10 случаев из группы сотрясения мозга, одно животное показало незначительные признаки кровотечения под местом удара после падения веса. Других признаков перелома черепа или внутричерепного кровотечения не наблюдалось.

Ин виво церебрального микродиализа
Чтобы выступить в качестве репрезентативных результатов нашего метода, из гиппокампа были извлечены 15 10 образцов диализата, in vivo, с интервалом в 10 мин и скоростью потока 1 л/мин. Экстраклеточные уровни глутамата и ГАМК были измерены из 6 образцов в базовом уровне ( 60 мин) и из 9 образцов после индукции фиктивной травмы или сотрясения мозга (90 мин).

Внеклеточные концентрации глутамата
Значительное увеличение концентраций внеклеточного глутамата наблюдалось в регионе CA1 гиппокампа в течение первых 10 минут после индукции травмы по сравнению с фиктивной травмы (Mann-Whitney U Test, р 0,009175) (Рисунок 5). Никакой другой разницы в концентрациях глутамата между группами в любой другой момент времени не наблюдалось.

Внеклеточные концентрации ГАМК
Никаких существенных изменений в концентрациях ГАМК не наблюдалось в регионе CA1 гиппокампа в течение первых 10 минут после индукции травмы по сравнению с фиктивной травмы (Манн-Уитни U Тест, р 0,943861) (Рисунок 6). Существовал никакой другой существенной разницы в концентрации ГАМК в любой другой момент времени между сотрясением мозга случаях и фиктивных случаев травмы.

Рисунок 1: Схематический контур протокола исследования. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Гистологическая проверка размещения зонда и повреждения. (A) Корональский вид микродиализа зонда и руководство канюли размещения сайта в гиппокампе с использованием стереотаксического атласа Paxinos и Уотсон. (B) Представитель фотомикробик повреждения тканей гиппокампа (кресил фиолетовый) производится микродиализ зонда и руководство канюли от фиктивных случае травмы. (C) Представитель фотомикробик повреждения тканей гиппокампа (кресил фиолетовый) производится микродиализ зонда и руководство канюли из случае сотрясение мозга. (D) Представитель фотомикрограф микродиализного зонда до индукции сотрясения мозга. (E) Представитель фотомикрограф микродиализного зонда после индукции сотрясения мозга. Мембрана все еще цела. (F-G). Представитель фотомикрографа обмана (F) и сотрясение мозга (G) поврежденный мозг после перфузии с 4% параформадом в 1-месячный после фиктивной травмы или сотрясения процедуры. При визуальном осмотре 2 мозга неотличимы. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Сотрясение аппарата и микродиализных инструментов основных компонентов изображения. ()Фотография всей сборки состоит из вертикального поливинилхлорида (ПВХ) направляющей трубки для падения веса, расположенного над крысиной стадией, рама Plexiglas, пенная подушка, управляемый компьютером микроинфузионный насос, газированные шприцы, жидкость поворотные, и бок о бок сливки впускных линий. (B) Схематическое представление рамки Plexiglas и пенной подушки со всеми соответствующими размерами. (C) Фотография прорези кусок алюминиевой фольги, которая служит в качестве крысиной стадии над пеной подушки. (D) Фотография, показывающая позиционирование крысы на сцене непосредственно перед ударом головой падения веса. (E) Фотография, показывающая крысу после удара головой, иллюстрирующие 180 "горизонтальное вращение тела крысы после удара головой и последующего ускорения и вращения. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Правильное время. Гистограмма представления времени, затрачивания крыс, чтобы проснуться от анестезии и флип из положения на спине в положение лежа или начать ходить после сотрясения мозга (красные алмазы, n no 10) или фиктивной травмы (синие квадраты, No 11). Крысы из группы сотрясение мозга занимает значительно больше времени, чтобы исправить себя по сравнению с фиктивной группы травмы. Средние значения представлены как горизонтальная линия на каждом графике. - стр. 0,05, п.л.; 0,01,. р.; 0,001. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Внеклеточные концентрации глутамата. Средние внеклеточные концентрации глутамата (мкг/мл), измеренные микродиализом в гиппокампе во время базового (60 мин) и после сотрясения мозга (красные алмазы, n no 10) или фиктивные травмы (синие квадраты, n no 11) состояния (90 мин). Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения. - Злт; 0,05, П.л.; 0,01, П.л.; 0,001. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Внеклеточные концентрации ГАМК. Средние внеклеточные концентрации ГАМК (мкг/мл), измеренные микродиализом в гиппокампе во время базового (60 мин) и после сотрясения мозга (красные алмазы, n no 10) или фиктивные травмы (синие квадраты, n no 11) условия (90 мин). Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения. - Злт; 0,05, П.л.; 0,01, П.л.; 0,001. Эта цифра была изменена с IO Masse 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Для получения надежных результатов критические шаги в этом протоколе требуют особого внимания. Во время операции по имплантации канюли избегайте использования большего количества цемента, чем это необходимо, особенно когда он очень жидкий, чтобы предотвратить разлив по месту удара. Чтобы избежать блокировки сайта имплантации, используйте обтуратор такой же длины, как канюля. Во время процедуры микродиализа, вставьте зонд медленно в канюли и убедитесь, что он вставляется полностью для диализного отбора проб. Перед индукцией сотрясения мозга убедитесь, что алюминиевый лист правильно прорези с острым лезвием бритвы. В противном случае, воздействие от веса латуни не будет достаточно, чтобы сорвать алюминиевый лист и крыса будет оставаться грудь вниз, а не проходит 180 "вращение и посадка на спину. Если это так, травмы индуцированных будет результатом тупого удара, не в отличие от того, что видели в открытых черепа падение веса моделей и быть значительно более серьезными. Во время индукции сотрясения мозга, избежать воздействия канюли с весом, как это будет генерировать критические повреждения черепа крысы. Настоятельно рекомендуется работать в командах 2, чтобы ограничить ошибки манипуляции во время эксперимента.

Модификации и устранение неполадок
Во время процедуры микродиализа, поток должен быть постоянным и дать объем, соответствующий скорости перфузии, как только зонд связан с насосом. Меньшие объемы могут указывать на наличие засорения в мембране зонда или пузырьков воздуха в линиях. В случае засорения зонд должен быть отброшен и заменен. Тем не менее, пузырьки воздуха могут быть извлечены путем распространения ACSF в линиях. Если нет засорения или пузырьков воздуха отметил и до сих пор нет потока, небольшая часть оттока трубки ближе к концу может быть сокращена.

Ограничения метода
Другие исследования с использованием Уэйн государственный университет падение веса оценили некоторые фундаментальные структурные и молекулярные изменения¹⁸. Однако более тщательное расследование сохранит законность этой процедуры. Информация о биологических и нейроанатомических изменениях, происходящих на эпигенетическом и клеточном уровнях, еще больше укрепит надежную и переводческую ценность нашего метода. Кроме того, оценка когнитивных функций является надежным показателем исхода, связанного с mTBI в моделях грызунов^33. В то время как время направо было измерено в этом протоколе и было значительно отложено в раненых случаях по сравнению с фиктивными случаями, исследования в будущем должны сосредоточиться на методичном измерении когнитивных функций после индукции травму у грызунов.

Значение метода в отношении существующих/альтернативных методов.
Основное значение метода двоякое: во-первых, он позволяет успешно индукцию сотрясения мозга с помощью процедуры Университета штата Уэйн, что позволяет быстрое ускорение и замедление головы и туловиза. С помощью этого метода, серьезные результаты травмы, такие как кардиореспираторные аресты, перелом черепа, высокая смертность и признаки видимых ушибов головного мозга в месте удара удалось избежать. Во-вторых, этот метод микродиализа успешно реплицировал ранее продемонстрированный острый и недолговечный внеклеточный глутамат, происходящий в течение первых 10 минут после индукции травмы^14,16. Кроме того, сохранение зонда вставляется на протяжении всей процедуры значительно снижает вероятность индуцирования повреждения mTBI чувствительных гематоэнцефалический барьер связан с повторным микродиализ зонд вставки³⁴.

Будущие приложения или направления метода.
Учитывая простые в использовании аспекты процедуры падения веса Университета Уэйна и острые внеклеточные изменения уровня нейромедиатора, измеренные микродиализом, наша крысиная модель, сочетающая микродиализ и сотрясение мозга, обеспечивает исследователей надежным инструмент для точного воспроизводства биомеханики черепно-мозговой травмы человека и продольно характеризуют молекулярное воздействие сотрясений мозга. Наша крысиная модель также может быть использована в широком спектре терапевтических исследований, поскольку она предлагает ценную возможность изучить механизм и эффективность фармакологических агентов in vivo, непрерывно и без необходимости жертвовать животным. Кроме того, наличие крысиной модели, такой как представленная здесь, может значительно облегчить лучшее понимание взаимосвязи между дисбалансом нейромедиатора и поведенческими последствиями сотрясений мозга.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware stores
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			Available at most sporting goods retailer