JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقوم بوصف نهجين لتوصيف أحداث استقطاب الخلايا في الخلايا الليمفاوية B أثناء تشكيل IS. الأول، ينطوي على التحديد الكمي للتوظيف الجهازي وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في الغشاء متشابك. والثاني هو نهج البيوكيميائية، لتوصيف التغيرات في تكوين سنتروسوم، الذي يخضع للاستقطاب إلى متشابك المناعة.

Abstract

التعرف على المستضدات المربوطة بالسطح بواسطة مستقبلات الخلايا B (BCR) يؤدي إلى تشكيل متشابك المناعة (IS)، حيث يتم تنسيق كل من الإشارات ومستضد. تشكيل IS ينطوي على إعادة عرض الأكتين ديناميكية يرافقه تجنيد الاستقطاب إلى غشاء متشابك من العضيات داخل الخلايا المركزية وما يرتبط بها مثل الليسوسوم وجهاز غولجي. المراحل الأولية من إعادة عرض الأكتين تسمح للخلايا B لزيادة سطح الخلية وتعظيم كمية من المجمعات مستضد-BCR التي تم جمعها في متشابك. في ظل ظروف معينة، عندما تعترف الخلايا B المستضدات المرتبطة بالأسطح الصلبة، وتقترن هذه العملية إلى التوظيف المحلي وإفراز الليسوسوم، والتي يمكن أن تسهل استخراج المستضد. يتم استيعاب المستضدات المركبة في مقصورات داخلية ومتخصصة للمعالجة في الببتيدات، والتي يتم تحميلها على الجزيئات الرئيسية مجمع التوافق النسيجي الثاني (MHC-II) لمزيد من العرض إلى خلايا مساعد T. لذلك، دراسة ديناميات الجهاز ية المرتبطة بتكوين IS أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تنشيط الخلايا B. في هذه المقالة سوف نناقش كل من التصوير وتقنية البيوكيميائية المستخدمة لدراسة التغيرات في تحديد المواقع داخل الخلايا الأعضاء وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي التي ترتبط مع تشكيل IS في الخلايا B.

Introduction

الخلايا الليمفاوية B هي جزء أساسي من الجهاز المناعي التكيفي المسؤول ة عن إنتاج الأجسام المضادة ضد التهديدات المختلفة ومسببات الأمراض الغازية. يتم تحديد كفاءة إنتاج الأجسام المضادة من خلال قدرة الخلايا B على الحصول على، ومعالجة وتقديمالمستضدات التي تواجهها إما في شكل قابل للذوبان أو سطح المربوطة 1،2. التعرف على المستضدات المتصلة بسطح خلية تقديم، من قبل BCR، يؤدي إلى تشكيل اتصال قريب بين الخلايا يسمى IS3،4. داخل هذه المنصة الديناميكية يتم كل من الإشارات النهائية المعتمدة على BCR واستيعاب المستضدات في مقصورات بطانة اللمعة. تتم معالجة المستضدات التي يتم التقاطها وتجميعها على جزيئات MHC-II وتقدم بعد ذلك إلى الخلايا الليمفاوية T. التفاعلات المنتجة B-T، ودعا B-T خلية التعاون، والسماح للخلايا الليمفاوية B لتلقي الإشارات المناسبة، والتي تعزز تمايزها في خلايا البلازما المنتجة للأجسام المضادة أو خلايا الذاكرة8.

وقد شاركت آليتان في استخراج المستضد من قبل الخلايا B. الأول يعتمد على إفراز البروتياز الناشئة من الليسوسوم التي تخضع للتجنيد والانصهار في مشقوق متشابك5،6. والثاني، يعتمد على قوات سحب Myosin IIA بوساطة التي تؤدي إلى التهاب المهبل من مستضد يحتوي على الأغشية التي يتم استيعابها في حفر المغلفة clathrin7. يعتمد وضع استخراج المستضد على الخصائص الفيزيائية للغشاء الذي توجد فيه المستضدات. ومع ذلك، في كلتا الحالتين، تخضع الخلايا B لحدثين رئيسيين لإعادة تشكيل هما: إعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين واستقطاب العضيات إلى تنظيم الدولة الإسلامية. إعادة عرض الهيكل الخلوي أكتين ينطوي على مرحلة الانتشار الأولية، حيث نتوءات تعتمد على الأكتين في الغشاء متشابك زيادة السطح في اتصال مع مستضد. ويلي ذلك مرحلة انكماش، حيث تتركز الـ BCRs إلى جانب المستضدات في مركز IS من خلال العمل المتضافر للمحركات الجزيئية وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين8،9،10، 11.الاستقطاب من العضيات يعتمد أيضا على إعادة تشكيل الهيكل السيتوهيكل الأكتين. على سبيل المثال ، يصبح السنتروسوم غير مرتبط من النواة ، عن طريق إزالة البلمرة المحلية من الأكتين المرتبطة بها ، والذي يسمح بإعادة تمركز هذه الجهازية إلى IS5،12. في الخلايا B، إعادة وضع سنتروسوم إلى عمود خلية واحد (IS) يرشد التوظيف اللايسوم إلى الغشاء متشابك، والتي عند إفراز يمكن أن تسهل استخراج و / أو معالجة المستضدات المربوطة السطحية6. يتم إثراء Lysosomes المعين في IS مع MHC-II، الذي يفضل تشكيل المجمعات الببتيد MHC-II في مقصورات بطانة الرحم لتقديمها إلى الخلايا T13. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا أن جهاز غولجي يتم تجنيده عن كثب إلى IS14،مما يشير إلى أن الحويصلات المستمدة من غولجي من المسار السري يمكن أن تشارك في استخراج مستضد و / أو معالجة.

وإجمالاً، فإن إعادة ترتيب الأعضاء داخل الخلايا والهيكل الخلوي في الخلايا B أثناء تكوين المشبك هي الخطوات الرئيسية التي تسمح باكتساب المستضد بكفاءة ومعالجتها اللازمة لمزيد من التنشيط. في هذا العمل نقدم بروتوكولات مفصلة حول كيفية إجراء التصوير والتحليل البيوكيميائي في الخلايا B لدراسة إعادة عرض داخل الخلايا من العضيات المرتبطة بتكوين IS. وتشمل هذه التقنيات ما يلي: '1' الفلورة المناعية وتحليل الصور للخلايا باء المنشطة بالخرز المغلف بالمستضد وعلى الأغطية المغلفة بالمستضد، مما يسمح بالتصور والتحديد الكمي للمكونات داخل الخلايا التي يتم تعبئتها إلى IS و(ii) ) عزل الكسور ذات الثراء المركزي في الخلايا B عن طريق التدرجات الفائقة على تدرجات السكروز، مما يسمح بتحديد البروتينات المرتبطة بالمركزية، والتي يحتمل أن تشارك في تنظيم قطبية الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام خلايا IIA1.6 B.

1. B تنشيط الخلية مع الخرز المغلفة مستضد

  1. إعداد الخرز المغلفة مستضد
    1. لتنشيط الخلايا B،استخدم NH 2-الخرز المغلفة بشكل مشترك مع مستضد (الخرز المغلفة Ag)، والتي يتم إعدادها باستخدام 50 ميكرولتر (~ 20 × 106 الخرز) من 3 ميكرومتر NH 2-الخرز مع تفعيل (BCR-ligand +) أو عدم تفعيل (BCR-ligand-) مستضدات.
    2. لIIA1.6 B الخلايا استخدام المضادة للIgG-F (أب')2 جزء كما BCR-ligand + ومكافحة IgM-F(ab')2 أو البقري المصل الزلال (BSA) كما BCR-ligand-. لتنشيط الخلايا الأساسية B أو IgM+ B خط الخلية استخدام المضادة للIgM-F (أب')2 كما BCR-ligand + وBSA كما BCR-ligand-.
      ملاحظة: لتجنب ربط الأربطة إلى مستقبلات Fc، استخدم F(ab') أو F(ab')2 أجزاء الأجسام المضادة بدلاً من الأجسام المضادة كاملة الطول.
    3. للمضي قدما في إعداد الخرز المغلفة Ag، ووضع الخرز في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ملزمة البروتين منخفضة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخرز خلال التلاعب عينة. إضافة 1 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لغسل الخرز والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق.
    4. إعادة تعليق الخرز مع 500 درجة مئوية من 8٪ الجلوتالارهايد لتنشيط مجموعات NH2 وتناوب لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      تحذير: يجب استخدام محلول مخزون الجلوتارهايد لا يستخدم إلا في غطاء الدخان الكيميائي. اتبع الإرشادات الموجودة على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
    5. الخرز الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة الجلوتالالديهايد وغسل الخرز ثلاث مرات أخرى مع 1 مل من 1X PBS.
      تحذير: يجب التخلص من محلول الجلوتارهايد كنفايات كيميائية خطرة.
    6. إعادة تعليق الخرز المنشط في 100 درجة مئوية من 1X PBS. ويمكن تقسيم العينة إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ملزمة البروتين منخفضة: 50 درجة مئوية لBCR-ligand + و 50 درجة مئوية لBCR-ligand-.
    7. لإعداد محلول مستضد استخدام اثنين من 2 مل منخفضة البروتين ملزمة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من محلول مستضد في 150 درجة مئوية من PBS: أنبوب واحد مع BCR-ligand + وغيرها مع BCR-ligand-.
    8. إضافة 50 درجة مئوية من محلول الخرز المنشط لكل أنبوب يحتوي على 150 درجة مئوية من محلول المستضد، دوامة وتدوير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    9. إضافة 500 درجة مئوية من 10 ملغ / مل BSA لمنع ما تبقى من مجموعات NH2 التفاعلية على الخرز وتدوير لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
    10. طرد مركزي الخرز في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. غسل الخرز مع الباردة 1X PBS ثلاث مرات أخرى.
    11. إعادة تعليق الخرز المنشط في 70 درجة مئوية من 1X PBS.
    12. لتحديد التركيز النهائي للحبات المغلفة Ag، تمييع كمية صغيرة من الخرز في PBS (1:200) وحساب باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. ثم يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يُستعمل.
      ملاحظة: لا ينبغي تخزين الخرز المغلفة Ag لأكثر من شهر واحد.
  2. إعداد الأغطية بولي-L-يسين
    1. قبل تحديد تنشيط الخلية B مع الخرز المغلفة Ag، وإعداد الأغطية المغلفة بولي-L-يسين (PLL-coverslips). استخدام أنبوب 50 مل تحتوي على 40 مل من 0.01٪ ث / الخامس من محلول PLL وتزج الأغطية 12 ملم قطرها في الحل. تدوير بين عشية وضحاها في RT.
    2. اغسل الأغطية بـ 1x PBS واتركها لتجف على غطاء طبق يُغطّى بفيلم البارافين بـ 24 بئراً. تابع مع تنشيط الخلية B.
  3. تنشيط الخلية B
    1. لبدء تنشيط الخلية B مع الخرز، أولا تخفيف خط الخلية IIA1.6 B إلى 1.5 × 106 خلايا / مل في انقر المتوسطة (RPMI-1640 تستكمل مع 2 مل L-ألانين-L-الجلوتامين + 55 ميكرو متر بيتا ميركابتوإيثانول + 1 مليون بيروفات + 100 U / مل البنسلين + 100 ميكروغرام / مل العقدية) + 5٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني [FBS]).
    2. الجمع بين 100 درجة مئوية (150،000 خلية) من خلايا IIA1.6 B مع الخرز المغلفة Ag بنسبة 1:1 في أنابيب 0.6 مل. يُمزج بلطف باستخدام دوامة والبذور على الأغطية PLL. حضانة لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة ثقافة الخلية (37درجة مئوية / 5٪ CO 2). نقاط وقت التنشيط النموذجية هي 0 و 30 و 60 و 120 دقيقة. للمرة 0، ضع غطاء PLL في غطاء لوحة 24 جيدا على الجليد. يُضاف خليط الخرز المطلي بالخلايا والخرز لمدة 5 دقائق على الثلج.
      ملاحظة: من المهم أن تختلط بواسطة دوامة بدلا من الأنابيب صعودا وهبوطا، لأن هذا يمكن أن يقلل من عدد الخرز في العينة، وذلك بسبب تراكمها في طرف من البلاستيك من الماصة. استخدام الخرز المغلفة مع BCR-ligand- كسيطرة سلبية لكل نموذج. نوصي بتفعيل أطول فترة حضانة أولاً ثم النقاط الزمنية التالية. حساب فترات التنشيط للعينات بحيث تكون جاهزة للتثبيت في نفس الوقت.
    3. إضافة 100 درجة مئوية من الباردة 1X PBS إلى كل غطاء لوقف التنشيط والاستمرار في بروتوكول الفلورة المناعية. انظر الفرع 3 من البروتوكول.

2. B تنشيط الخلية على الأغطية المغلفة مستضد

  1. إعداد الأغطية المغلفة مستضد
    1. قبل التنشيط، قم بإعداد محلول المستضد (1x PBS الذي يحتوي على 10 ميكروغرام/مل BCR-ligand+ و0.5 ميكروغرام/مل الفئران المضادة للماوس CD45R/B220).
      ملاحظة: خذ بعين الاعتبار إعداد الأغطية في اليوم السابق للحجز. B220 يحسن التصاق الخلية B، ومع ذلك، BCR-Ligand+ كافية لتوليد استجابة الانتشار.
    2. ضع غطاء الغلاف عيار 12 مم على غطاء لوحة 24 بئر مغطى بفيلم البارافين، أضف 40 ميكرولتر من محلول المستضد على كل غطاء وحضانة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ختم لوحة لتجنب تبخر محلول مستضد.
    3. اغسل الأغطية بـ 1x PBS والهواء الجاف.
  2. تنشيط الخلية B
    1. لبدء التنشيط، تمييع خلايا IIA1.6 B إلى 1.5 × 106 خلايا/مل في CLICK المتوسطة + 5٪ FBS.
    2. إضافة 100 درجة مئوية من الخلايا على غطاء المغلفة مستضد (Ag-coverslip) وتفعيل لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2. نقاط وقت التنشيط النموذجية هي 0 و 30 و 60 دقيقة.
      ملاحظة: كما هو الحال في القسم 1، نوصي بالبدء بأطول نقطة زمنية تنشيط من أجل إصلاح كافة العينات في نفس الوقت.
    3. للمرة 0، ضع غطاء اللوحة 24 جيدا التي تحتوي على Ag-coverslip على الجليد وإضافة الخلايا. الحضانة لمدة 5 دقائق على الجليد.
    4. يستنشق بعناية وسائل الإعلام على كل غطاء Ag ثم إضافة 100 درجة مئوية من الباردة 1X PBS لوقف التنشيط. استمر في بروتوكول الفلورة المناعية. انظر الفرع 3.

3- الفلورة المناعية

ملاحظة: لتجنب التفاعل عبر الأجسام المضادة الثانوية مع BCR من خلايا IIA 1.6 B لا تستخدم الأجسام المضادة الأساسية المشتقة من الماوس.

  1. إزالة PBS 1X والمضي قدما في تثبيت كل غطاء.
    ملاحظة: لتحديد أي وسيط التثبيت للاستخدام، تحقق من ورقة بيانات الأجسام المضادة/صبغ. على سبيل المثال، لوضع العلامات على الأكتين عن طريق phalloidin استخدام paraformaldehyde (PFA) تثبيت المتوسطة، ولوضع العلامات المركزية عن طريق pericentrin استخدام تثبيت الميثانول.
    1. إضافة 50 درجة مئوية من 1X PBS تستكمل مع 4٪ PFA وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
      تحذير: الفورمالديهايد سام. يرجى قراءة MSDS قبل العمل مع هذه المادة الكيميائية. يجب أن يتم حل PFA فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائية يرتدي القفازات ونظارات السلامة. وينبغي التخلص من محلول الهيدروكربون المشبع بالفلور باعتباره نفايات كيميائية خطرة.
    2. بدلا من ذلك، إضافة 50 درجة مئوية من الميثانول البارد والحضانة لمدة 20 دقيقة.
  2. غسل ثلاث مرات مع 1X PBS.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأغطية عند 4 درجة مئوية عند هذه النقطة لمدة ثلاثة أيام كحد أقصى في 1x PBS.
  3. إزالة 1X PBS وإضافة 50 درجة مئوية من حظر العازلة (2٪ BSA + 0.3 M غليسين في 1X PBS) على كل غطاء. حضانة في RT لمدة 10 دقائق.
  4. يستنشق بلطف وإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت (PB) (0.2٪ BSA + 0.05٪ الصابونين في 1X PBS). حضانة في RT لمدة 20 دقيقة.
  5. إعداد الأجسام المضادة أو الأصباغ في PB (استخدام 30 ميكرولتر لكل غطاء) وحضانة في RT لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يرجى الرجوع إلى جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. لتسمية مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOC) أو centrosome استخدام الأجسام المضادة التالية: المضادة γ-Tubulin (1:500)، المضادة لCep55 (1:500)، المضادة لα-tubulin (1:500)، المضادة للاستين (1:1000).
      ملاحظة: للحصول على علامات سنتروسوم B الخلايا يمكن أن يكون transfected مع بلازميد التعبير سنترين-GFP.
    2. لوضع العلامات على جهاز غولجي استخدام مكافحة Rab6a (1:500).
      ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام الأجسام المضادة أو الأصباغ الأخرى.
    3. لوضع العلامات lysosomes، استخدم المضادة للمصباح1 (1:200).
      ملاحظة: المضادة لH2-DM ومكافحة MHC-II يمكن أيضا أن تستخدم لتسمية مقصورات معالجة مستضد15،16.
    4. لوضع العلامات على الشبكية الإندوبلازمية استخدام المضادة لSec61a (1:500).
    5. للهيكل الخلوي الأكتين النظر في ما يلي: يمكن تصور الأكتين البوليمرية من قبل Phalloidin مترافقة مع الأصباغ الفلورية.
      ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام الخلايا B المنقولة مع بلازميد تعبير LifeAct-GFP/RFP لتسمية الأكتين.
  6. غسل الأغطية ثلاث مرات مع PBS.
  7. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية أو الأصباغ في PBS (استخدام 30 ميكرولتر لكل غطاء) وحضانة 1 ساعة في RT.
    ملاحظة: تجنب تعريض العينات للضوء المباشر للحفاظ على جودة إشارة الفلورة.
  8. غسل الأغطية ثلاث مرات مع PBS.
  9. إزالة حل PBS من الأغطية.
  10. إضافة 4 ميكرولتر من الكاشف المتصاعد إلى شريحة المجهر. قم بتركيب غطاء الغلاف على الشريحة مع جانب الخلية الذي يواجه لأسفل. السماح للشرائح لتجف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية أو في RT بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار استخدام كاشف تركيب "مضاد للتلاشي" (راجع جدول المواد).
  11. احصل على صور الفلورة على مجهر confocal أو epifluorescence مع هدف غمر الزيت 60x أو 100x. لكل اكتساب النظر في الضوء المنقولة أو حقل مشرق لتحديد الخلايا B بسهولة التفاعل مع الخرز.
    ملاحظة: خذ صور ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تغطي الخلية بأكملها باستخدام مكدسات z. نوصي بأخذ أكوام سميكة 0.5 ميكرومتر، ولكن هذا يعتمد على المجهر.

4. تحليل الصور

ملاحظة: يتم وصف الخوارزميات التالية لبرنامج ImageJ. ومع ذلك، يمكن تنفيذ ذلك باستخدام برنامج مكافئ. أيضا، النظر في أن لجميع قياسات كثافة الفلورة نستخدم كثافة الفلورة المتكاملة ("RawIntDen" في ImageJ)، لأن هذه المعلمة تنظر في المبلغ الإجمالي للفلورة في كل بكسل من الصورة، مع الأخذ في الاعتبار المنطقة.

  1. تحليل توزيع العضيات في الخلايا B تنشيط مع الخرز المغلفة Ag
    ملاحظة: لتحديد استقطاب مكونات الخلايا إلى IS، نعرّف قيمة عشوائية كمقياس للقرب من IS. يتراوح المؤشر بين -1 (مكافحة الاستقطاب) و 1 (الاستقطاب الكامل، كائن على حبة)، كما سبق أن قدم من قبل Reversat وآخرون.12.
    1. تقدير مؤشر القطبية لجهاز سنتروسوم وغولجي (الشكل1B).
      ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخوارزمية للعضوية التي تقتصر على نقطة واحدة.
      1. قم أولاً بتعريف مناطق الخرزة والخلايا لتحليلها باستخدام تحديد أداة الدائرة لتحديد حدود كليهما، ثم حفظها كمناطق اهتمام (ROI). انظر الشكل 1والشكل 2والشكل 3والشكل 4.
      2. تحديد مركز الخلية(CC) ومركز حبة (قبلالميلاد)عن طريق تشغيل تحليل | قياس على مناطق الخلية وحبة على التوالي. تحدد قيم X و Y التي تم الحصول عليها من إطار النتائج إحداثيات المركز.
      3. يدويا تحديد مركز الجهاز سنتروسوم أو غولجي(Organelle) باستخدام اختيار أداة نقطة في ImageJ وتشغيل تحليل | قياس. تحدد قيم X و Y التي تم الحصول عليها من إطار النتائج الإحداثيات.
      4. ثم، رسم زاوية من CCإلى Organelle (أ) وCC إلى BC (ب)باستخدام اختيار أداة زاوية وتشغيل تحليل | قياس. تظهر قيمة الزاوية في نافذة النتائج الزاوية (α) بين كلا المتجهين (a و b).
      5. حساب فهرس القطبية باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-11626
    2. تقدير مؤشر القطبية للليسوسوم (الشكل1F).
      ملاحظة: نستخدم هذه الخوارزمية لتحليل قطبية العضيات التي تعرض توزيع أكثر تشتتاً، مثل lysosomes.
      1. حدد مناطق الخرزة والخلايا لتحليلها، باستخدام تحديد أداة الدائرة لتحديد حدود كليهما، وحفظها كعائد استثمار. مرة واحدة وقد تم ردع حبة ومناطق الخلية، وتعيين قناة الفلورة والمشروع الصورة في واحد z-المكدس (صورة | مكدسات | Z-المشروع [مجموع شرائح])، ثم تشغيل تحليل | قياس واستخراج إحداثيات مركز الكتلة (MC) (MX وMY) من إطارات النتائج.
      2. تطبيق نفس الخوارزمية المذكورة قبل تغيير Organelle لMC. وهكذا، يتم تعريف الزاوية (α) بواسطة CC-MC (أ) و CC-BC (b).
      3. حساب القطبية باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-12501
    3. تقدير التوظيف اللايسوم في منطقة متشابك (الشكل2باء).
      ملاحظة: يتم استخدام هذه الخوارزمية لتحديد مقدار organelle المجاورة لIS.
      1. بمجرد تحديد مناطق الخرزة والخلايا، حدد زاوية المتجه بين CC وBC ثم قم بتدوير الصورة لتحقيق زاوية 0 درجة.
      2. تعيين قناة الفلورسنت والمشروع الصورة في واحد z-المكدس (صورة | مكدسات | Z-المشروع [شرائح المجموع]، والقضاء على جميع الفلورة التي تقع خارج الخلية ومنطقة حبة معا (تشغيل تحرير | واضحة خارج في ImageJ).
      3. باستخدام اختيار أداة مستطيل، رسم مستطيل المتاخمة للحبة وقياس الفلورة منطقة متشابك (القواتالمسلحةالسودانية). هذا المستطيل هو ربع عرض الخلية.
      4. حدد الصورة بأكملها وتشغيل تحليل | إجراء للحصول على الفلورةالخلية بأكملها (WCF).
      5. حساب نسبة الفلورة العضوية المجاورة لـ IS باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-13499
    4. تحديد حجم توظيف المكونات الخلوية إلى مركز.
      ملاحظة: تُستخدم هذه الخوارزمية،المقتبسة من أوبينو وآخرون 5، لتحديد كمية إثراء الأعضاء في المنطقة المركزية. باختصار، نحن نعتبر المنطقة المركزية كمجال حيث الفلورة العضوية المرتبطة المركزية لا تزال ثابتة أو فوق 70٪ في مؤامرة الفلورة / دائرة نصف قطرها. من الضروري تعيين هذه المعلمة في ظروف الراحة لأن نصف القطر هذا يمكن أن يتغير عند التنشيط.
      1. مرة واحدة وقد تم تحديد حبة ومناطق الخلية، وتحديد توطين centrosome باستخدام اختيار أداة نقطة (الشكل3B).
      2. أولاً، تحديد المساحة القصوى حول المركز الذي يمكن قياسه كمياً، عن طريق رسم دائرة نصف قطرها 3 ميكرومتر تحيط بسنتروسوم.
      3. استخدام ImageJ البرنامج المساعد شعاعي الشخصي، الذي يقيس الفلورة في الدوائر متحدة المركز ويعرض مؤامرة الفلورة / دائرة نصف قطرها.
      4. تحديد دائرة نصف قطرها القصوى التي يتم الحفاظ على ما لا يقل عن 70٪ من كثافة الفلورة.
      5. حساب نسبة كثافة الفلورة باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-14602=figure-protocol-14668
        ملاحظة: تشير نسبة كثافة الفلورة إلى تركيز الجهاز في المركز مقارنة بتوزيعه في الخلية بأكملها.
  2. تحليل انتشار الخلايا وتوزيع العضيات في الخلايا B تفعيلها على Ag-coverslips
    1. تقدير توزيع الأعضاء في IS (الشكل4B).
      ملاحظة: تسمح هذه الخوارزمية بالقياس الكمي لتوزيع أجهزة بناء الذاكرة وتركيزها في مركز IS. نحن نحدد نسبة كثافة الفلورة بين المنطقة المركزية وإجمالي متشابك. يمكن أن تختلف القيم التي تم الحصول عليها من سلبية إلى إيجابية، مما يشير إلى توزيع محيطي أو مركزي للأورغانل، على التوالي.
      1. تحديد الشريحة التي تكون الخلية في اتصال مع الغطاء.
        ملاحظة: لتحديد حدود الخلية يمكن للمرء تسمية غشاء البلازما أو actin التي يتم إثراؤها في محيط IS.
      2. تغيير نوع الشريحة إلى 8 بت، ثم binarize (عملية | ثنائي | جعلثنائي) وربط أقرب نقطة خارجية عملية | ثنائي | المخطط التفصيلي. تحديد حدود منطقة الخلية (CA) باستخدام تحديد أداة المضلع.
        ملاحظة: هذه الخطوة مفيدة لزيادة تباين حدود الخلية وتسهيل التعرف. أيضا، في هذه المرحلة، فمن الممكن لتطبيق البرنامج المساعد تحليل الجسيمات من ImageJ لتحديد المرجع المصدق تلقائيا. ومع ذلك، يمكن أن تتداخل الخلايا الأخرى في نفس الحقل مع النتائج.
      3. خذ معلمات المرجع المصدق (الارتفاع والعرض) وحد منطقة مدورة مركزية مفصولة عن الحدود بربع قيم الارتفاع والعرض، خذ هذه المنطقة كمنطقة مركز الخلية (CCA).
      4. حساب توزيع كثافة الفلورة في مركز IS باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-16219
    2. قياس توزيع الأعضاء في الطائرات Z (الشكل4C).
      ملاحظة: يحدد هذا التحليل التوزيع العام للفلورة العضوية عبر طائرات Z من الخلايا B المنشطة على غطاء Ag، مما يبين النسبة المئوية للفلورة لكل كسر Z.
      1. لتحديد توزيع الفلورة في Z، أولاً تحديد مستوى IS حيث تكون الخلية على اتصال مع غطاء Ag ثم الطائرة المقابلة للحد الأعلى للخلية.
      2. رسم خط عبر مركز الخلية.
      3. إعادة تقطيع الصورة في Z (صورة | مكدسات | قم بإعادةالشريحة)، للحصول على صورة XZ.
      4. قياس الارتفاع وتقسيم صورة XZ إلى 10 مستطيلات متتالية من نفس الارتفاع (Z fraction) من أسفل (واجهة IS) إلى الجزء العلوي (الجانب العلوي من الخلية) وتحديد إشارة الفلورة في كل واحد.
      5. تطبيع كثافة الفلورة من كل كسر Z بمجموع الفلورة الإجمالية للكسور 10.
      6. رسم النسبة المئوية لشدة الفلورة لكل جزء Z من الخلية.

5. عزل الكسر المنزّر السنتروسوم من الخلايا B المثبقية والمنشطة

ملاحظة: حافظ على جميع الحلول عند درجة حرارة 4 درجة مئوية أثناء التجربة لتجنب تدهور البروتين. تم تكييف هذا البروتوكول من العمل السابق17،18.

  1. تفعيل 2 × 107 B الخلايا مع الخرز المغلفة Ag في 2 مل من انقر المتوسطة + 2٪ الحرارة المعطلة FBS (نسبة 1:1). خذ بعين الاعتبار الخلايا B غير المنشطة كخلايا B يستريح.
  2. إضافة سيتوتشالاسين D (2 μM) ونوكوبازول (0.2 درجة مئوية) وحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الأدوية لفصل بلطف centrosome من النواة، عن طريق إزالة البلمرة الأكتين السيتوهيكل الخلوي وmicrotubules، على التوالي، لتجنب التلوث النووي.
  3. اغسل كل عينة بـ 5 مل من السل البارد 1x TBS (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.6، 150 مل من حمض الكلى) ثم بـ 1 مل من 0.1 x TBS مع السكروز بنسبة 8%.
  4. إعادة تعليق الخلايا مع 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للليسات المركزية (1 mM HEPES, pH 7.2,0.5% NP-40, 0.5 m M MgCl 2, 0.1% بيتا ميركابتوإيثانول, 1 مليون فينيل ميثيل سولفونل فلوريد (PMSF) أو كوكتيل مثبطات البروتياز) وماصة صعودا وهبوطا حتى اللزوجة النقصان، مما يشير إلى تحديد تحليل الخلية في العينة. وضع العينة في أنبوب 1.5 مل.
  5. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، لفصل العضيات من النواة.
  6. استعادة بعناية supernatant ووضعها على رأس أنبوب 1.5 مل مع 300 درجة مئوية من العازلة التدرج (GB) (10 مليون متر متري PH 7.2، 0.1٪ تريتون X-100، 0.1٪ بيتا ميركابتوإيثانول) التي تحتوي على 60٪ السكروز.
  7. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لتركيز centrosomes في كسر السكروز 60٪.
  8. وفي الوقت نفسه، إعداد التدرج غير المستمر في 2 مل أنابيب فائقة الطرد المركزي عن طريق تراكب 450 ميكرولتر من GB + 70٪ السكروز مع 270 ميكرولتر من GB + 50٪ السكروز ثم 270 درجة مئوية من GB + 40٪ السكروز.
  9. بعد الطرد المركزي الأول (الكسر المركز- مركزة)، تجاهل الجزء العلوي (جزء أقل كثافة) حتى تصل إلى واجهة ودوامة العينة المتبقية في الأنبوب. ثم، تراكب على رأس التدرج متقطع أعدت مسبقا مع عينة المخصب centrosome.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم تعطيل التدرج يجب تنفيذ كافة إجراءات توجيه الأنابيب بعناية.
  10. الطرد المركزي في 40،000 × ز لمدة ساعة في 4 درجة مئوية مع الحد الأدنى من التسارع ومع الفرامل الطرد المركزي تعيين إلى قبالة، لتجنب تعطيل التدرج.
  11. جمع 12 كسور من 100 درجة مئوية في أنابيب منفصلة تبدأ من أعلى.
  12. تحديد الكسور الغنية سنتروسوم عن طريق المناعية باستخدام γ-tubulin كعلامة سنتروسوم.
    ملاحظة: عادة ما نجد مقتطفات سنتروسوم المخصب بين الكسور 6 و 8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

توضح هذه المقالة كيف يمكن تنشيط الخلايا B باستخدام مستضد معطلة على الخرز أو الأغطية للحث على تشكيل IS. نحن نقدم معلومات عن كيفية تحديد وقياس الاستقطاب من العضيات المختلفة عن طريق الفلورة المناعية وكيفية توصيف البروتينات التي تخضع لتغيرات ديناميكية في ارتباطها إلى مركز، ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نحن نصف طريقة شاملة لدراسة كيفية إعادة تنظيم الخلايا الليمفاوية B الهندسة المعمارية داخل الخلايا لتعزيز تشكيل IS. وتشمل هذه الدراسة استخدام تقنيات التصوير لتحديد كمية التوزيع داخل الخلايا من العضيات، مثل سنتروسوم، جهاز غولجي والليسوسوم خلال تنشيط الخلية B، وكيف أنها الاستقطاب إلى IS. بالإ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

M.-I.Y. مدعوم بمنحة بحثية من FONDECYT #1180900. وحظيت كل من لجنة الدراسات الدولية ووزارة العدل وشركة J.L. بدعم من زمالات من اللجنة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا. نشكر ديفيد أوسوريو من جامعة بونتيفيسيا الكاثوليكية في شيلي على تسجيل الفيديو وتحريره.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A212061:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6Abcamab959541:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61Abcamab155751:200 dilution recomended but should be optimized
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab61601:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling32431:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55 Abcamab1704141:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 for Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

References

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148lysosomesB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved