JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем два подхода к характеристике событий поляризации клеток в лимфоцитах B во время формирования ИГ. Во-первых, включает в себя количественную оценку набора органелл и цитоскелет перестановки на синаптической мембраны. Второй – биохимический подход, характеризующий изменения в составе центросомы, которая подвергается поляризации иммунной синапса.

Аннотация

Распознавание поверхностных антигенов рецептором В-клеток (BCR) вызывает образование иммунного синапса (ИС), где координируются как сигнальные, так и антигенные поглощения. Формирование ИГ включает в себя динамическую ремоделирование актина, сопровождаемую поляризованной вербовкой в синаптическую мембрану центросомы и связанных с ними внутриклеточных органелл, таких как лизосомы и аппарат Голги. Первоначальные этапы ремоделирования актина позволяют В-клеткам увеличивать свою поверхность клеток и максимизировать количество комплексов антиген-БКР, собранных в синапсе. При определенных условиях, когда В-клетки распознают антигены, связанные с жесткими поверхностями, этот процесс связан с местным набором и секрецией лизосомы, которые могут облегчить экстракции антигена. Поглощенные антигены интернализированы в специализированные эндо-лизосомы отсеки для обработки в пептиды, которые загружаются на основные молекулы гистосовместимости II (MHC-II) для дальнейшего представления T-клеткам-помощникам. Поэтому изучение динамики органелл, связанной с формированием ИС, имеет решающее значение для понимания того, как активируются вхлговые клетки. В настоящей статье мы обсудим как визуализацию, так и биохимический метод, используемый для изучения изменений внутриклеточного позиционирования органелл и изменения цитоскелетов, связанные с образованием ИС в В-клетках.

Введение

B лимфоциты являются неотъемлемой частью адаптивной иммунной системы, ответственной за выработку антител против различных угроз и вторжения патогенов. Эффективность производства антител определяется способностью В-клеток приобретать, обрабатывать и представлять антигены, встречающиесялибо в растворимой или поверхностной форме 1,2. Распознавание антигенов, прикрепленных к поверхности клетки представления, БКР, приводит к образованию близкого межклеточного контакта под видом IS3,4. В рамках этой динамической платформы происходит как BCR-зависимых вниз по течению сигнализации и интернализации антигенов в эндо-лизосомы отсеков происходит. Убранные антигены обрабатываются и собираются на молекулы MHC-II и впоследствии подаются Т-лимфоцитам. Продуктивные B-T взаимодействия, называемые B-T-клеток сотрудничества, позволяют B лимфоцитов для получения соответствующих сигналов, которые способствуют их дифференциации в антитела производства плазматических клеток или клеток памяти8.

Два механизма были вовлечены в экстракцию антигена в клетках В. Первый опирается на секрецию протеаз, происходящих из лизосом, которые подвергаются набору и слиянию при синаптической расщелине5,6. Второй, зависит от Миозина IIA-опосредованных сил, что вызывает вагинацию антигена, содержащего мембраны, которые интернализированы в clathrin покрытием ямы7. Режим экстракции антигена зависит от физических свойств мембраны, в которой находятся антигены. Тем не менее, в обоих случаях, В клетки проходят два основных события реконструкции: актиновый цитоскелет реорганизации и поляризации органелл в IS. Actin цитоскелет ремоделирования включает в себя начальную стадию распространения, где актин-зависимых выступов в синаптической мембраны увеличить поверхность в контакте с антигеном. За этим следует фаза сокращения, где BCRs в сочетании с антигенами сосредоточены в центре ИС с согласованным действием молекулярных двигателей и актина цитоскелет ремоделирования8,9,10, 11. Поляризация органелл также опирается на ремоделирование актина цитоскелета. Например, центросома становится отсоединена от ядра, путем локальной деполимеризации ассоциированного актина, что позволяет перепозиционировать эту органель вIS 5,12. В В-клетки, перепозиционирование центросомы на один полюс клетки (IS) направляет лизосомы вербовки в синаптической мембраны, которая при секреции может облегчить добычу и / или обработки поверхностных антигенов6. Лисососомы, завербованные в ИГ, обогащаются MHC-II, что способствует образованию пептидных комплексов MHC-II в эндосомальных отсеках, которые будут представлены Т-клеткам13. Кроме того, было отмечено, что аппарат Голги был тесно завербован вIS 14,предполагая, что пузырьки, полученные голги из секреторного пути, могут быть вовлечены в добычу антигена и/или обработку.

В целом, внутриклеточные органеллы и цитоскелетные перестановки в В-клетках во время формирования синапсов являются ключевыми шагами, которые позволяют эффективное приобретение и обработку антигена, необходимые для их дальнейшей активации. В этой работе мы вводим подробные протоколы о том, как выполнять визуализацию и биохимический анализ в В-клетках для изучения внутриклеточной ремоделирования органелл, связанных с образованием ИС. Эти методы включают: i) иммунофлуоресценцию и анализ изображений В-клеток, активированных с антигеном покрытием бусины и на антиген-покрытие крышки, что позволяет визуализации и количественной внутриклеточной компоненты, которые мобилизованы в ИС и (ii ) изоляция обогащенных центросомой фракций в В-клетках путем ультрацентрифугирования на градиентах сахарозы, что позволяет выявлять белки, связанные с центросомой, потенциально участвующих в регулировании полярности клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с использованием ячеек IIA1.6 B.

1. Активация клеток B с бусинами с антигенным покрытием

  1. Приготовление бусинсев с антигенным покрытием
    1. Для активации В-клеток используйте NH2-бусы ковалентно покрытые антигеном (Ag-покрытием шарики), которые готовятся с использованием 50 qL (20 х 106 шариков) из 3 мкм NH2-бусы с активацией (BCR-ligand) или неактивирующие (BCR-ligand-) антигены.
    2. Для IIA1.6 B клетки используют анти-IgG-F (ab')2 фрагмента как BCR-лиганде и anti-IgM-F (ab')2 или бычьего сыворотки альбумина (BSA) как BCR-ligand-. Для активации первичных В-клеток или линии клеток IgMи B используйте anti-IgM-F (ab')2 в качестве BCR-лиганд и BSA как BCR-лиганд-.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать связывания лигандов с рецептором FC, используйте F (ab') или F (ab')2 антитела фрагментов вместо полнометражных антител.
    3. Чтобы продолжить подготовку Ag покрытием бисера, поместите бисер в низкобелковых связывания микроцентрифуговых труб, чтобы максимизировать восстановление бисера во время манипуляции образца. Добавьте 1 мл 1x фосфат-буферизированного сосудистого раствора (PBS) для мытья бисера и центрифуги при 16 000 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
    4. Отрежируйте бусинки с 500 qL 8% глютаральдегида, чтобы активировать NH2 групп ы и повернуть в течение 4 ч при комнатной температуре (RT).
      ВНИМАНИЕ: Раствор запасов глютаральдегида должен использоваться только в химическом капоте дыма. Следуйте инструкциям на листе данных о безопасности материалов (MSDS).
    5. Центрифуга бисер а 16000 х г в течение 5 мин, удалить глютаральдегид и мыть бисер еще три раза с 1 мл 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: Раствор глютаральдегида следует отбрасывать как опасные химические отходы.
    6. Отрежь активированные бусинки в 100 л 1x PBS. Образец можно разделить на две низкобелковые связывающие микроцентрифуги: 50 л для BCR-лиганд и 50 л для BCR-ligand-.
    7. Для подготовки антигенного раствора используйте две 2 мл низкобелковых связывающих микроцентрифуговых трубок, содержащих 100 мкг/мл антигенного раствора в 150 л ПБС: Одна трубка с BCR-лиганди и другая с BCR-ligand-.
    8. Добавьте 50 qL активированного раствора бисера к каждой трубке, содержащей 150 злитрологового раствора антигена, вихря и поверните на ночь при 4 градусах Цельсия.
    9. Добавьте 500 л из 10 мг/мл BSA, чтобы блокировать оставшиеся реактивные группы NH2 на бисере и вращаться в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
    10. Centrifuge бисер на 16000 х г в течение 5 мин при 4 кв и удалить супернатант. Вымойте бисер с холодной 1x PBS еще три раза.
    11. Приостанавливай активированные бусы в 70 л 1x PBS.
    12. Чтобы определить конечную концентрацию бусин с покрытием Ag, разбавьте небольшой объем шариков в PBS (1:200) и отчислите с помощью гемоситометра. Затем храните при 4 градусах По цельсию до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бусы с ag покрытием не должны храниться более 1 месяца.
  2. Приготовление поли-Л-лизиновых чехлов
    1. Перед активацией B-клеток проинсаживать с ag-покрытием шарики, приготовьте поли-L-лизин-покрытие покрытые крышки (PLL-coverslips). Используйте трубку диаметром 50 мл, содержащую 40 мл 0,01% ват/в раствора PLL, и погрузите в раствор крышки диаметром 12 мм. Поверните на ночь на RT.
    2. Вымойте крышки с 1x PBS и оставить высохнуть на 24-хорошо крышкой пластины покрыты парафина пленкой. Продолжить активацию B-клеток.
  3. Активация В-клеток
    1. Чтобы начать активацию B-клеток с бисером, сначала разбавить линию icA1.6 B ячейки до 1,5 х 106 ячеек/мл в среде CLICK (RPMI-1640 дополнен 2 мМ L-Аланин-L-Глютамин стрептомицин) - 5% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
    2. Объедините 100 кЛ (150 000 ячеек) ячеек IIA1.6 B с бисером с покрытием Ag в соотношении 1:1 в трубках 0,6 мл. Смешайте осторожно, используя вихрь и семена на PLL-крышки. Инкубировать для различных точек времени в инкубаторе клеточнойкультуры (37 кв/5% CO 2). Типичные точки активации времени 0, 30, 60 и 120 мин. На время 0, поместите PLL-крышки в 24-хорошо пластины крышкой на льду. Добавьте смесь из бисины с покрытием, атакжемированную агитированным, и насигите в течение 5 мин на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно смешивать вихрем, а не пипетка вверх и вниз, потому что это может уменьшить количество шариков в образце, из-за их накопления в пластиковой кончике пипетки. Используйте бусы с покрытием BCR-лиганд- в качестве отрицательного контроля для каждого асссе. Мы рекомендуем активировать самое длинное время инкубации, а затем в следующий раз точек. Рассчитайте интервалы активации для образцов таким образом, чтобы они были готовы к фиксации одновременно.
    3. Добавьте 100 л холодного 1x PBS к каждому coverslip для того чтобы остановить активацию и продолжать с протоколом immunofluorescence. Смотрите раздел протокола 3.

2. Активация клеток B на крышках с антигеном

  1. Приготовление обложек с антигеном
    1. Перед активацией подготовьте антигенный раствор (1x PBS, содержащий 10 мкг/мЛ BCR-лиганд и 0,5 мкг/мл крысы против мыши CD45R/B220).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность подготовки обложек за день до асссе. B220 улучшает адгезию B-клеток, однако, BCR-Ligand достаточно для создания распространения реакции.
    2. Поместите 12-мм coverslip на 24-хорошую крышку пластины покрыты парафина пленкой, добавить 40 л антигена раствор на каждом coverslip и инкубировать при 4 градусах Цельсия в одночасье. Печать пластины, чтобы избежать испарения антигена раствора.
    3. Вымойте крышки с 1x PBS и воздух сухой.
  2. Активация В-клеток
    1. Чтобы начать активацию, разбавить IIA1.6 B-клеток до 1,5 х 106 ячеек/мл в среде CLICK 5% FBS.
    2. Добавьте 100 кл л клеток на покрытие антигена (Ag-coverslip) и активируйте для различных временных точек в клеточном инкубаторе при 37 КС / 5% CO2. Типичные точки активации времени 0, 30 и 60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в разделе 1, мы рекомендуем начать с самой длинной активации времени для того, чтобы исправить все образцы в то же время.
    3. На время 0, поместите 24-хорошо крышкой пластины, содержащей Ag-coverslip на льду и добавить клетки. Инкубировать в течение 5 мин на льду.
    4. Тщательно аспирировать средства массовой информации на каждом Ag-coverslip, а затем добавить 100 л холодного 1x PBS, чтобы остановить активацию. Продолжить с протоколом иммунофлуоресценции. Смотрите раздел 3.

3. Иммунофлуоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перекрестной реактивности вторичного антитела с BCR IIA 1.6 B клеток, не используйте мыши полученных первичных антител.

  1. Удалите 1x PBS и приступить к фиксации каждого coverslip.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы решить, какой среде фиксации использовать, проверьте лист данных антитела/красителя. Например, для маркировки актина фаллоидином используют параформальдегид (ПФА) среду фиксации, а для ценрозомной маркировки перицентрином используют метанол фиксацию.
    1. Добавьте 50 зл 1x PBS, дополненный 4% PFA и инкубировать в течение 10 минут на RT.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Пожалуйста, прочитайте MSDS, прежде чем работать с этим химическим веществом. Решения PFA должны быть сделаны только под химическим капотом дыма носить перчатки и защитные очки. Раствор PFA следует отбрасывать в качестве опасных химических отходов.
    2. Кроме того, добавьте 50 л холодного метанола и инкубировать в течение 20 мин.
  2. Вымойте три раза с 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обложки могут храниться при 4 градусах по Цельсию в этот момент в течение максимум трех дней в 1x PBS.
  3. Удалите 1x PBS и добавьте 50 qL блокирующего буфера (2% BSA 0,3 М глицин в 1x PBS) на каждый coverslip. Инкубировать на RT в течение 10 мин.
  4. Нежно аспирировать и добавлять 50 qL буфера пермяки (PB) (0.2% BSA и 0.05% сапонин в 1x PBS). Инкубировать на RT в течение 20 мин.
  5. Подготовка антител или красителей в ПБ (использовать 30 л на coverslip) и инкубировать на RT в течение 1 ч или на ночь при 4 градусах Цельсия. Для получения дополнительной информации обратитесь к таблице материалов.
    1. Для обозначения микротрубоула организуающий центр (MTOC) или центросомы используйте следующие антитела: анти-К-Тубулин (1:500), анти-Цеп555 (1:500), анти-К-тубулин (1:500), антиперисентрин (1:1000).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для центросомы маркировки B-клеток можно трансфицировать с помощью плазмиды экспрессии центрин-GFP.
    2. Для маркировки аппарата Golgi используйте anti-Rab6a (1:500).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антитела или красители также могут быть использованы.
    3. Для маркировки лизосомы используйте анти-Lamp1 (1:200).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Anti-H2-DM и anti-MHC-II также могут быть использованы для обозначения отсеков для обработки антигенов15,16.
    4. Для маркировки эндоплазмического ретикулума используйте anti-Sec61a (1:500).
    5. Для актина цитоскелет ассоцизм считают следующим: полимеризованный актин может быть визуализирован фаллоидином, конъюгированным для флуоресцентных красителей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В-клеток, трансфицированных с LifeAct-GFP / RFP выражение плазмида также может быть использован для обозначения актина.
  6. Вымойте крышки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
  7. Разбавить вторичные антитела или красители в PBS (использовать 30 л на coverslip) и инкубировать 1 ч на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте подвергать образцы прямого света, чтобы сохранить качество сигнала флуоресценции.
  8. Вымойте крышки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
  9. Удалите раствор PBS из крышки.
  10. Добавьте 4 зликатмонтажа реагента в слайд микроскопа. Установите coverslip на слайд с стороны ячейки вниз. Дайте слайдам высохнуть в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию или на RT на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования реагента для монтажа "анти-увядание" (см. таблицу материалов).
  11. Приобретайте флуоресценцию изображения на конфокальный или эпифлуоресцентный микроскоп с 60x или 100x цель погружения масла. Для каждого приобретения рассмотреть передаваемые свет или яркое поле легко определить В-клеток, взаимодействующих с бисером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите трехмерные (3D) изображения, охватывающие всю ячейку с помощью z-стеков. Мы рекомендуем принимать 0,5 мкм толстые стеки, однако это зависит от микроскопа.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие алгоритмы описаны для программного обеспечения ImageJ. Тем не менее, это может быть выполнено с помощью эквивалентного программного обеспечения. Также учитывайте, что для всех измерений интенсивности флуоресценции мы используем интегрированную плотность флуоресценции ("RawIntDen" в ImageJ), так как этот параметр учитывает общее количество флуоресценции в каждом пикселе изображения, принимая во внимание область.

  1. Анализ распределения органелл в В-клетках, активированных с помощью бисера с покрытием Ag
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки поляризации компонентов клеток в ИГ мы определяем произвольное значение как меру близости к ИГ. Индекс колеблется от -1 (антиполяризованный) и 1 (полностью поляризованный, объект на бисе), как это было ранее представлено Reversat et al.12 Лет.
    1. Оцените индекс полярности для аппарата центросомы и Голги(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм может быть использован для органелл, которые ограничены одной точкой.
      1. Сначала определите области бисера и ячеек для анализа с помощью выбора инструментов круга, чтобы разграничить границы обоих, а затем сохраните их как области интереса (ROI). Смотрите Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, и рисунок 4.
      2. Определить центр ячейки(CC) и центр биса (дон.э.)путем запуска Анализ Измерение на участках клеток и бисовой бытия соответственно. Значения X и Y, полученные из окна Результатов, определяют координаты центра.
      3. Вручную определить центр центрального или Golgi аппарата (Органель) с помощью выбора точечного инструмента в ImageJ и запустить анализ Мера. Значения X и Y, полученные из окна результатов, определяют координаты.
      4. Затем нарисуйте угол отCC к Organelle (а) и CC до н.э. (b) с помощью выбора углового инструмента и запустить анализ Мера. Значение угла в окне результатов показывает угол (q) между обоими векторами (a и b).
      5. Рассчитайте индекс полярности с помощью следующей формулы:
        figure-protocol-13406
    2. Оцените индекс полярности для лисосомы(рисунок 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем этот алгоритм для анализа полярности органелл, которые отображают более рассеянное распределение, например, изизосомы.
      1. Определите области бисера и ячейки для анализа, используя выбор инструментов круга, чтобы разграничить границы обоих, и сохранить их в качестве рентабельности инвестиций. После того, как бисер и клеточные области были определены, установить канал флуоресценции и проецировать изображение в один z-стек(Изображение Стеки Проект «Сумма ломтиками»),а затем запустите Анализ Измерьте и извлеките координаты массового центра (MC) (MX и MY) из окон результатов.
      2. Примените тот же алгоритм, упомянутый перед изменением Organelle для MC. Таким образом,угол (q ) определяется CC-MC (a) и CC-BC(b).
      3. Рассчитайте полярность с помощью следующей формулы:
        figure-protocol-14504
    3. Оцените набор лисономы в синаптической области(рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм используется для количественной оценки органеллы, прилегающей к ИГ.
      1. После того, как бисер и области клеток были определены, определить угол вектора между CC и до н.э., а затем повернуть изображение для достижения 0 "угол.
      2. Установите флуоресцентный канал и проеците изображение в один z-стек(Изображение Стеки Проект «Sum slices»),устраняйте всю флуоресценцию, которая выпадает за пределы клетки и области бисера вместе (запуск отображения на улице в ImageJ).
      3. Используя прямоугольник инструмент выбор, нарисуйте прямоугольник, прилегающий к бисору и измерить синаптической области флуоресценции (SAF). Этот прямоугольник составляет четверть ширины ячейки.
      4. Выберите все изображение и запустите анализ Мера для получения всей флуоресценции клеток(WCF).
      5. Рассчитайте процент флуоресценции органеллы, примыкающий к ИГ, используя следующую формулу:
        figure-protocol-15719
    4. Количественная набор клеточных компонентов в центросому.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм, адаптированный изObino et al. 5, используется для количественной оценки обогащения органелл в области центросомы. Короче говоря, мы рассматриваем центросомную область как область, в которой ассоциированная органеле флуоресценция остается постоянной или выше 70% в флуоресценции/радиусе. Необходимо установить этот параметр в условиях покоя, потому что этот радиус может измениться при активации.
      1. После того, как бисер и клеточные области были определены, определить локализацию центросомы с помощью выбора точечного инструмента (рисунок3B).
      2. Во-первых, определить максимальную площадь вокруг центросомы, что можно количественно, нарисовав 3 мкм-радиус круг, окружающий центросоому.
      3. Используйте ImageJ плагин радиальный профиль, который измеряет флуоресценцию в концентрических кругах и отображает флуоресценции / радиус участка.
      4. Определите максимальный радиус, в пределах которого сохраняется не менее 70% интенсивности флуоресценции.
      5. Рассчитайте соотношение плотности флуоресценции с помощью следующей формулы:
        figure-protocol-17055=figure-protocol-17121
        ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение плотности флуоресценции указывает на концентрацию органеллы в центросоме по сравнению с ее распределением во всей клетке.
  2. Анализ распространения клеток и распределения органелл в В-клетках, активированных на Ag-coverslips
    1. Оценка распределения органелл в IS(Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм позволяет количественно количественно распределить органеллы XY и их концентрацию в центре ИГ. Мы определяем соотношение плотности флуоресценции между центральной и общей синаптической областью. Полученные значения могут варьироваться от отрицательных к положительным, что указывает на периферическое или центральное распределение органеллы, соответственно.
      1. Определите срез, в котором клетка находится в контакте с крышкой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для разграничения границ клеток можно маркировать плазменную мембрану или актин, который обогащается на периферии ИГ.
      2. Измените тип среза на 8-разрядный, а затем бинареизировать(Процесс Двоичные Сделать двоичный) и подключить ближайшие точки аутсайдера Процесс Двоичные Контур. Разграничение границ областиклеток (CA) с помощью выбора полигонного инструмента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг полезен для увеличения контрастности границ ячейки и упрощения идентификации. Кроме того, на данный момент, можно применить разъяснение частицы ImageJ для определения CA автоматически. Тем не менее, другие клетки в том же поле может вмешиваться в результаты.
      3. Возьмите параметры CA (высота и ширина) и разграничите центральную округлой области, которая отделена от границ на четверть высоты и ширины значений, рассмотрим эту область как область cell Center (CCA).
      4. Рассчитайте распределение плотности флуоресценции в центре ИС с помощью следующей формулы:
        figure-protocol-19105
    2. Измерение распределения органелл в плоскостях (Рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ определяет общее распределение флуоресценции органеллы между плоскостями В-клеток, активированных на АГ-крышки, показывая процент флуоресценции на фракцию.
      1. Для количественной оценки распределения флуоресценции в З, сначала определить плоскость IS, где ячейка находится в контакте с Ag-coverslip, а затем плоскости, соответствующей верхней предел клетки.
      2. Нарисуйте линию через центр ячейки.
      3. Перерезка изображения в й(Изображение Стеки Reslice), для получения изображения X.
      4. Измерьте высоту и разделите изображение X' на 10 последовательных прямоугольников одинаковой высоты (фракция) от нижней части (интерфейс IS) к верхней (верхней стороне ячейки) и количественно оценивайте сигнал флуоресценции в каждом из них.
      5. Нормализовать интенсивность флуоресценции каждой фракции по сумме общей флуоресценции 10 фракций.
      6. Участок процент интенсивности флуоресценции на долю клетки.

5. Изоляция обогащенной центросомы фракции от отдыха и активированных В-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все растворы при 4 градусах по Цельсию во время эксперимента, чтобы избежать деградации белка. Этот протокол был адаптирован из предыдущей работы17,18.

  1. Активируйте 2 х 107 В-клетки с бусинами с аг покрытием в 2 мл средней CLICK и 2% тепло-инактивированных FBS (коэффициент 1:1). Рассматривайте неактивированные В-клетки как покойные В-клетки.
  2. Добавьте цитохалазин D (2 мкм) и нокодазол (0,2 мкм) и инкубировать на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти препараты используются для мягкого отсоединения центросомы от ядра, путем деполимеризации актина цитоскелет и микротрубочки, соответственно, чтобы избежать ядерного загрязнения.
  3. Вымойте каждый образец с 5 мл холодной 1x TBS (50 мм Tris-HCl, рН 7,6, 150 мм NaCl), а затем с 1 мл 0,1x TBS дополнены 8% сахарозы.
  4. Повторное действие клеток с 150 мл буфера лизосомы (1 мМ HEPES, рН 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 мМ MgCl2, 0,1% бета-Mercaptoethanol, 1 мМ фенилметилфолилов фторид (PMSF) или процеазно-ингибитор ингибитор уменьшается, что указывает на то, что в образце идентифицируется лизис клеток. Положите образец в трубку 1,5 мл.
  5. Центрифуга при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить органеллы от ядра.
  6. Тщательно восстановить супернатант и поместить его на вершине 1,5 мл трубки с 300 мл градиента буфера (ГБ) (10 мМ PIPES pH 7,2, 0,1% Тритон X-100, 0,1% бета-меркаптоэтанол), содержащий 60% сахарозы.
  7. Центрифуга при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы сконцентрировать центросомы в 60% фракции сахарозы.
  8. Между тем, подготовить прерывистый градиент в 2 мл ультрацентрифуговых труб путем наложения 450 Л ГБ и 70% сахарозы с 270 МЛ ГБ и 50% сахарозы, а затем 270 Л ГБ и 40% сахарозы.
  9. После первого центрифугирования (центрососососомного фракции) отбросьте верхнюю фракцию (менее плотную часть) до достижения интерфейса и вихря оставшегося образца в трубке. Затем, наложение на верхней части прерывистого градиента ранее подготовленные с центросоом обогащенный образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарушить градиент, все процедуры пипетки должны быть тщательно выполнены.
  10. Центрифуга при 40 000 х г на 1 ч при 4 градусах Цельсия с минимальным ускорением и с выключенным тормозом центрифуги, чтобы избежать нарушения градиента.
  11. Соберите 12 фракций по 100 л в отдельные трубки, начиная с вершины.
  12. Определите центросомы обогащенных фракций иммуноблотом с помощью з-тубулина в качестве маркера центросомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно находим обогащенные центросом экстракты между фракциями 6 и 8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В настоящей статье показано, как В-клетки могут быть активированы с помощью обездвижеонного антигена на бисере или крышках, чтобы вызвать образование ИГ. Мы предоставляем информацию о том, как определить и количественно поляризации различных органелл с помощью иммун?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описываем комплексный метод изучения того, как Лимфоциты B реорганизуют свою внутриклеточную архитектуру для содействия формированию ИГ. Это исследование включает в себя использование методов визуализации для количественной оценки внутриклеточного распределения органелл, таких ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

M.-I.Y. поддерживается исследовательским грантом от FONDECYT #1180900. J.I., D.F. и J.L. были поддержаны стипендиями от Национального комисиона de Ciencia y Tecnologa. Мы благодарим Дэвида Осорио из Университета Понтифики Каталонии за видеозапись и редактирование.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A212061:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6Abcamab959541:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61Abcamab155751:200 dilution recomended but should be optimized
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab61601:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling32431:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55 Abcamab1704141:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 for Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

Ссылки

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены