JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.

Özet

B hücresi reseptörü (BCR) tarafından yüzeye bağlı antijenlerin tanınması, hem sinyalizasyon hem de antijen alımı koordine edilen bir bağışıklık sinapse (IS) oluşumunu tetikler. Is oluşumu, centrosome ve lisosomlar ve Golgi aparatları gibi hücre içi organellerin sinaptik membranına polarize işe alımı ile birlikte dinamik aksinlerin yeniden biçimlendirilmesi içerir. Aktin remodeling ilk aşamaları B hücreleri kendi hücre yüzeyini artırmak ve antijen-BCR kompleksler sinaps toplanan miktarını maksimize izin verir. Belirli koşullar altında, B hücreleri sert yüzeylerle ilişkili antijenleri tanırken, bu süreç antijen ekstraksiyonu kolaylaştırabilen liksosomların yerel işe alma ve salgılanmasını birleştirilmiştir. Alınan antijenler, büyük histouyumluluk kompleksi II (MHC-II) molekülleri T helper hücrelerine daha fazla sunum için yüklü peptitler içine işleme için özel Endo-lysosome bölmeleri içine emdirilmiş vardır. Bu nedenle, bir IS oluşumu ile ilişkili organel dinamikleri eğitim B hücrelerinin nasıl aktif olduğunu anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda hem görüntüleme hem de hücre içi organel konumlandırma ve B hücrelerinde bir IS oluşumu ile ilişkili siterografi yeniden düzenlemeleri değişiklikleri incelemek için kullanılan bir biyokimyasal tekniği tartışacağız.

Giriş

B lenfositler farklı tehditler ve istila patojenlere karşı antikorlar üreten sorumlu adaptif bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır. Antikor üretiminin verimliliği, B hücrelerinin elde edilmesi, işleyişlerine ve mevcut antijenlere, çözünür veya yüzeye bağlı bir formda1,2' de karşılaşılan yeteneğine göre belirlenir. Sunma hücresinin yüzeyine bağlı antijenlerin tanınması, BCR tarafından, yakın bir hücresel temas oluşumuna yol açar3,4. Bu dinamik platformda BCR 'ye bağımlı akım sinyalizasyon ve antijenlerin Endo-lysosome bölmeler içine inilemasyonu gerçekleşir. Alınan antijenler MHC-II molekülleri üzerine işlenmiş ve monte edilir ve daha sonra T lenfositlerine sunulmuştur. Üretken B-T etkileşimleri, B-T hücre işbirliği olarak adlandırılan, B lenfositlerin antikor üreten plazma hücreleri veya bellek hücreleri içine farklılaşma teşvik uygun sinyalleri almak için izin8.

İki mekanizma B hücreleri tarafından antijen ekstraksiyon dahil edilmiştir. Birincisi Sinaptik yarık5,6' da işe alma ve füzyon geçmesi lisosomlar kaynaklanan proteazların salgılanmasını dayanır. İkincisi, Myosin ııA-mediated Çekme güçleri bu Clathrin kaplı çukurları içine oyulmuş olan antijen içeren membranların invaginasyon tetikler bağlıdır7. Antijenlerin bulunduğu membranın fiziksel özelliklerine antijen ekstraksiyon modu dayanır. Yine de, her iki durumda da, B hücreleri iki büyük remodeling olaylar geçmesi: aktin siterit yeniden yapılanma ve Is için organizler kutuplaşma. Actin sitroiskelet remodeling, sinaptik membranda akin bağımlı çıkıntılar antijen ile temas yüzeyini artıran bir ilk yayılan aşama içerir. Bu bir kasılma aşaması tarafından izlenir, nerede BCrs antijenler ile birleştiğinde, molekül motorları ve aktin sitofülit remodeling tarafından uyumlu eylem tarafından merkezi yoğunlaşmıştır8,9,10, 11. organizasyonun polarizasyon da aktin sitajin remodeling dayanır. Örneğin, centrosome çekirdeğinden, ilişkili actin yerel depolimerizasyon tarafından, bu organel yeniden konumlandırılması için5,12sağlar tarafından unoupled olur. B hücrelerinde, bir hücre Kutbu centrosome yeniden konumlandırılması (IS) sinaptik membran için liksosome işe kılavuzları, hangi salgılanma üzerine çıkarma ve/veya yüzey-gergin antijenlerin işlenmesi kolaylaştırabilir6. Is 'de istihdam edilen lysosomes, T hücrelerinin13' e sunulması için endosomal bölmeler içinde Peptide-MHC-II kompleksleri oluşumunu sağlayan MHC-II ile zenginleştirilmiştir. Ayrıca, Golgi aparatının da yakın Is14için işe olduğu gözlenmiştir, Golgi-sır yolu gelen veziküller antijen ekstraksiyon ve/veya işleme dahil olabileceğini düşündürmektedir.

Sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde hücre içi organel ve siteron yeniden düzenlemeleri, daha fazla aktivasyonu için gerekli olan verimli antijen alımı ve işlenmesine izin veren önemli adımlara sahiptir. Bu çalışmada, B hücrelerinde görüntüleme ve biyokimyasal analizlerin nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı protokoller tanıtmak, bir IS oluşumu ile ilişkili organellerin hücre içi remodeling çalışma. Bu teknikler şunlardır: (i) antijen kaplı boncuklar ile aktif B hücrelerinin Immünofluorescence ve görüntü analizi ve IS ve (ii) için seferber edilmiş hücre içi bileşenlerin görüntüleme ve ölçümleme sağlayan antijen kaplı kapak ) B hücrelerinde centrosome-zenginleştirilmiş fraksiyonları izolasyonlu, sukroz degradeler üzerinde ultracent, protein ile ilişkili proteinlerin tanımlanması, potansiyel Hücre polaritesi düzenleyen dahil sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: aşağıdaki adımları ııA 1,6 B hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi.

1. antijen kaplı boncuk ile B hücresi aktivasyonu

  1. Antijen kaplı boncuklar hazırlanması
    1. B hücrelerini etkinleştirmek için, 3 μm NH2' nin 50 μL (~ 20 x 106 boncuk) kullanılarak hazırlanan (BCR-ligand +) veya aktifleştirmeden (BCR-ligand-) antijenlere sahip olan, kovalent antijen (AG kaplı boncuk) ile kaplı NH2-boncuk kullanın.
    2. IIA 1,6 B hücreleri için anti-IgG-f (AB ')2 parça BCR-ligand + ve anti-IgM-F (AB ')2 veya sığır serum albümin (BSA) olarak BCR-ligand-kullanın. Birincil B hücrelerini veya IgM+ B hücre hattını etkinleştirmek için anti-IgM-F (AB ')2 ' i BCR-LIGAND + ve BSA olarak BCR-ligand-olarak kullanın.
      Not: FC reseptörlerine liglerin bağlanması önlemek Için, F (AB ') veya F (AB ')2 antikor parçaları yerine tam uzunluklu antikorlar kullanın.
    3. AG kaplı boncuklar hazırlanması ile devam etmek için, numune manipülasyon sırasında boncuk kurtarma maksimize etmek için düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpler boncuklar yerleştirin. 1 mL 1x fosfat-tampon tuz ekleyin (PBS) boncuk yıkamak için ve Santrifüjü 16.000 x g için 5 dk. supernatant aspirate.
    4. 500 μL% 8 glutaraldehit ile boncuk resuspend NH2 grupları etkinleştirmek ve oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 4 saat için döndürmek için.
      DIKKAT: glutaraldehit stok çözeltisi sadece kimyasal duman kaputunda kullanılmalıdır. Malzeme Güvenliği Veri sayfası (MSDS) üzerindeki yönergeleri izleyin.
    5. Santrifüjler 16.000 x g 'de 5 dakika, glutaraldehit çıkarın ve 1 ml 1x PBS ile boncukları üç kez daha yıkayın.
      DIKKAT: glutaraldehit çözeltisi tehlikeli bir kimyasal atık olarak atılmalıdır.
    6. 100 μL 1x PBS 'de aktif boncukları yeniden resuspend. Örnek iki düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler ayrılabilir: 50 μL BCR-ligand + ve 50 μL için BCR-ligand-.
    7. Antigen çözeltisi hazırlamak için iki 2 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüjü tüpler içeren 100 μg/mL Antigen çözeltisi 150 μL PBS: BCR-ligand + ve diğer BCR-ligand ile bir tüp-.
    8. 150 μL antijen solüsyonu içeren her tüp için 50 μL aktif boncuk solüsyonu ekleyin, Vortex ve gece 4 °C ' de döndürün.
    9. Diğer reaktif NH2 gruplarının boncuklar üzerinde engellenmesine ve 4 °c ' de 1 h 'ye döndürülmesi için 10 mg/ml bsa 500 μL ekleyin.
    10. 4 °C ' de 5 dakika için 16.000 x g 'de boncuklar santrifüjün ve süpernatant çıkarın. Boncukları soğuk 1x PBS ile üç kez daha yıkayın.
    11. 70 μL 1x PBS 'de aktif boncukları yeniden resuspend.
    12. AG kaplı boncuk son konsantrasyonu belirlemek için, PBS (1:200) boncuk küçük bir hacim seyreltilmiş ve bir hemocytometer kullanarak saymak. Sonra 4 °C ' de kullanıma kadar saklayın.
      Not: AG kaplı boncuklar 1 aydan fazla saklanmamalıdır.
  2. Poly-L-Lysine coverfları hazırlanması
    1. AG kaplı boncuk ile B hücresi aktivasyon assay önce, Poly-L-lizin-kaplı Cover, hazırlamak (PLL-Cover,). PLL çözeltisi 40 mL 0,01% w/v içeren bir 50 mL tüp kullanın ve çözüm içine 12 mm çaplı Cover, daldırın. Gece RT 'de döndürün.
    2. Kapak kuponları 1x PBS ile yıkayın ve parafin filmi ile kaplı 24 kuyu plaka kapağında kurumaya bırakın. B hücresi aktivasyonuna devam edin.
  3. B hücresi aktivasyonu
    1. Boncuk ile b hücresi aktivasyonu başlatmak için, ilk 1,5 x 106 hücreler/ml tıklama Orta (rpmi-1640 2 mm L-alanin-L-glutamin + 55 μM Beta-mercaptoethanol + 1 mm piruvat + 100 U/ml penisilin + 100 μg/ml ile IIA 1,6 B hücre hattı seyreltmek streptomisin) + 5% ısı-inaktive fetal sığır serumu [FBS]).
    2. 100 μL (150.000 hücreleri) ile ııA 1,6 B hücrelerini, 0,6 mL tüplerde 1:1 oranındaki AG kaplı boncuklarla birleştirin. Bir Vortex ve tohumları PLL-coverkuplara hafifçe karıştırın. Bir hücre kültürü kuluçko (37 °C/5% CO2) farklı zaman noktaları için inkübe. Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30, 60 ve 120 dk. 0 zaman için, PLL-coverfları buz üzerindeki 24 kuyu plakası kapağına yerleştirin. Hücreler-AG-kaplamalı boncuk karışımı ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika boyunca inküye.
      Not: Bu örnekteki boncuk sayısını azaltabilir, çünkü pipet plastik ucunda birikimi nedeniyle, yukarı ve aşağı pipetleme yerine Vortex ile karıştırmak önemlidir. Kullanım boncuk BCR-ligand ile kaplı-her tahlil için olumsuz bir kontrol olarak. İlk olarak en uzun inkübasyon süresini ve ardından aşağıdaki zaman noktalarını etkinleştirmenizi öneririz. Aynı anda sabitleme için hazır oldukları gibi örnekleri için etkinleştirme aralıkları hesaplayın.
    3. Aktivasyon işlemini durdurmak ve immünofluorescence protokolüyle devam etmek için her lamel magazini için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin. Bkz. protokol Bölüm 3.

2. B hücre aktivasyonu antijen kaplı Cover,

  1. Antijen kaplı kapakın hazırlanması
    1. Aktivasyonu öncesinde, antijen çözümünü hazırlayın (10 μg/mL BCR-ligand + ve 0,5 μg/mL sıçan Anti-Mouse CD45R/b220 içeren 1x PBS).
      Not: tahlil bir gün önce Cover, hazırlamak düşünün. B220 B hücre yapışma geliştirir, ancak, BCR-ligand + yayılan yanıt oluşturmak için yeterlidir.
    2. 12 mm 'lik lamel magazini, parafin filmi ile kaplı 24 kuyu plaka kapağına yerleştirin, 40 μL antijen solüsyonu her lamel magazini üzerine ekleyin ve gece 4 °c ' de inküye yapın. Antijen çözeltisi buharlaşma önlemek için plaka mühür.
    3. Kapak kuponları 1x PBS ve kuru hava ile yıkayın.
  2. B hücresi aktivasyonu
    1. Aktivasyon başlatmak için, 1,5 x 106 hücreler/ml tıklama orta + 5% FBS için seyreltik IIA 1,6 B hücreleri.
    2. 100 μL hücre üzerinde bir antijen kaplı lamel magazini (AG-lamel magazini) ekleyin ve 37 °c/5% CO2 'de bir hücre kuluçte farklı zaman noktaları için etkinleştirin. Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30 ve 60 dk 'dir.
      Not: Bölüm 1 ' de olduğu gibi, tüm örnekleri aynı anda düzeltmek için en uzun etkinleştirme zaman noktasıyla başlamalar önerilir.
    3. Saat 0 için, 24-kuyu plaka kapağı buz üzerinde AG-coverslip içeren yerleştirin ve hücreleri ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inküye.
    4. Her bir AG-coverslip üzerindeki medyayı dikkatle aspirleştirin ve ardından aktivasyon işlemini durdurmak için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin. İmmünofluorescence protokolüne devam edin. Bkz. Bölüm 3.

3. immunofluorescence

Not: ikincil antikor ııA 1,6 B hücrelerinin BCR ile çapraz reaktivite önlemek Için fare türetilmiş birincil antikorlar kullanmayın.

  1. 1x PBS çıkarın ve her coverslip sabitleme ile devam edin.
    Not: hangi düzeltme ortamını kullanmak için karar vermek Için Antibody/boya veri sayfasını kontrol edin. Örneğin, phalloidin tarafından etiketleme aktin için civarında formaldehite kullanın (PFA) sabitleme orta, ve centrosome tarafından perikentrin kullanımı metanol fikfasyonu ile etiketleme.
    1. 4% PFA ile desteklenen 1x PBS 50 μL ekleyin ve RT 'de 10 dakika boyunca inküye yapın.
      DIKKAT: formaldehit zehirlidir. Bu kimyasallarla çalışmadan önce lütfen MSDS 'YI okuyun. PFA çözümleri sadece eldiven ve güvenlik gözlükleri takan bir kimyasal duman kaputu altında yapılmalıdır. PFA çözeltisi tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalıdır.
    2. Alternatif olarak, 50 μL soğuk metanol ekleyin ve 20 dakika boyunca inküye yapın.
  2. 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    Not: kapak fişi 4 °C ' de bu noktada 1x PBS 'de maksimum üç gün boyunca depolanabilir.
  3. 1x PBS 'ı çıkarın ve 50 μL engelleme tamponunu ekleyin (1x PBS 'de% 2 BSA + 0,3 M gcine) her bir coverslip üzerine takın. 10 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.
  4. Yavaşça aspirate ve 50 μL geçirgen tampon (PB) (0,2% BSA + 0,05% saponin 1x PBS) ekleyin. RT 'de 20 dakika boyunca inküye yapın.
  5. PB 'de antikorlar veya boyalar hazırlayın (coverslip başına 30 μL kullanın) ve RT 'de 1 saat veya 4 °C ' de bir gecede inküye yapın. Ek ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.
    1. Mikrotubul düzenleme Merkezi (mtoc) veya centrosome etiket için aşağıdaki antikorları kullanın: Anti-γ-tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-α-tubulin (1:500), Anti-pericentrin (1:1000).
      Not: centrosome etiketleme B hücreleri Için centrin-GFP ifadesi plazmid ile transfitleştirilebilir.
    2. Golgi cihazları etiketleme için anti-Rab6a (1:500) kullanın.
      Not: diğer antikorlar veya boyalar da kullanılabilir.
    3. Lysosomes etiketleme için, Anti-Lamp1 (1:200) kullanın.
      Not: Anti-H2-DM ve anti-MHC-II de Antigen işleme bölmeleri15,16etiket için kullanılabilir.
    4. Endoplazmik retikulum kullanımı Anti-Sec61a (1:500) etiketleme için.
    5. Aktin sitortik için aşağıdaki düşünün: polimerize aksini floresan boyalar için konjute phalloidin tarafından görüntülenebilir.
      Not: bir LifeAct-GFP/RFP ifadesi Plasmid ile nakledilmiş B hücreleri de actin etiketi için kullanılabilir.
  6. PBS ile coverlar üç kez yıkayın.
  7. PBS 'de ikincil antikor veya boyaların seyreltilmeli (coverslip başına 30 μL kullanın) ve RT 'de 1 saat inkübe.
    Not: flüoresan sinyalinin kalitesini korumak için örnekleri doğrudan ışığa maruz bırakmaktan kaçının.
  8. PBS ile coverlar üç kez yıkayın.
  9. PBS çözümünü kapak kağıtından çıkarın.
  10. Mikroskop kaydırağı için 4 μL montaj reakajına ekleyin. Lamel magazini, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde slayta takın. Slaytların 37 °C ' de 30 dakika veya RT 'de bir gecede kurumasına izin verin.
    Not: "Anti-Fade" montaj reakajının ( malzeme tablosunabakın) kullanmayı düşünün.
  11. 60x veya 100x yağ daldırma amacı ile Konfokal veya epifluorescence mikroskop üzerinde floresan görüntüleri elde. Her satın alma için kolayca boncuk ile etkileşim B hücreleri belirlemek için iletilen ışık veya parlak alan düşünün.
    Not: z-yığınları kullanarak tüm hücreyi kapsayan üç boyutlu (3B) görüntüler alın. 0,5 μm kalınlığında yığınları almanızı öneririz, ancak bu mikroskop bağlıdır.

4. görüntü analizi

Not: Aşağıdaki algoritmalar ımagej yazılımı için açıklanmıştır. Ancak, bu eşdeğer bir yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tüm floresan yoğunluğu ölçümleri için, ımagej 'de entegre floresan yoğunluğu ("RawIntDen") kullanıyoruz, çünkü bu parametre görüntünün her pikselinde toplam floresan miktarını dikkate alarak bölgeyi dikkate alır.

  1. AG kaplı boncuklar ile aktive edilen B hücrelerinde organelleri dağılımı Analizi
    Not: hücre bileşenlerinin IS 'e kutuplaşma miktarını ölçmek Için, IS 'e yakınlık ölçüsü olarak rasgele bir değer tanımlarsınız. Endeks aralıkları-1 (Anti-polarize) ve 1 (tam polarize, boncuk nesne), daha önce reversat ve Al tarafından sunulan gibi.12.
    1. Centrosome ve Golgi aparatları için polarite dizinini tahmin edin (Şekil 1B).
      Not: Bu algoritma, bir nokta ile sınırlı organelleri için kullanılabilir.
      1. Önce her ikisi de sınırlarını sınırlamak için daire aracı seçimi kullanarak çözümlemek için boncuk ve hücre alanlarını tanımlayın ve sonra bunları ilgi BÖLGELERI (YG) olarak kaydedin. Bkz. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4.
      2. Analiz | çalıştırarak hücre merkezini (CC) ve boncuk merkezini (BC) belirleyin | Hücre ve boncuk alanlarında sırasıyla ölçmek. Sonuçlar penceresinden elde edilen X ve Y değerleri, Merkez koordinatlarını belirler.
      3. Imagej 'deki nokta aracı seçimini kullanarak centrosome veya Golgi aparatının (organelle) merkezini el ile belirleyin ve Analyze 'i çalıştırın | Ölçmekiçin. Sonuçlar penceresinden elde edilen X ve Y değerleri koordinatları belirler.
      4. Daha sonra, açı aracı seçimini kullanarak CC 'den organelle 'ye (a) ve CC 'ye (b) bir açı çizin ve Analyze 'i çalıştırın | Ölçmekiçin. Sonuçlar penceresindeki açı değeri, her iki vektörler arasındaki açı (α) gösterir (a ve b).
      5. Aşağıdaki formülü kullanarak polarite dizinini hesaplayın:
        figure-protocol-12808
    2. Lisosomlar için polarite indeksini tahmin edin (Şekil 1F).
      Not: Bu algoritmayı, lysosomes gibi daha dağınık bir dağıtım gösteren organörlerin polaritini analiz etmek için kullanırız.
      1. Her ikisi de sınırlarını sınırlamak için daire aracı seçimini kullanarak analiz etmek için parça ve hücre alanlarını TANıMLAYıN ve YG olarak kaydedin. Boncuk ve hücre alanları determind olduktan sonra, floresan kanalını ayarlayın ve görüntüyü tek bir z yığınına (resim | Yığınlar | Z-proje [Sum Slice]), sonra çalıştırın Analyze | Sonuç pencerelerini Kütle Merkezi (MC) koordinatlarını (MX ve My) ölçün ve ayıklayın.
      2. MC için organelle değiştirmeden önce bahsedilen aynı algoritmayı uygulayın. Böylece, açı (α) CC-MC (a) ve CC-BC (b) tarafından tanımlanır.
      3. Aşağıdaki formülü kullanarak polaritesi hesaplayın:
        figure-protocol-13860
    3. Sinaptik alana Lizozom işe alım tahmin (Şekil 2B).
      Not: Bu algoritma, IS 'e bitişik bir organel ölçmek için kullanılır.
      1. Boncuk ve hücre alanları belirlendikten sonra, CC ile BC arasındaki vektör açısını belirleyin ve ardından 0 ° açı elde etmek için görüntüyü döndürün.
      2. Floresan kanalını ayarlayın ve görüntüyü tek bir z-yığını içine proje (resim | Yığınlar | Z-Project [Sum Slice]), hücre ve boncuk alanının dışında kalan tüm floresans ortadan kaldırır (Edit | ımagej dışında Clear çalıştırın).
      3. Dikdörtgen aracı seçimi kullanarak, boncuk bitişik bir dikdörtgen çizin ve sinaptik alan floresans (saf) ölçmek. Bu Dikdörtgen Hücre genişliğinin dörtte biridir.
      4. Tüm görüntüyü seçin ve Çalıştır Analyze | Tüm hücre floresans (WCF) elde etmek için ölçü.
      5. Aşağıdaki formülü kullanarak IS 'in bitişiğindeki organel floresan yüzdesini hesaplayın:
        figure-protocol-14984
    4. Hücresel bileşenlerin centrosome 'e alınmasını ölçmek.
      Not: Obino ve al.5' ten uyarlanan bu algoritma, centrosome bölgesinde organerin zenginleşmesi için kullanılır. Kısaca, biz centrosome ilişkili organel floresan floresan/yarıçaplı arsa içinde% 70 üzerinde sabit veya yukarıda kalır alan olarak centrosome alan düşünün. Bu RADIUS etkinleştirme sırasında değişebilir çünkü dinlenme koşullarında bu parametreyi ayarlamak için esastır.
      1. Boncuk ve hücre alanları belirlendikten sonra, nokta aracı seçimini kullanarak centrosome lokalizasyonunu tanımlayın (Şekil 3B).
      2. İlk olarak, centrosome etrafında 3 μm yarıçapı daire çizerek, ölçmek mümkün olan centrosome çevresindeki maksimum alanı belirlemek.
      3. Eşmerkezli çevrelerde floresans ölçer ve bir floresan/yarıçaplı Plot görüntüler ımagej eklentisi radyal profilkullanın.
      4. Floresans yoğunluğunun en az% 70 ' inin korunduğu maksimum yarıçapı belirleyin.
      5. Aşağıdaki formülü kullanarak floresan yoğunluğu oranını hesaplayın:
        figure-protocol-16189=figure-protocol-16255
        Not: floresans yoğunluğu oranı, tüm hücredeki dağılımına kıyasla centrosome 'de bir organel konsantrasyonunu gösterir.
  2. AG-coverfiş üzerinde aktif B hücrelerinde hücre yayma ve organörler dağılımı Analizi
    1. Is 'de organel dağıtımını tahmin edin (Şekil 4b).
      Not: Bu algoritma, org 'un XY dağılımının ve IS 'in merkezinde konsantrasyonunun ölçülmesini sağlar. Biz merkezi ve toplam sinaptik alanı arasında floresan yoğunluğu oranı tanımlayın. Elde edilen değerler, sırasıyla organelle bir periferik veya merkezi bir dağılım gösteren negatife göre farklılık gösterebilir.
      1. Hücrenin Kapla temas ettiği dilimi belirleyin.
        Not: hücre sınırlarını sınırlamak Için, IS 'in çevresinde zenginleştirilmiş plazma membranı veya aksini etiketleyebilirsiniz.
      2. Dilimin türünü 8-bit olarak değiştirin, ardından binarize (Process | İkili | Ikili olun) ve en yakın yabancı noktalarını bağlayın işlem | İkili | Anahat. Çokgen aracı seçimi kullanarak hücre alanının (CA) sınırlarını sınırlandırın.
        Not: Bu adım, hücre sınırlarını kontrast artırmak ve daha kolay tanımlamak için yararlıdır. Ayrıca, bu noktada, CA otomatik olarak belirlemek için ımagej analiz parçacık eklentisi uygulamak mümkündür. Ancak, aynı alandaki diğer hücreler sonuçlara engel olabilir.
      3. CA parametrelerini (yükseklik ve genişlik) alın ve sınırlardan yükseklik ve genişlik değerlerinin dörtte birini ayıran merkezi bir yuvarlatılmış alanı sınırlandırın, bu alanı hücre merkezi alanı (CCA) olarak düşünün.
      4. Aşağıdaki formülü kullanarak IS 'in merkezindeki floresan yoğunluğu dağılımını hesaplayın:
        figure-protocol-18091
    2. Z düzlemlerinde organel dağıtımını ölçün (Şekil 4c).
      Not: Bu analiz, B hücrelerinin z düzlemleri üzerinde, z fraksiyonu başına floresan yüzdesini gösteren, AG-coverflarına aktif hale gelen organel floresans genel dağıtımını belirler.
      1. Z 'de floresan dağılımı ölçmek için, ilk olarak hücrenin AG-coverslip ile temas halinde olduğu IS 'in düzlemini ve ardından hücrenin üst sınırına karşılık gelen uçağı belirleyin.
      2. Hücre merkezi boyunca bir çizgi çizin.
      3. Z 'de görüntüyü reslice (resim | Yığınlar | Reslice), BIR XZ görüntü elde etmek için.
      4. Yüksekliği ölçün ve XZ görüntüsünü Alta (IS arabirimi) üst kısmına (hücrenin üst tarafında) aynı yükseklikte (Z Kesir) 10 ardışık dikdörtgenine bölün ve her birinde floresan sinyalini ölçün.
      5. Her Z kesinin floresan yoğunluğunu 10 fraksiyonunun toplam floresan toplamı ile normalleştirin.
      6. Hücrenin Z kesir başına floresan yoğunluğu yüzdesini çizin.

5. dinlenme ve aktif B hücrelerinden centrosome zenginleştirilmiş fraksiyonunun yalıtımı

Not: protein bozulması önlemek için deney sırasında 4 °C tüm çözümleri tutun. Bu protokol önceki çalışma17,18uyarlanmıştır.

  1. 2 x 107 B hücreleri, 2 ml tıklama Orta + 2% ısı-INAKTIVE FBS (oran 1:1) ile AG kaplı boncuklar ile etkinleştirin. Aktif olmayan B hücrelerini dinlenme B hücreleri olarak düşünün.
  2. D (2 μM) ve nocodazole (0,2 μM) sitoboz ekleyin ve 37 °C ' de 1 h için inküye yapın.
    Not: Bu ilaçlar, nükleer kontaminasyonu önlemek için sırasıyla, aktin sitroiskelet ve microtubules depolymerizing tarafından, çekirdeğin sentini yavaşça ayırmak için kullanılır.
  3. Her numuneyi 5 mL soğuk 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) ile yıkayın ve sonra 1 mL 0.1 x TBS ile% 8 sakaroz ile tamamlayıcı.
  4. 150 μL centrosome lizis tampon ile hücreleri resuspend (1 mm HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mm MgCl2, 0,1% Beta-mercaptoetanol, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) veya proteaz inhibitör kokteyl) ve pipet kadar viskozite kadar hücre liziz örnekteki saptanmıştır gösterir azalır. Örnek bir 1,5 mL tüp koyun.
  5. 10.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü, organelleri çekirdekten ayırmak için.
  6. Dikkatle süpernatant kurtarmak ve 300 μL gradyan tampon (GB) (10 mm borular pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-mercaptoethanol) ile 1,5 ml tüp üstüne yerleştirin 60% sucrose.
  7. 10.000 x g 'de 4 °c ' de 30 dakika santrifüjler% 60 sakaroz fraksiyonunda centrosomes konsantre.
  8. Bu arada, 450 μL GB + 70% sakaroz ile 270 μL GB + 50% sakaroz ve daha sonra 270 μL GB + 40% sakaroz tarafından taşarak 2 ml 'lik ultracent, tüp içinde kesintisiz degrade hazırlayın.
  9. İlk Santrifüjden sonra (centrosome-konsantre fraksiyonu), arayüze ulaşıncaya kadar üst kesir (daha az yoğun kısmı) atın ve tüp kalan numune Vortex. Daha sonra, daha önce centrosome zenginleştirilmiş örnek ile hazırlanan kesintisiz gradyan üstüne bindirme.
    Not: degradeyi bozmamaya dikkat edin, tüm pipetleme prosedürlerinin dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir.
  10. 4 °C ' de 1 h için 40.000 x g 'de santrifüjün minimumunda ve santrifüjli frenden kapalı olarak ayarlanması, degradeyi bozmamak için.
  11. 100 μL 12 fraksiyonları üst başından başlayarak ayrı tüplere toplayın.
  12. Centrosome Marker olarak γ-tubulin kullanarak immünoblot tarafından Sental zenginleştirilmiş fraksiyonları belirleyin.
    Not: Biz genellikle kesirler 6 ve 8 arasında centrosome zenginleştirilmiş özler bulabilirsiniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu makalede, B hücrelerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için boncuk veya Cover, immobilize antijen kullanılarak nasıl aktive edilebilir gösterir. Biz nasıl tanımlanacağı ve immünofluorescence tarafından farklı organizlerin polarizasyon ölçmek ve nasıl, Is için polarize centrosome, kendi birlikteliği dinamik değişiklikler geçmesi proteinleri karakterize hakkında bilgi sağlamak bir kullanarak biyokimyasal yaklaşım.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

B lenfositlerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için hücre içi mimarisini nasıl yeniden organize ettiğini incelemek için kapsamlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışmada, B hücresi aktivasyonu sırasında centrosome, Golgi aparatı ve lisosomlar gibi organellerin hücre içi dağılımını ölçmek için görüntüleme tekniklerini ve IS 'e nasıl polarize edildiğini içerir. Ayrıca, B hücresi aktivasyonu üzerine centrosome bileşiminde değişiklikleri incelemek için bir biyokimyasal yaklaşım açı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

M.-I.Y. FONDECYT #1180900 bir araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. J.I., D.F. ve si., Comisión Nacional de ciencia y Tecnología 'dan Burslar tarafından destekleniyor. Biz video kayıt ve düzenleme için Pontificia Universidad Católica de Chile David Osorio teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A212061:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6Abcamab959541:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61Abcamab155751:200 dilution recomended but should be optimized
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab61601:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling32431:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55 Abcamab1704141:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 for Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

Referanslar

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonSay 148H cre polaritesilysosomessitrolojikSentrikba kl k sinapsB lenfositlerg r nt analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır