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Résumé

Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d'un IS. La première, implique la quantification du recrutement d'organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.

Résumé

La reconnaissance des antigènes attachés de surface par le récepteur des cellules B (BCR) déclenche la formation d'une synapse immunitaire (IS), où la signalisation et l'apport d'antigènes sont coordonnés. La formation d'IS implique le remodelage dynamique d'actine accompagné du recrutement polarisé à la membrane synaptique des organites intracellulaires centrosomes et associés tels que des lysosomes et l'appareil de Golgi. Les premières étapes du remodelage de l'actine permettent aux cellules B d'augmenter leur surface cellulaire et de maximiser la quantité de complexes antigènes-BCR recueillis à la synapse. Dans certaines conditions, lorsque les cellules B reconnaissent les antigènes associés aux surfaces rigides, ce processus est couplé au recrutement local et à la sécrétion de lysosomes, ce qui peut faciliter l'extraction d'antigènes. Les antigènes pris sont intériorisés dans des compartiments endo-lysosome spécialisés pour le traitement en peptides, qui sont chargés sur des molécules majeures du complexe d'histocompatibilité II (MHC-II) pour une présentation ultérieure aux cellules d'aide T. Par conséquent, l'étude de la dynamique des organites associée à la formation d'un SI est cruciale pour comprendre comment les cellules B sont activées. Dans le présent article, nous discuterons à la fois de l'imagerie et d'une technique biochimique utilisée pour étudier les changements dans le positionnement intracellulaire des organites et les réarrangements cytosquelettes qui sont associés à la formation d'un IS dans les cellules B.

Introduction

Les lymphocytes B sont une partie essentielle du système immunitaire adaptatif responsable de la production d'anticorps contre différentes menaces et d'envahissement des agents pathogènes. L'efficacité de la production d'anticorps est déterminée par la capacité des cellules B à acquérir, traiter et présenter les antigènes rencontrés sous une forme soluble ou en surface1,2. La reconnaissance des antigènes attachés à la surface d'une cellule de présentation, par le BCR, conduit à la formation d'un contact intercellulaire étroit appelé IS3,4. Dans cette plate-forme dynamique, la signalisation en aval dépendante de BCR et l'internalisation des antigènes dans les compartiments endo-lysosome ont lieu. Les antigènes pris sont traités et assemblés sur des molécules MHC-II et ensuite présentés aux lymphocytes T. Les interactions productives B-T, appelées coopération de cellules B-T, permettent aux lymphocytes B de recevoir les signaux appropriés, qui favorisent leur différenciation en cellules plasmatiques productrices d'anticorps ou cellules de mémoire8.

Deux mécanismes ont été impliqués dans l'extraction d'antigènes par les cellules B. La première s'appuie sur la sécrétion de protéases issues de lysosomes qui subissent le recrutement et la fusion à la fente synaptique5,6. Le second, dépend des forces de traction Myosin IIA-négociées qui déclenche l'invagination de l'antigène contenant des membranes qui sont intériorisées dans des fosses enduites de clathrine7. Le mode d'extraction d'antigènes repose sur les propriétés physiques de la membrane dans laquelle se trouvent les antigènes. Néanmoins, dans les deux cas, les cellules B subissent deux événements majeurs de remodelage : la réorganisation du cytosquelette d'actine et la polarisation des organites à l'IS. Le remodelage du cytosquelette d'Actin implique une étape initiale de propagation, où les protubérances actin-dépendantes à la membrane synaptique augmentent la surface en contact avec l'antigène. Elle est suivie d'une phase de contraction, où les BCR couplés avec des antigènes sont concentrés au centre de l'IS par l'action concertée des moteurs moléculaires et de cytosquelette d'actine transformant8,9,10, 11. La polarisation des organites repose également sur le remodelage du cytosquelette d'actine. Par exemple, le centrosome se découple du noyau, par dépolymérisation locale de l'actine associée, ce qui permet le repositionnement de cette organite à l'IS5,12. Dans les cellules B, le repositionnement du centrosome à un pôle cellulaire (IS) guide le recrutement lysosome à la membrane synaptique, qui sur la sécrétion peut faciliter l'extraction et/ou le traitement des antigènes de surface6. Les lysosomes recrutés à l'EI sont enrichis de MHC-II, qui favorise la formation de complexes peptide-MHC-II dans des compartiments endosomal s'ils seront présentés aux lymphocytes T13. En outre, l'appareil Golgi a également été observé pour être étroitement recruté à l'IS14, suggérant que les vésicules golgi-dérivées de la voie sécrétrice pourraient être impliquées dans l'extraction et/ou le traitement d'antigène.

Au total, les réarrangements intracellulaires d'organelle et de cytosquelette dans les cellules De B pendant la formation de synapse sont les étapes principales qui permettent l'acquisition et le traitement efficaces d'antigène exigés pour leur activation plus loin. Dans ce travail, nous introduisons des protocoles détaillés sur la façon d'effectuer l'imagerie et l'analyse biochimique dans les cellules B pour étudier le remodelage intracellulaire des organites associés à la formation d'un IS. Ces techniques comprennent : (i) Immunofluorescence et analyse d'image des cellules B activées avec des perles enduites d'antigène et sur des couvertures enduites d'antigène, ce qui permet la visualisation et la quantification des composants intracellulaires qui sont mobilisés vers l'IS et (ii ) l'isolement des fractions centrosome-enrichies dans les cellules De B par ultracentrifugation sur des gradients de saccharose, qui permet l'identification des protéines liées au centrosome, potentiellement impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire.

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Protocole

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été exécutées utilisant des cellules IIA1.6 B.

1. Activation des cellules B avec perles enduites d'antigène

  1. Préparation de perles enduites d'antigène
    1. Pour activer les cellules B, utilisez des perles NH2-covalentes enduites d'antigène (perles enduites d'Ag), qui sont préparées à l'aide de 50 l (20 x 106 perles) de 3 m NH2-perles avec activation (BCR-ligand) ou non-activation (BCR-ligand-) antigènes.
    2. Pour les cellules IIA1.6 B, utiliser des fragments anti-IgG-F(ab')2 comme BCR-ligandMD et anti-IgM-F(ab')2 ou l'albumine de sérum bovin (BSA) comme BCR-ligand-. Pour activer les cellules B primaires ou la lignée de cellules IgMet B, utilisez l'anti-IgM-F(ab')2 comme BCR-ligandMD et BSA comme BCR-ligand-.
      REMARQUE : Pour éviter la liaison des ligands au récepteur Fc, utilisez f(ab') ou F(ab')2 fragments d'anticorps au lieu d'anticorps pleine longueur.
    3. Pour procéder à la préparation des perles enduites d'Ag, placez les perles dans des tubes microcentrifugeurs à faible teneur en protéines afin de maximiser la récupération des perles pendant la manipulation de l'échantillon. Ajouter 1 ml de saline tamponnée de 1x phosphate (PBS) pour laver les perles et la centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant.
    4. Resuspendre les perles avec 500 L de 8% de glutaraldéhyde pour activer les groupes NH2 et tourner pendant 4 h à température ambiante (RT).
      CAUTION: La solution de stock de glutaraldéhyde ne doit être utilisé que dans une hotte de fumée chimique. Suivez les instructions sur la fiche de données sur la sécurité des matériaux (MSDS).
    5. Centrifugeuses perles à 16.000 x g pendant 5 min, enlever le glutaraldéhyde et laver les perles trois fois de plus avec 1 ml de 1x PBS.
      CAUTION: La solution de glutaraldéhyde doit être jetée comme un déchet chimique dangereux.
    6. Resuspendre les perles activées dans 100 OL de 1x PBS. L'échantillon peut être divisé en deux tubes microcentrifuges à faible teneur en protéines : 50 l pour le BCR-ligandet et 50 l pour le BCR-ligand-.
    7. Pour préparer la solution antigène, utilisez deux tubes microcentrifugeurs à faible teneur en protéines de 2 ml contenant 100 g/mL de solution antigène dans 150 L de PBS : un tube avec BCR-ligandMD et d'autres avec BCR-ligand-.
    8. Ajouter 50 l de perles activées solution à chaque tube contenant 150 L de solution antigène, vortex et tourner pendant la nuit à 4 oC.
    9. Ajouter 500 oL de BSA de 10 mg/mL pour bloquer les groupes NH2 réactifs restants sur les perles et tourner pendant 1 h à 4 oC.
    10. Centrifuger les perles à 16 000 x g pendant 5 min à 4 oC et retirer le supernatant. Laver les perles avec froid 1x PBS trois fois de plus.
    11. Resuspendre les perles activées dans 70 'L de 1x PBS.
    12. Pour déterminer la concentration finale de perles enduites d'Ag, diluer un petit volume de perles dans PBS (1:200) et compter à l'aide d'un hémocytomètre. Conserver ensuite à 4 oC jusqu'à utilisation.
      REMARQUE : Les perles enduites d'ag ne doivent pas être entreposées pendant plus d'un mois.
  2. Préparation des couvertures de poly-L-lysine
    1. Avant l'action d'activation de la cellule B avec des perles enduites d'Ag, préparez des couvertures enduites de poly-L-lysine (couvertures De PLL). Utilisez un tube de 50 ml contenant 40 ml de solution PLL de 0,01 % et plongez les couvercles de 12 mm de diamètre dans la solution. Tournez toute la nuit à RT.
    2. Laver les couvercles avec 1x PBS et laisser sécher sur un couvercle de plaque de 24 puits recouvert de film de paraffine. Procédez à l'activation des cellules B.
  3. Activation des cellules B
    1. Pour commencer l'activation des cellules B avec des perles, diluer d'abord la lignée cellulaire IIA1.6 B à 1,5 x 106 cellules/mL dans le milieu CLICK (RPMI-1640 complété par 2 mM L-Alanine-L-Glutamine - 55 M bêta-mercaptoethanol - 1 mM pyruvate - 100 U/mL Penicillin streptomycine) - sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur de 5 % [FBS]).
    2. Combinez 100 L (150 000 cellules) de cellules IIA1.6 B avec des perles enduites d'Ag à un rapport de 1:1 dans des tubes de 0,6 mL. Mélanger délicatement à l'aide d'un vortex et de graines sur des couvertures de PLL. Incuber pour différents points de temps dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC / 5 % CO2). Les points de temps d'activation typiques sont 0, 30, 60 et 120 min. Pour le temps 0, placez les plaques pLL-couvertures dans le couvercle de plaque de 24 puits sur la glace. Ajouter le mélange de perles enduits de cellules Ag et incuber 5 min sur glace.
      REMARQUE : Il est important de mélanger par vortex au lieu de pipetting de haut en bas, parce que ceci pourrait réduire le nombre de perles dans l'échantillon, en raison de leur accumulation dans la pointe en plastique de la pipette. Utilisez des perles enduites de BCR-ligand- comme un contrôle négatif pour chaque test. Nous vous recommandons d'activer d'abord le temps d'incubation le plus long, puis les moments suivants. Calculer les intervalles d'activation pour les échantillons de telle sorte qu'ils sont prêts pour la fixation en même temps.
    3. Ajouter 100 L de 1x PBS froid à chaque bordereau pour arrêter l'activation et continuer avec le protocole d'immunofluorescence. Voir la section 3 du protocole.

2. Activation des cellules B sur les couvertures enduites d'antigène

  1. Préparation de couvre-cheveux enduits d'antigène
    1. Avant l'activation, préparez la solution antigène (1x PBS contenant 10 g/mL BCR-ligandMD et 0,5 g/mL rat anti-souris CD45R/B220).
      REMARQUE : Envisagez de préparer les fiches de couverture la veille de l'assidu. B220 améliore l'adhérence des cellules B, cependant, le BCR-Ligand est suffisant pour générer la réponse de propagation.
    2. Placer la glissière de couverture de 12 mm sur un couvercle de plaque de 24 puits recouvert d'un film de paraffine, ajouter 40 l de solution d'antigène sur chaque bordereau et incuber à 4 oC pendant la nuit. Scellez la plaque pour éviter l'évaporation de la solution antigène.
    3. Laver les couvercles avec 1x PBS et sécher à l'air.
  2. Activation des cellules B
    1. Pour commencer l'activation, diluer les cellules IIA1.6 B à 1,5 x 106 cellules/mL dans le milieu CLICK , 5 % FBS.
    2. Ajouter 100 l de cellules sur un bordereau enduit d'antigène (Ag-coverslip) et activer pour différents points de temps dans un incubateur cellulaire à 37 oC / 5 % de CO2. Les points de temps d'activation typiques sont 0, 30 et 60 min.
      REMARQUE : Comme dans la section 1, nous vous recommandons de commencer par le point de temps d'activation le plus long afin de fixer tous les échantillons en même temps.
    3. Pour le temps 0, placez le couvercle de plaque de 24 puits contenant le glissement de couvercle Ag sur la glace et ajoutez les cellules. Incuber 5 min sur glace.
    4. Aspirez soigneusement le support sur chaque Glissement d'Ag, puis ajoutez 100 L de 1x PBS froid pour arrêter l'activation. Continuer avec le protocole d'immunofluorescence. Voir la section 3.

3. Immunofluorescence

REMARQUE : Pour éviter la réactivité croisée de l'anticorps secondaire avec le BCR des cellules IIA 1.6 B, n'utilisez pas d'anticorps primaires dérivés de la souris.

  1. Retirez le 1x PBS et procédez à la fixation de chaque bordereau de couverture.
    REMARQUE : Pour décider quel support de fixation utiliser, vérifiez la fiche de données sur l'anticorps/teinture. Par exemple, pour l'étiquetage de l'actine par phalloidin utiliser le paraformaldéhyde (PFA) milieu de fixation, et pour l'étiquetage centrosome par la fixation du méthanol utilisation pericentrin.
    1. Ajouter 50 OL de 1x PBS complété avec 4% DE PFA et incuber pendant 10 min à RT.
      CAUTION: Le formaldéhyde est toxique. S'il vous plaît lire le MSDS avant de travailler avec ce produit chimique. Les solutions PFA ne doivent être fabriquées que sous une hotte à fumée chimique portant des gants et des lunettes de sécurité. La solution PFA doit être jetée comme un déchet chimique dangereux.
    2. Vous pouvez également ajouter 50 l de méthanol froid et incuber pendant 20 min.
  2. Laver trois fois avec 1x PBS.
    REMARQUE : Les fiches de couverture peuvent être stockées à 4 oC à ce stade pendant trois jours maximum en 1x PBS.
  3. Retirez 1x PBS et ajoutez 50 l de tampon de blocage (2% BSA - 0,3 M de glycine en 1x PBS) sur chaque bordereau. Incuber à RT pendant 10 min.
  4. Aspirez doucement et ajoutez 50 l de tampon de perméabilisation (PB) (0,2 % BSA et 0,05 % de saponine en 1x PBS). Incuber à RT pendant 20 min.
  5. Préparer les anticorps ou les colorants dans pb (utiliser 30 l par bordereau) et couver à RT pendant 1 h ou toute la nuit à 4 oC. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails.
    1. Pour étiqueter le centre d'organisation de microtubules (MTOC) ou le centrosome utiliser les anticorps suivants: anti-Tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
      REMARQUE : Pour l'étiquetage centrosome, les cellules B peuvent être transfectées avec un plasmide d'expression centrin-GFP.
    2. Pour l'étiquetage appareil Golgi utiliser anti-Rab6a (1:500).
      REMARQUE : D'autres anticorps ou colorants peuvent également être utilisés.
    3. Pour étiqueter les lysosomes, utilisez anti-Lamp1 (1:200).
      REMARQUE: Anti-H2-DM et anti-MHC-II peuvent également être utilisés pour étiqueter les compartiments de traitement de l'antigène15,16.
    4. Pour l'étiquetage endoplasmic reticulum utiliser anti-Sec61a (1:500).
    5. Pour actin cytosquelette considérer ce qui suit: actine polymère peut être visualisé par Phalloidin conjugué à des colorants fluorescents.
      REMARQUE : Les cellules B transfectées avec un plasmide d'expression LifeAct-GFP/RFP peuvent également être utilisées pour étiqueter l'actine.
  6. Laver les fiches de couverture trois fois avec PBS.
  7. Diluer l'anticorps secondaire ou les colorants dans le PBS (utiliser 30 l par bordereau) et couver 1 h à RT.
    REMARQUE : Évitez d'exposer les échantillons à la lumière directe pour préserver la qualité du signal de fluorescence.
  8. Laver les fiches de couverture trois fois avec PBS.
  9. Retirez la solution PBS des couvertures.
  10. Ajouter 4 ll de réactif de montage à une lame de microscope. Montez la glissière sur la glissière avec le côté cellulaire vers le bas. Laisser sécher les lames pendant 30 min à 37 oC ou à RT pendant la nuit.
    REMARQUE : Envisagez d'utiliser un réactif de montage « anti-fade » (voir le Tableau des matériaux).
  11. Acquérir des images de fluorescence sur un microscope confocal ou épifluorescence avec un objectif d'immersion d'huile 60x ou 100x. Pour chaque acquisition, considérez la lumière transmise ou le champ lumineux pour identifier facilement les cellules B qui interagissent avec les perles.
    REMARQUE : Prenez des images tridimensionnelles (3D), couvrant toute la cellule à l'aide de z-stacks. Nous vous recommandons de prendre des piles de 0,5 m d'épaisseur, mais cela dépend du microscope.

4. Analyse d'image

REMARQUE : Les algorithmes suivants sont décrits pour le logiciel ImageJ. Toutefois, cela peut être effectué à l'aide d'un logiciel équivalent. En outre, considérez que pour toutes les mesures d'intensité de fluorescence nous utilisons la densité intégrée de fluorescence ("RawIntDen" dans ImageJ), parce que ce paramètre tient compte de la quantité totale de fluorescence dans chaque pixel de l'image, en tenant compte de la zone.

  1. Analyse de la distribution des organites dans les cellules B activées avec des perles ag-enduites
    REMARQUE : Pour quantifier la polarisation des composants cellulaires à l'IS, nous définissons une valeur arbitraire comme mesure de proximité avec l'IS. L'indice varie entre -1 (anti-polarisé) et 1 (entièrement polarisé, objet sur la perle), comme cela a été présenté précédemment par Reversat et al.12 Ans, états-unis.
    1. Estimer l'indice de polarité de l'appareil centrosome et Golgi (figure 1B).
      REMARQUE: Cet algorithme peut être utilisé pour les organites qui sont confinés à un point.
      1. Définir d'abord les zones de perles et de cellules à analyser à l'aide de la sélection de l'outil de cercle pour délimiter les limites des deux, puis les enregistrer en tant que régions d'intérêt (ROI). Voir Figure 1, Figure 2, Figure 3, et Figure 4.
      2. Déterminer le centre cellulaire (CC) et le centre de perles (BC) en exécutant Analyze Mesurer les zones cellulaires et perles respectivement. Les valeurs X et Y obtenues à partir de la fenêtre Résultats déterminent les coordonnées du centre.
      3. Déterminer manuellement le centre de l'appareil centrosome ou Golgi (Organelle) en utilisant la sélection d'outils de point dans ImageJ et exécuter Analyser Mesure. Les valeurs X et Y obtenues à partir de la fenêtre Résultats déterminent les coordonnées.
      4. Ensuite, tirez un angle de CC à Organelle (a) et CC à BC (b) en utilisant la sélection de l'outil d'angle et exécuter Analyser Mesure. La valeur d'angle dans la fenêtre de résultats montre l'angle ()entre les deux vecteurs (a et b).
      5. Calculez l'indice de polarité en utilisant la formule suivante :
        figure-protocol-14511
    2. Estimer l'indice de polarité des lysosomes (Figure 1F).
      REMARQUE : Nous utilisons cet algorithme pour analyser la polarité des organites qui affichent une distribution plus dispersée, comme les lysosomes.
      1. Définir les zones de perles et de cellules à analyser, en utilisant la sélection d'outils de cercle pour délimiter les limites des deux, et les enregistrer comme retour sur investissement. Une fois que les zones de perles et de cellules ont été déterminées, définir le canal de fluorescence et projeter l'image dans un z-pile (Image Piles ( Z-Project [Sum slices], puis exécuter Analyze Mesurer et extraire les coordonnées du centre de masse (MC) (MX et MY) à partir des fenêtres de résultats.
      2. Appliquer le même algorithme mentionné avant de changer Organelle pour MC. Ainsi, l'angle est défini par CC-MC (a) et CC-BC (b).
      3. Calculez la polarité à l'aide de la formule suivante :
        figure-protocol-15655
    3. Estimer le recrutement de lysosome synaptiques dans la zone synaptique (figure 2B).
      REMARQUE : Cet algorithme est utilisé pour quantifier une organelle adjacente à l'IS.
      1. Une fois que les zones de perles et de cellules ont été déterminées, déterminez l'angle du vecteur entre le CC et la Colombie-Britannique, puis faites pivoter l'image pour atteindre un angle de 0 degrés.
      2. Définir le canal fluorescent et projeter l'image en un seul z-stack (Image Piles ( Z-Project [Sum slices]), éliminer toute la fluorescence qui tombe à l'extérieur de la cellule et la zone de perles ensemble (exécuter modifier l'extérieur dans ImageJ).
      3. À l'aide de la sélection de l'outil rectangle, dessiner un rectangle adjacent à la perle et mesurer la fluorescence de la zone synaptique (SAF). Ce rectangle est un quart de la largeur des cellules.
      4. Sélectionnez l'image entière et exécutez Analyze Mesure pour obtenir la fluorescence cellulaire entière (WCF).
      5. Calculer le pourcentage de fluorescence des organelles adjacent à l'IS en utilisant la formule suivante :
        figure-protocol-16985
    4. Quantifier le recrutement de composants cellulaires au centrosome.
      REMARQUE : Cet algorithme, adapté d'Obino et coll.5, est utilisé pour quantifier l'enrichissement des organites dans la zone centrosome. En bref, nous considérons la zone centrosome comme le domaine dans lequel la fluorescence d'organelle centrosome-associée reste constante ou au-dessus de 70% dans la parcelle de fluorescence/radius. Il est essentiel de définir ce paramètre aux conditions de repos car ce rayon pourrait changer lors de l'activation.
      1. Une fois que les zones de perles et de cellules ont été déterminées, définissez la localisation du centrosome à l'aide de la sélection de l'outil de point (Figure 3B).
      2. Tout d'abord, déterminer la zone maximale autour du centrosome qui est possible de quantifier, en dessinant un cercle de 3 m-radius entourant le centrosome.
      3. Utilisez le profil radialde plugin ImageJ , qui mesure la fluorescence en cercles concentriques et affiche une parcelle de fluorescence/radius.
      4. Identifiez le rayon maximal dans lequel au moins 70 % de l'intensité de fluorescence est maintenue.
      5. Calculez le rapport de densité de fluorescence à l'aide de la formule suivante :
        figure-protocol-18396=figure-protocol-18462
        REMARQUE : Le rapport de densité de fluorescence indique la concentration d'un organite au centrosome comparé à sa distribution dans la cellule entière.
  2. Analyse de la diffusion et de la distribution cellulaires des organites dans les cellules B activées sur les couvertures Ag
    1. Estimer la distribution d'organites à l'IS (Figure 4B).
      REMARQUE : Cet algorithme permet de quantifier la distribution XY des organites et leur concentration au centre de l'IS. Nous définissons un rapport de densité de fluorescence entre la zone centrale et la zone synaptique totale. Les valeurs obtenues peuvent varier de négative à positive, indiquant une distribution périphérique ou centrale de l'organelle, respectivement.
      1. Déterminer la tranche dans laquelle la cellule est en contact avec le couvercle.
        REMARQUE : Pour délimiter les limites cellulaires, on peut étiqueter la membrane plasmatique ou l'actine qui s'enrichit à la périphérie de l'IS.
      2. Changer le type de la tranche en 8 bits, puis binariser (Processus Binaire (binaire) Faire binaire) et connecter les points d'outsider les plus proches Processus Binaire (binaire) esquisse. Délimiter les limites de la zone cellulaire (CA) en utilisant la sélection d'outils en polygone.
        REMARQUE : Cette étape est utile pour augmenter le contraste des limites cellulaires et faciliter l'identification. En outre, à ce stade, il est possible d'appliquer le plugin de particules Analyze de ImageJ pour déterminer le CA automatiquement. Cependant, d'autres cellules dans le même champ peuvent interférer avec les résultats.
      3. Prenez les paramètres CA (hauteur et largeur) et délimiter une zone arrondie centrale, qui est séparée des limites par un quart de la hauteur et les valeurs de largeur, considérez cette zone comme la zone du centre cellulaire (CCA).
      4. Calculez la répartition de la densité de fluorescence au centre de l'IS en utilisant la formule suivante :
        figure-protocol-20649
    2. Mesurer la distribution d'organites dans les avions Z (Figure 4C).
      REMARQUE : Cette analyse détermine la distribution générale de la fluorescence organelle à travers les plans Z des cellules B activées sur les couvertures Ag, montrant le pourcentage de fluorescence par fraction Z.
      1. Pour quantifier la distribution de fluorescence en Z, déterminez d'abord le plan de l'IS où la cellule est en contact avec le glissement ag, puis l'avion correspondant à la limite supérieure de la cellule.
      2. Tracez une ligne à travers le centre cellulaire.
      3. Retrancher l'image en Z (Image Piles ( Reslice), pour obtenir une image XZ.
      4. Mesurez la hauteur et divisez l'image XZ en 10 rectangles consécutifs de la même hauteur (fraction Z) du bas (interface IS) vers le haut (côté supérieur de la cellule) et quantifiez le signal de fluorescence dans chacun d'eux.
      5. Normaliser l'intensité de fluorescence de chaque fraction Z par la somme de la fluorescence totale des 10 fractions.
      6. Tracer le pourcentage d'intensité de fluorescence par fraction Z de la cellule.

5. Isolement de la fraction centrosome-enrichie des cellules B au repos et activées

REMARQUE : Gardez toutes les solutions à 4 oC pendant l'expérience afin d'éviter la dégradation des protéines. Ce protocole a été adapté des travaux précédents17,18.

  1. Activer 2 x 107 cellules B avec des perles enduites d'Ag dans 2 ml de clef moyen - 2 % de FBS inactivé par la chaleur (ratio 1:1). Considérez les cellules B non activées comme des cellules B au repos.
  2. Ajouter la cytochalasine D (2 m) et le nocodazole (0,2 M) et incuber pendant 1 h à 37 oC.
    REMARQUE : Ces médicaments sont utilisés pour détacher doucement le centrosome du noyau, en dépolymérisant le cytosquelette et les microtubules d'actine, respectivement, pour éviter la contamination nucléaire.
  3. Laver chaque échantillon de 5 ml de SCT 1x froid (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) puis avec 1 ml de 0,1x SCT complété par 8% de saccharose.
  4. Resuspendre les cellules avec 150 l de tampon de lyse centrosome (1 mM HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% bêta-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorure (PMSF) ou cocktail d'inhibiteur de la protéase) et pipette de haut en bas jusqu'à la viscoïité diminutions, ce qui indique que la lyse cellulaire est identifiée dans l'échantillon. Mettre l'échantillon dans un tube de 1,5 ml.
  5. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 4 oC, pour séparer les organites du noyau.
  6. Récupérez soigneusement le supernatant et placez-le sur un tube de 1,5 ml avec 300 l de tampon de gradient (GB) (10 mM PIPES pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% bêta-mercaptoethanol) contenant 60% de saccharose.
  7. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 min à 4 oC pour concentrer les centrosomes dans la fraction de saccharose de 60 %.
  8. Pendant ce temps, préparez un gradient discontinu dans des tubes d'ultracentrifuge de 2 ml en superposant 450 Livres de Go à 70 % de saccharose avec 270 L de Go, 50 % de saccharose, puis 270 l de Gb et 40 % de saccharose.
  9. Après la première centrifugation (fraction centrosome-concentrée), jetez la fraction supérieure (partie moins dense) jusqu'à atteindre l'interface et vortex l'échantillon restant dans le tube. Ensuite, recensez-vous au-dessus du gradient discontinu préalablement préparé avec l'échantillon enrichi centrosome.
    REMARQUE : Veillez à ne pas perturber le gradient, toutes les procédures de tuyauterie doivent être soigneusement exécutées.
  10. Centrifugeuse à 40 000 x g pour 1 h à 4 oC avec une accélération minimale et avec le frein de centrifugeuse réglé à l'arrêt, pour éviter de perturber le gradient.
  11. Recueillir 12 fractions de 100 l dans des tubes séparés à partir du haut.
  12. Identifiez les fractions enrichies de centrosome par immunoblot utilisant le 'tubulin comme marqueur centrosome.
    REMARQUE : Nous trouvons habituellement des extraits centrosome-enrichis entre les fractions 6 et 8.

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Résultats

Le présent article montre comment les cellules B peuvent être activées à l'aide d'antigène immobilisé sur des perles ou des couvertures pour induire la formation d'un IS. Nous fournissons des informations sur la façon d'identifier et de quantifier la polarisation des différents organites par immunofluorescence et comment caractériser les protéines qui subissent des changements dynamiques dans leur association au centrosome, qui polarise à l'IS, en utilisant un l'approche biochi...

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Discussion

Nous décrivons une méthode complète pour étudier comment les lymphocytes B réorganisent leur architecture intracellulaire pour favoriser la formation d'un IS. Cette étude comprend l'utilisation de techniques d'imagerie pour quantifier la distribution intracellulaire des organites, tels que le centrosome, l'appareil Golgi et les lysosomes pendant l'activation des cellules B, et comment ils se polarisent vers l'IS. En outre, nous décrivons une approche biochimique pour étudier des changements dans la composition de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

M.-I.Y. bénéficie d'une subvention de recherche de FONDECYT #1180900. J.I., D.F. et J.L. ont été soutenus par des bourses de la Comision Nacional de Ciencia y Tecnologa. Nous remercions David Osorio de Pontificia Universidad Cataliica de Chile pour l'enregistrement et le montage vidéo.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanolFisher ScientificA412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circularMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG LifeTech A212061:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6Abcamab959541:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61Abcamab155751:200 dilution recomended but should be optimized
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Culture plate T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutamineThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibodyThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificSH30071.03Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS microscopeLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibodyAbcamab61601:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibodyCell signaling32431:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55 Abcamab1704141:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody Abcamab16504 1:1000 for Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
SucroseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Tube 50 mlCorning353043

Références

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
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  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
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