نموذج مورين من أورام الكبد النقيلي في وضع إصابة نقص تروية التسريب

Summary

نحن نصف بالتفصيل نموذج ورم سرطان القولون والمستقيم (CRLM) تأثير إعادة إقفاريالكبد (I/R) في نمو الورم والانبثاث. هذا النموذج يمكن أن تساعد على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء الجراحة الناجمة عن تعزيز نمو الكبد النقيلي.

Abstract

لا يزال نقص تروية الكبد وإصابة التسريب (I/R)، وهو تحد سريري شائع، عملية باثوفسيولوجية لا مفر منها وقد ثبت أنها تسبب تلفًا متعددًا في الأنسجة والأعضاء. وعلى الرغم من أوجه التقدم الأخيرة والنهج العلاجية، ظلت الاعتلالات العامة غير مرضية خاصة في المرضى الذين يعانون من تشوهات في البُرَيِّة الكامنة. في سياق نمو السرطان العدواني وورم خبيث، يشتبه في أن الإدخال/الإعادة إلى الدخول الجراحي هو المروج الذي ينظم تكرار الورم. تهدف هذه المقالة إلى وصف نموذج المورين ذات الصلة سريريا من الكبد I / R وورم الكبد القولون والمستقيم. في القيام بذلك, ونحن نهدف إلى مساعدة المحققين الآخرين في إنشاء واتقان هذا النموذج لممارسة البحوث الروتينية لفهم أفضل لآثار الكبد I/ R على تعزيز الانبثاث الكبد.

Introduction

الكبد هو واحد من المواقع الأكثر شيوعا لتطوير المرض النقيلي¹. الوفيات هي دائما تقريبا تعزى إلى المضاعفات المرتبطة بنمو الورم في الكبد. في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة النقيلية في الكبد، لا تزال الجراحة تدخلًا حاسمًا لمكافحة المرض والنهج العلاجي المحتمل. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من المرضى موجودة في نهاية المطاف مع المرض المتكرر، في الغالب في الكبد^2،3. خلال الجراحة الكبدية، النزيف أثناء الجراحة شائع، وغالباً ما يتطلب نقل الدم والنهج التقنية المختلفة للسيطرة على النزيف، بما في ذلك أساليب لقط الأوعية الدموية. ومع ذلك، تسبب هذه التدابير نقص التروية الكبدية / التسريب (I/R) إلى أنسجة الكبد. وقد تم توثيق الآثار السلبية للآي /ر على وظيفة الخلايا الكبدية بشكل جيد. الكبد I / R إهانة يشعل الشلالات الالتهابية أثناء استعادة تدفق الدم عن طريق مسارات التهابية⁴. ليس فقط إصابة الكبد I / R تسهم في فشل الكبد، ولكن الأدلة الحالية تبين أيضا أن إصابة الآي / ر يحفز التصاق الخلايا السرطانية، ويعزز حدوث تشكيل الانبثاث ونمو مرض micrometastatic القائمة⁵. وقد سبق لنا أن أبلغنا أن الإجهاد الجراحي يحفز تنشيط الخلايا المناعية التي لا تساعد فقط في نمو الورم الأولي، ولكن أيضا يسهل الانبثاث عن طريق التقاط الخلايا السرطانية داخل الدورة الدموية⁶.

هنا نقوم بوصف بالتفصيل تقنية لإنشاء نموذج ورم الماوس ورم ورم الانبثاث الكبدي. في هذا النموذج، ونحن نقدم أيضا طريقة للحث على إصابة نقص التروية الكبدية التي تعمل كبديل للإجهاد الجراحي الحالي سريريا خلال استئصال الكبد. الطرق مجتمعة من حقن السرطان والكبد I / R يمكن أن تفسر بنجاح تطور CRLM في المرضى الذين خضعوا لاستئصال الورم الأولي.

Protocol

تتم الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها وتلتزم بالمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). تم تعقيم الأدوات المستخدمة في أي إجراء جراحي تماما.

1- الإعداد الأولي

1. قبل حقن الخلايا السرطانية في طحال الماوس، الأوتوكلاف وتعقيم جميع الأدوات لاستخدامها أثناء الإجراء.
2. تعقيم و / أو الأوتوكلاف وسادة التدفئة، والقفازات الجراحية، والشاش، أزواج من مقص، المشابك الصغيرة، المتوسع السفينة، ملقط الجراحية، وحامل إبرة.
3. إعداد مسكن ما بعد الجراحة (0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين) ليتم إدارتها بعد استئصال الطحال وكل 12 ساعة لمدة 2 أيام.

2. خلية ثقافة

1. تأكد من خلو الخلايا السرطانية من تلوث الميكوزال باستخدام مجموعة الـ ELISA من الميكوزلا.
2. إعداد حل 500 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تربية المتوسطة في 4 درجة مئوية لثقافة الخلايا السرطانية القولون والمستقيم المورين (MC38). وينبغي أن تستكمل وسائل الإعلام زراعة مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 100 U / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من العقديات، 15 مل من HEPES و 200 مل من L-الجلوتامين.
3. الخلايا السرطانية الثقافية في قارورة خالية من DNAse وRNAse (75 سم²). احتضان ثقافة الخلية في حاضنة رطبة للخلايا/الأنسجة تحتوي على 5٪ CO 2. الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
4. بمجرد أن تصل الخلايا المتكاثرة إلى الملاءمة 90-100%، يستنشق الوسائط القديمة، ويغسل الخلايا بمحلول ملحي واحد بالفوسفات (PBS) ثم يعالجها بـ 1x تريبسين (0.25%). لفصل الخلايا من القارورة.
5. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 × ز.
6. يستنشق وسائل الإعلام وغسل مع 1X PBS مرتين عن طريق الطرد المركزي المتكررة.
7. المضي قدما لتأكيد صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ الخلايا مع وصمة عار الأزرق تريبان (0.4٪).
8. إعادة تعليق الخلايا إلى تركيز 1 × 10⁶ خلايا / 100 درجة مئوية في 1X PBS. خلايا الأنابيب بدقة لتجنب أي كتل. الحفاظ على الخلايا السرطانية على الجليد قبل الحقن.

3. حقن الخلايا السرطانية

1. تخدير الفئران الذكور 8-12 الأسبوع (C57BL6) عن طريق إدارة الكيتامين (150 ملغ / كغ) وxylazine (12 ملغ / كغ) داخل اكل 25 غرام (0.5 مم × 16 مم) إبرة.
2. انزعي جلد البطن للفئران باستخدام كليبرز لتجنب أي عدوى بعد الجراحة.
3. ضع الفئران على نظام التراجع المثبت المغناطيسي. تأكد من أن الفئران هي تماما تحت تأثير التخدير عن طريق الضغط على اصبع القدم أو الذيل.
4. إضافة قطرات ملحية في العينين لتجنب الجفاف أثناء الإجراء.
5. فرك بوفيدون اليود الحل (7.5٪) إلى جدار البطن الحليق لتطهير الجلد قبل إجراء شق جراحي.
6. في البداية رفع الجلد مع ملقط مسننة وجعل شق خط الوسط مع مساعدة من مقص الجراحية. ثم، رفع عضلة البطن والصفاق لخلق شق خط الوسط من طول 3 سم تقريبا (منتصف البطن إلى عملية xiphoid لفضح محتويات البطن. توخي الحذر من تمديد الشق إلى ما بعد عملية xiphoid لتجنب نزيف واسع النطاق.
7. ضع الهيموستات على جانبي الشق وتحت عملية xiphoid. تمديد البطن عن طريق سحب الذيل إلى أسفل والتسجيل عليه. استخدم قضيب طرف القطن المعقم 6 بوصة لفصل الطحال وتعريضه من أنسجة الدهون البنكرياسية.
8. قبل الحقن في الطحال، دوامة الخلايا السرطانية لتجنب أي كتل الخلايا.
9. استخدام 0.5 مل 28 G (0.36 مم × 13 مم) حقنة الأنسولين للحقن. تجنب فقاعات الهواء.
10. حقن ببطء وبعناية 100 ميكرولتر من الخلايا في طرف الطحال. ضع طرف القطن وأضف ضغطًا لطيفًا لتجنب التدفق الخلفي إلى منطقة البطن. يمكن ملاحظة حقن ناجحة عن طريق تحديد التغير في لون الكبد أثناء الحقن.
11. ترطيب شاش معقم مع 1X PBS ووضعها على المنطقة تشريح.
12. نقل الفئران على منصة التدفئة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا السرطانية بالدوران داخل النظام.
13. للمتابعة مع نقص التروية الجراحية وإصابة التسريب، اتبع الخطوات 5.3-5.10.
    ملاحظة: هذا الإجراء هو لدراسة تأثير إنشاء I /R المستحثة من بؤر النقيلي.

4. استئصال الطحال

1. لإجراء استئصال الطحال، استخدم جهاز الكي باليد. رفع الطحال بعناية مع ملقط على نحو سلس والكي الأوعية الدموية الطحال لتجنب النزيف المفرط. إزالة الطحال عن طريق نقل الأوعية في القسم الكي.
2. بعد الإجراء مباشرة، أغلق الشق في نمط طبقة مزدوجة عن طريق خياطة طبقة العضلات أولا ثم الجلد. استخدم 4-0 غرز البولي بروبلين لكل من جدار البطن والجلد.
3. قبل تكرار الإجراء على آخر الحيوان، تطهير جميع الصكوك إما رش لهم مع isopropanol 70٪ أو إدراجها في حمام حبة.
4. وضع الفئران مرة أخرى في أقفاص الأصلي والبحث عن علامات الشدة والألم بعد الجراحة.
5. حقن مسكن ما بعد الجراحة (بوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ) كل 12 ساعة لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.

5. إصابة نقص التروية

1. في 5 أيام بعد استئصال البطن الأول، تخدير الفئران عن طريق إعطاء الكيتامين (150 ملغ / كغ) وزيلازين (12 ملغ / كغ) داخل اكلوى باستخدام 1 مل 25 غرام (0.5 مم × 16 مم) إبرة. اتبع الخطوات 3.3-3.4.
2. فرك بوفيدون اليود الحل (7.5٪) على البطن حلق الماوس لتطهير الجلد وإجراء استئصال البطن خط الوسط كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.6.
3. باستخدام اثنين من نصائح القطن مبللة، نقل بلطف الأمعاء من تجويف لفضح الهياكل المرتبطة بها، بما في ذلك الوريد المدخل. تشريح هلوم الكبد خالية من الأنسجة المحيطة بها.
4. رفع الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى ضد الحجاب الحاجز. فصل الفص رباعي من الفص الجانبي الأيسر عن طريق تشريح الهالة الكبد مع مقص الربيع باستخدام مجهر التشغيل للسماح رؤية واضحة نحو هيكل الثلاثي المدخل.
5. ضع مسحة قطنية رطبة صغيرة بين الفص المتوسط والفص الجانبي الأيمن لخلق مساحة كافية للمشبك. باستخدام ملقط ملقط توسع السفينة، تمرير بعناية 10 سم الموضوع (4.0 خياطة البولي بروبلين) لرفع ثالوث المدخل. Occlude جميع الهياكل في ثالوث المدخل (الشريان الكبدي، الوريد المدخل، والقناة الصفراوية) إلى فصوص الكبد اليسرى والمتوسطعن طريق وضع مشبك الأوعية الدموية الدقيقة باستخدام قضيب المشبك micro-serrefine مع القفل.
6. إذا كانت الفصوص لا تظهر ابيضاض كبير، وإعادة تعديل المشبك عن طريق إزالة وإعادة تطبيق.
   ملاحظة: إذا لم يحدث الغسل الفوري للكبد حتى بعد إعادة ضبط المشبك، فكر بعناية في ما إذا كان سيتم المضي قدماً في إدخال/إعادة النظر أم لا.
7. إزالة مسحة القطن الصغيرة وضعت بين الفصوص الجانبية المتوسطة واليمنى. استبدل الأمعاء بلطف في تجويف البطن. غطي جدار البطن بالشاش الرطب (المنقوع بـ 1x PBS) وغطيه بغلاف بلاستيكي لتقليل فقدان التبخر.
8. وضع الماوس على لوحة التدفئة وتطبيق المشبك لمدة 60 دقيقة.
9. طوال الفترة الإقفارية، ابحث عن أدلة على إصابة نقص التروية من خلال تصور الغسل الشاحب للفصوص الوسيطة اليسرى والجانبية اليسرى.
10. بدء التسريب عن طريق إزالة المشابك بعد فترة 60 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة دليل على التسريب عن طريق تغيير فوري في لون الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى.
11. مباشرة بعد إعادة التسريب، أغلق الشق مع نمط خياطة طبقة مزدوجة عن طريق خياطة أولا طبقة العضلات ومن ثم الجلد. استخدم خياطة البولي بروبلين 4-0 بمساعدة حامل إبرة لإغلاق جدار البطن والجلد.
12. قبل تكرار الإجراء على آخر الحيوان، تطهير جميع الصكوك إما عن طريق رش لهم مع isopropanol 70٪ أو إدراجها في حمام حبة ساخنة.
13. وضع الفئران مرة أخرى في أقفاص الأصلي والبحث عن علامات الشدة والألم بعد الجراحة.
14. حقن مسكن بعد الجراحة (0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين) كل 12 ساعة لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.
15. بالنسبة للفئران الشام ية للكبد، قم بإجراء استئصال البطن وتشريح الهيلوم وغرز البطن.
    ملاحظة: يمكن التحقيق في دور الإجهاد الجراحي الذي يؤثر على إنشاء الانبثاث الكبدي من خلال اثنين من التصاميم التجريبية المختلفة. يستخدم البروتوكول أعلاه (نموذج -1) لإنشاء مرض الكبد الميكروميتاستاتيكي ودراسة تأثير الكبد I / R على نموها (الشكل 1A). بدلا من ذلك، يمكن إجراء الكبد I / R وحقن الورم في وقت واحد (نموذج-2)لدراسة تأثير إصابة الآي / ر في إنشاء بؤر النقيلي الجديد (الشكل1B). للقيام بذلك، حقن الخلايا السرطانية في الطحال كما هو موضح أعلاه والسماح لهم بالدوران لمدة 15 دقيقة.

6- تقييم الفئران العاملة

1. خلال العملية الجراحية ضمان أن الفئران تحت تأثير المرحلة الثالثة التخدير عن طريق إجراء اختبار رد الفعل بالببرال والقرنية. يجب إعطاء جرعة مخدرة إضافية على علامات ردود الفعل.
2. توفير مسكن ما بعد الجراحة (بوبرينورفين 0.1mg/kg) مباشرة بعد الجراحة وكل 12h لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.
3. السماح للفئران 30-60 دقيقة من وقت الانتعاش من التخدير. مراقبة الفئران باستمرار ولا تتركلهم دون مراقبة حتى الانتعاش الكامل.
4. ابحث عن علامات الاستغاثة مثل الظهر الحدس، عيون مغلقة، وبطء الحركة، والفشل في العريس. علاج وفقا لذلك حتى الفئران العودة إلى نشاطها الطبيعي.
5. الرعاية المرنة بما في ذلك السوائل، والحرارة، وكيل عكس Yohimbine لxylazine، وينبغي توفير الفراش لينة منشفة ورقية (لتجنب الطموح) بعد الجراحة لتحسين فترة الانتعاش.

7. تقييم إصابة نقص تروية الكبد

1. مباشرة بعد تطبيق المشبك، تأكد من أن الغسل الشاحب للفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى يحدث بالمقارنة مع الفصوص الكاوية ورباعية.
2. تقييم إصابة نقص تروية الكبد عن طريق قياس مستويات مصل ألانين ترانساميناز (sALT)، ومصل الترانساميناز (sAST) ومصل اللاكتات dehydrogenase (sLDH). يمكن سحب الدم من والوريد الوجه لاستخراج المصل 3-6 ح بعد بدء التسريب. إجراء الأنسجة الكبد لتحليل منطقة الورم في المئة داخل الفص الإقفاري.

النتائج

وقد خضعت جميع الفئران البرية (C57BL6) (n = 20) لنموذج الانبثاث الكبد باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه. جميع الفئران المحقونة مع أو بدون إصابة نقص التروية التسريب نجا حتى تاريخ التضحية. الرسم التخطيطي الشكل 1A من الكبد حقن السرطان يوضح لقط من ثالوث المدخل (الشريان الكبدي، الوريد ?...

Discussion

ويستند النموذج الحيواني الموصوف في هذه المخطوطة إلى نهجين رئيسيين. الأول هو الاعتراف بقدرة الخلايا السرطانية على توطين وانتشار في فصوص الكبد. والثاني هو دراسة تأثير إصابة نقص التروية الكبدية التي تؤثر على نمو الورم والانبثاث. يسمح هذا النموذج بالدراسة ذات الصلة من الانبثاث الكبد في غياب ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum	Lonza	900-108
L-Glutamin	Gibco	25030-081
Penicilin	Fisher scientific	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientific	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific	SH3023701
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Cell culture Flask 75cm	5 Cells Star	658170
15ml PP Conical Tubes	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gauze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
Microvascular clamp	Finescience tools	18055-03
Micro-Serrefine clamp applicator with lock	Fine science toosl	FST-18056-14
Spring scissor	Fine science toosl	FST-15021-15
Vessel Dilator	Fine science toosl	FST-00276-13
Magnetic fixator Retraction system	Fine science toosl	FST-18200020
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11019-12
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 polypropylene suture	Ethicon	K881H
Needle holder	Harvard Apparatus	72-8826
Heating Pad	Fisher scientific	1443915
Clipper	Oster	559A
Povidone-Iodine solution	Medline	MDS093945
Syringe 1ml 25G	BD safety Glide	305903
Insulin syringe 0.5 ml	BD insulin Syringes	32946
Cotton -Tipped Applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Surgical Microscope	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Ketamine	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
ALT strip	Heska	15809554
AST strip	Heska	15809542
LDH strip	Heska	15809607