Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

Riepilogo

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Abstract

L'ischemia e la lesione da reperfusione (I/R) del fegato, una sfida clinica comune, rimane un inevitabile processo patofisiologico che ha dimostrato di indurre danni multipli ai tessuti e agli organi. Nonostante i recenti progressi e gli approcci terapeutici, la morbilità generale è rimasta insoddisfacente soprattutto nei pazienti con anomalie parenchyliche sottostanti. Nel contesto della crescita aggressiva del cancro e della metastasi, si sospetta che l'I/R chirurgico sia il promotore che regola la ricorrenza del tumore. Questo articolo ha lo scopo di descrivere un modello murino clinicamente rilevante di E-R e metastasi epatica del fegato. In tal modo, miriamo ad aiutare altri ricercatori a stabilire e perfezionare questo modello per la loro pratica di ricerca di routine per comprendere meglio gli effetti del fegato I/R sulla promozione delle metastasi epatiche.

Introduzione

Il fegato è uno dei siti più comuni per lo sviluppo della malattia metastatica¹. La mortalità è quasi invariabilmente attribuibile a complicazioni associate alla crescita del tumore nel fegato. Nei pazienti con tumori solidi metastatici nel fegato, l'intervento chirurgico rimane un intervento cruciale per il controllo della malattia e un possibile approccio curativo. Tuttavia, la stragrande maggioranza dei pazienti in ultima analisi presenta una malattia ricorrente, prevalentemente nel fegato^2,3. Durante la chirurgia epatica, il sanguinamento intraoperatorio è comune, spesso richiede la trasfusione di sangue e diversi approcci tecnici per il controllo del sanguinamento, compresi i metodi di bloccaggio vascolare. Tuttavia, tali misure causano ischemia/reperfusione epatica (I/R) al tessuto epatico. Gli effetti negativi dell'I/R sulla funzione epatocellulare sono stati ben documentati. L'insulto I/R del fegato accende le cascate infiammatorie durante il ripristino del flusso sanguigno attraverso vie infiammatorie⁴. Non solo la lesione epatica da I/R contribuisce all'insufficienza epatica, ma le prove attuali dimostrano anche che la lesione da I/R stimola l'adesione delle cellule tumorali e promuove l'incidenza della formazione di metastasi e la crescita della malattia micrometastatica esistente⁵. Abbiamo già riferito che lo stress chirurgico induce l'attivazione di cellule immunitarie che non solo aiuta nella crescita del tumore primario, ma facilita anche le metastasi catturando le cellule tumorali all'interno della circolazione⁶.

Qui descriviamo in dettaglio una tecnica per stabilire un modello di tumore del topo metastasi epatica. In questo modello, presentiamo anche un metodo per indurre lesioni da reperfusione di ischemia epatica che agisce come un surrogato allo stress chirurgico presente clinicamente durante le epatitectomie. I metodi combinati di iniezione del cancro e I/R epatico possono interpretare con successo lo sviluppo del CRLM in pazienti che hanno subito la resezione tumorale primaria.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e aderiti alle Linee guida dei National Institutes of Health (NIH). Gli strumenti utilizzati per qualsiasi procedura chirurgica sono stati accuratamente sterilizzati.

1. Preparazione iniziale

1. Prima di iniettare cellule tumorali nella milza del topo, autoclave e sterilizzare tutti gli strumenti da utilizzare durante la procedura.
2. Sterilizzare e/o autoclave un pad di riscaldamento, guanti chirurgici, garza, coppie di forbici, piccoli morsetti, dilatatore del vaso, pinze chirurgiche e un supporto per aghi.
3. Preparare l'analgesico post-operatorio (0,1 mg/kg di buprenorphina) da somministrare dopo la splenectomia e ogni 12 h per 2 giorni.

2. Cultura cellulare

1. Assicurarsi che le cellule tumorali siano esenti da contaminazione da micoplasma utilizzando un kit micoplasma ELISA.
2. Preparare una soluzione da 500 mL del mezzo di coltura DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco a 4 gradi centigradi per la coltura delle cellule tumorali del colore colorettale murine (MC38). I mezzi di coltura devono essere integrati con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL di streptomicina, 15 mM di HEPES e 200 mM di l-glutamina.
3. Cellule tumorali di coltura in un flacone privo di dNAe e RNAse (75 cm²). Incubare la coltura cellulare in un'incubatrice civetta cellulare/tessuto contenente il 5% di CO₂. Mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi.
4. Una volta che le cellule proliferatiste raggiungono il 90-100% di confluenza, aspirate i vecchi supporti, lavare le cellule con 1x salina tamponata da fosfati (PBS) e poi trattarle con 1x trypsin (0,25%) per staccare le cellule dal pallone.
5. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 5 min a 700 x g.
6. Aspirare il supporto e lavare con 1x PBS due volte con una centricazione ripetuta.
7. Procedere per confermare la vitalità cellulare colorando le cellule con la macchia blu trypan (0,4%).
8. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/100 -L in 1x PBS. Pipet cellule accuratamente per evitare eventuali grumi. Mantenere le cellule tumorali sul ghiaccio prima dell'iniezione.

3. Iniezione di cellule tumorali

1. Anestesizzai i topi maschi di età 8-12 settimane (C57BL6) somministrando ketamina (150 mg/kg) e xylazina (12 mg/kg) intraperitonealmente utilizzando un ago da 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm).
2. Rasare la pelle addominale dei topi utilizzando clipperper per evitare eventuali infezioni postoperatorie.
3. Posizionare i topi sul sistema di retrazione del fissatore magnetico. Confermare che i topi sono completamente sotto l'effetto dell'anestesia pizzicando un dito o la coda.
4. Aggiungere gocce saline negli occhi per evitare la secchezza durante la procedura.
5. Soluzione Scrub povidone-iodio (7,5%) alla parete addominale rasata per disinfettare la pelle prima di fare un'incisione chirurgica.
6. Inizialmente sollevare la pelle con le pinze dentate e fare un'incisione mediana con l'aiuto di forbici chirurgiche. Quindi, sollevare il muscolo addominale e peritoneo per creare un'incisione mediana di circa 3 cm di lunghezza (processo da midabdominal a xifipo per esporre il contenuto addominale. Prestare attenzione a non estendere l'incisione oltre il processo xifoide per evitare sanguinamento esteso.
7. Posizionare l'emocula su entrambi i lati dell'incisione e sotto il processo xifoideo. Estendere l'addome tirando la coda verso il basso e toccandola. Utilizzare l'applicatore di punta di cotone sterile da 6 pollici per separare ed esporre la milza dal tessuto adiposo pancreatico.
8. Prima dell'iniezione nella milza, vortice le cellule tumorali per evitare eventuali grumi cellulari.
9. Utilizzare una siringa di insulina da 0,5 mL 28 G (0,36 mm x 13 mm) per l'iniezione. Evitare le bolle d'aria.
10. Iniettare lentamente e con cura 100 l di cellule nella punta della milza. Posizionare una punta di cotone e aggiungere una leggera pressione per evitare il riflusso nella regione addominale. Un'iniezione di successo può essere osservata identificando il cambiamento nel colore del fegato durante l'iniezione.
11. Inumidire una garza sterile con 1x PBS e posizionarla sopra l'area sezionata.
12. Trasferire i topi su una piastra di riscaldamento per 15 min per consentire alle cellule tumorali di circolare all'interno del sistema.
13. Per procedere con l'ischemia chirurgica e la lesione da reperfusione, seguire i passaggi 5.3-5.10.
    NOTA: Questa procedura consiste nello studiare l'effetto dell'indatazione I/R di foci metastatici.

4. Splenectomia

1. Per eseguire una splenectomia, utilizzare un dispositivo di cautery portatile. Sollevare con attenzione la milza con pinze lisce e cauterizzare i vasi sanguigni splenici per evitare eccessivi emorragici. Rimuovere la milza trascinando i vasi nella sezione cauterizzata.
2. Subito dopo la procedura, chiudere l'incisione in un modello a doppio strato suturando prima lo strato muscolare e poi la pelle. Utilizzare suture in polipropilene 4-0 sia per la parete addominale che per la pelle.
3. Prima di ripetere la procedura su un altro animale, disinfettare tutti gli strumenti spruzzandoli con il 70% di isopropanolo o inserendoli in un bagno di perline.
4. Riporre i topi in gabbie originali e cercare segni di angoscia e dolore post-chirurgico.
5. Iniettare analgesico post-operatorio (Buprenorphine 0,1 mg/kg) ogni 12 h per 2 giorni per evitare dolore post-chirurgico.

5. Lesione da reperfusione di ischemia

1. A 5 giorni dopo la prima laparotomia, i topi anestesizzanti somministrando la chetamina (150 mg/kg) e la xylazina (12 mg/kg) intraperitonealmente utilizzando un ago da 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm). Seguire i passaggi da 3.3–3.4.
2. Soluzione Scrub povidone-iodio (7,5%) sull'addome rasato del topo per disinfettare la pelle ed eseguire una laparotomia mediana come descritto sopra al punto 3.6.
3. Utilizzando due punte di cotone inumidito, spostare delicatamente l'intestino dalla cavità per esporre le strutture associate, compresa la vena del portale. Sezionare l'hilum del fegato libero dal tessuto circostante.
4. Sollevare la mediana e i lobi laterali a sinistra contro il diaframma. Separare il lobo quadrate dal lobo laterale sinistro sezionando l'hilum del fegato con le forbici a molla utilizzando un microscopio operativo per consentire una chiara visibilità verso la struttura della triade del portale.
5. Posizionare un piccolo tampone di cotone umido tra il lobo mediano e il lobo laterale destro per creare spazio sufficiente per il bloccaggio. Utilizzando le pinze del dilatatore del recipiente, passare con attenzione il filo di 10 cm (4.0 di sutura di polipropilene) per sollevare la triade del portale. Occludono tutte le strutture della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) a sinistra e nei lobi epatici mediani posizionando un morsetto microvascolare utilizzando un applicatore micro-serrefine con serratura.
6. Se i lobi non mostrano sbiancamento significativo, riregolare il morsetto rimuovendo e riapplicando.
   NOTA: Se l'immediato sbiancamento del fegato non si verifica anche dopo aver riregolato il morsetto, valutare attentamente se procedere o meno con l'I/R.
7. Rimuovere il piccolo tampone di cotone posto tra i lobi laterali medici e destro. Sostituire delicatamente l'intestino nella cavità addominale. Coprire la parete addominale con una garza umida (imbevuta di 1x PBS) e coprire con un involucro di plastica per ridurre al minimo la perdita evaporativa.
8. Posizionare il mouse sul pad di riscaldamento e applicare il morsetto per un periodo di 60 min.
9. Durante l'intervallo ischemico, cercare prove di lesioni ischemia visualizzando la sbiancamento pallido dei lobi mediali e laterali mediali e mediali di sinistra destra.
10. Avviare la reperfusione rimuovendo i morsetti dopo il periodo di 60 min.
    NOTA: La prova della riperfusione può essere osservata da un cambio di colore immediato dei lobi laterali mediani e sinistri.
11. Subito dopo la reperfusione, chiudere l'incisione con un modello di sutura a doppio strato suturando prima lo strato muscolare e poi la pelle. Utilizzare la sutura in polipropilene 4-0 con l'aiuto di un supporto ad ago per chiudere la parete addominale e la pelle.
12. Prima di ripetere la procedura su un altro animale, disinfettare tutti gli strumenti spruzzandoli con il 70% di isopropanolo o inserendoli in un bagno di perline riscaldato.
13. Riporre i topi in gabbie originali e cercare segni di angoscia e dolore post-chirurgico.
14. Iniettare analgesico post-operatorio (0,1 mg/kg di buprenorphina) ogni 12 h per 2 giorni per evitare dolore post-chirurgico.
15. Per i topi della fedina problemiali epatici, eseguire laparotomia, dissezione dell'hilum e suture addominali.
    NOT: Il ruolo dello stress chirurgico che influenza l'istituzione di metastasi epatiche può essere studiato attraverso due diversi progetti sperimentali. Il protocollo di cui sopra (Model-1) viene utilizzato per stabilire la malattia micrometastatica del fegato e studiare l'effetto dell'I/R epatica sulla loro crescita (Figura 1A). In alternativa, l'i/r e l'iniezione tumorale possono essere eseguite contemporaneamente (Modello-2) per studiare l'effetto della lesione i/r nella creazione di nuovi foci metastatici (Figura 1B). Per fare questo, iniettare le cellule tumorali nella milza come descritto sopra e consentire loro di circolare per 15 min. Eseguire epatica I/R o finzione chirurgia dopo il periodo circolante per 60 min. Eseguire la splenectomia laterale 60 min più tardi, quindi chiudere l'incisione laparotomia.

6. Valutazione dei topi azionati

1. Durante la procedura chirurgica assicurarsi che i topi sono sotto l'influenza di anestesia stadio III eseguendo test di riflesso palpebrale e corneale. Ulteriori dosi anestetiche devono essere somministrate sui segni dei riflessi.
2. Fornire analgesico post-operatorio (Buprenorphine 0.1mg/kg) subito dopo l'intervento chirurgico e ogni 12h per 2 giorni per evitare dolore post chirurgico.
3. Lasciare i topi 30-60 min di tempo di recupero dall'anestesia. Monitorare costantemente i topi e non lasciarli incustoditi fino al completo recupero.
4. Cerca segni di disagio come schiena, occhi chiusi, movimento lento e mancato sposo. Trattare di conseguenza fino a quando i topi tornano alla loro normale attività.
5. La cura supplimentale tra cui fluidi, calore, agente di inversione Yohimbina per xilosina, biancheria da letto asciugamano di carta morbida (per evitare l'aspirazione) dovrebbe essere fornita dopo l'intervento chirurgico per migliorare il periodo di recupero.

7. Valutazione della lesione da reperfusione di ischemia epatica

1. Immediatamente dopo aver applicato il morsetto, assicurarsi che la sbiancatura pallida dei lobi laterali mediani e sinistri si verifichi rispetto ai lobi caudati e quadrante.
2. Valutare la lesione dell'ischemia epatica misurando i livelli di transainasi da siero alaninese (sALT), il siero aspartatra transaminasi (sAST) e la diciasi del siero lattato (sLDH). Il sangue può essere prelevato dalla vena facciale per estrarre il siero 3–6 h dopo l'avvio della reperfusione. Eseguire istologia epatica per analizzare l'area tumorale percentuale all'interno del lobo ischemico.

Risultati

Tutti i topi wildtype (C57BL6) (n - 20) sono stati sottoposti al modello delle metastasi epatiche utilizzando il protocollo descritto sopra. Tutti i topi iniettati con o senza lesioni da reperfusione di ischemia sono sopravvissuti fino alla data del sacrificio. Il diagramma schematico Figura 1A di un fegato iniettato dal cancro illustra il bloccaggio della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) che induce un'ischemia epatica parziale (70%) insulto verso la med...

Discussione

Il modello animale descritto in questo manoscritto si basa su due approcci principali. Il primo è quello di riconoscere la capacità delle cellule tumorali di localizzare e proliferare nei lobi del fegato. Il secondo è quello di studiare l'effetto della lesione di reperfusione ischemia epatica che influenza la crescita del tumore e le metastasi. Questo modello consente lo studio pertinente delle metastasi epatiche in assenza di metastasi secondarie in un topo immunocompetente. Il modello è utile per affrontare le ques...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum	Lonza	900-108
L-Glutamin	Gibco	25030-081
Penicilin	Fisher scientific	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientific	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific	SH3023701
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Cell culture Flask 75cm	5 Cells Star	658170
15ml PP Conical Tubes	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gauze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
Microvascular clamp	Finescience tools	18055-03
Micro-Serrefine clamp applicator with lock	Fine science toosl	FST-18056-14
Spring scissor	Fine science toosl	FST-15021-15
Vessel Dilator	Fine science toosl	FST-00276-13
Magnetic fixator Retraction system	Fine science toosl	FST-18200020
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11019-12
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 polypropylene suture	Ethicon	K881H
Needle holder	Harvard Apparatus	72-8826
Heating Pad	Fisher scientific	1443915
Clipper	Oster	559A
Povidone-Iodine solution	Medline	MDS093945
Syringe 1ml 25G	BD safety Glide	305903
Insulin syringe 0.5 ml	BD insulin Syringes	32946
Cotton -Tipped Applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Surgical Microscope	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Ketamine	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
ALT strip	Heska	15809554
AST strip	Heska	15809542
LDH strip	Heska	15809607