מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

Summary

אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.

Abstract

איסכמיה של הכבד ו reperfusion (I/R) פציעה, אתגר קליני נפוץ, נשאר תהליך פתופסולוגי בלתי נמנע אשר הוכח לגרום לנזק רקמות מרובות איברים. למרות ההתקדמות האחרונה ואת הגישות הטיפוליות, התחלואה הכללית נותרה משביעת רצון במיוחד בחולים עם מומים מסוימים המשמשים כבסיס. בהקשר של גידול סרטן אגרסיבי גרורות, כירורגי I/R הוא חשוד להיות היזם ויסות הישנות הגידול. מאמר זה מטרתו לתאר מודל מורטין רלוונטי קלינית של כבד I/R ו גרורות בכבד המעי הגס. בלעשות זאת, אנו מכוונים לסייע לחוקרים אחרים בהקמה ושיפור מודל זה עבור מחקר שגרתיות שלהם בתחום המחקר כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של הכבד I/R על קידום גרורות בכבד.

Introduction

הכבד הוא אחד האתרים הנפוצים ביותר לפיתוח מחלה גרורתית¹. התמותה כמעט תמיד המיוחס סיבוכים הקשורים לגידול בכבד. בחולים עם גידולים מוצק גרורתי בכבד, הניתוח נשאר התערבות קריטית לבקרת מחלות וגישה מרפא אפשרי. עם זאת, הרוב המכריע של חולים בסופו של דבר להציג עם מחלה חוזרות, בעיקר בכבד^2,3. במהלך ניתוח הכבד, דימום פנימי הוא נפוץ, לעתים קרובות המחייב עירוי דם וגישות טכניות שונות לשליטה על דימום, כולל שיטות לולאה כלי דם. עם זאת, צעדים כאלה לגרום איסכמיה הכבד/reperfusion (I/R) לרקמת הכבד. תופעות לוואי של I/R על הפונקציה hepatocellular תועדו היטב. הכבד I/R העלבון מדליקה מפלים דלקתיים במהלך השיקום של זרימת הדם באמצעות מסלולים דלקתיים⁴. לא רק הכבד הפציעה I/R לתרום לקריסת הכבד, אבל הראיות הנוכחיות מראה גם כי פציעה I/R מעוררת הדבקה תא הגידול, ומקדמת את השכיחות של היווצרות גרורות ואת הצמיחה של מחלת המיקרוסטטי הקיים⁵. בעבר דיווחו כי לחץ כירורגי גורם הפעלה של תאים חיסוניים אשר לא רק מסייע בצמיחה של הגידול העיקרי, אלא גם מקלה גרורות על ידי לכידת תאים סרטניים בתוך המחזור⁶.

כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה להקמת מודל הגידול גרורות בכבד העכבר. במודל זה, אנו גם להציג שיטה לגרום איסכמיה הכבד reperfusion פציעה אשר מעשים כתחליף ללחץ כירורגי הנוכחי קלינית במהלך הניתוח. השיטות המשולבות של הזרקת סרטן הכבד I/R יכול לפרש בהצלחה את ההתפתחות של CRLM בחולים שעברו כריתת הגידול העיקרי.

Protocol

כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשתמש בהנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). כלים המשמשים עבור כל הליך כירורגי היו מעוקר ביסודיות.

1. הכנה ראשונית

1. לפני הזרקת תאים סרטניים לתוך הטחול העכבר, לחיטוי ולעקר את כל המכשירים כדי לשמש במהלך ההליך.
2. חטא ו/או אוטוקלב כרית חימום, כפפות כירורגי, גזה, זוגות של מספריים, מלחציים קטנים, כלי הקיבול, מלקחיים כירורגי, ומחזיק מחט.
3. הכינו משכך כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine) שניתן לערוך לאחר כריתת טחול ובכל 12 שעות במשך יומיים.

2. תרבית תאים

1. ודא כי התאים הסרטניים חופשיים מזיהום mycoplasma באמצעות ערכה mycoplasma אליסה.
2. הכנת פתרון 500 mL של מדיום הנשר של Dulbecco (DMEM) culturing בינוני ב 4 ° c עבור התרבות של תאים מורטין סרטן המעי הגס (MC38). התקשורת culturing צריך להיות שיושלם עם 10% חום העובר בלתי מופעל סרום (FBS), 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL של סטרפטומיצין, 15 מ"מ של HEPES ו 200 mM של L-גלוטמין.
3. סרטן תאים סרטניים בבקבוקון DNAse-ו-RNAse-חינם (75 ס מ²). מודטת התרבות התא בתא/רקמה מחולל לחות בחממה המכילה 5% CO₂. שמרו על טמפרטורה ב37 ° c.
4. לאחר התאים מתרבים להגיע 90-100% השטף, מחית את התקשורת הישנה, לשטוף תאים עם מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) ולאחר מכן לטפל בהם עם 1x טריפסין (0.25%) לנתק את התאים מהבקבוקון.
5. לאסוף תאים בצינור 15 mL ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 700 x g.
6. מטפי את התקשורת ושוטף עם 1x PBS פעמיים על ידי חוזר צנטריפוגה.
7. המשך לאשר את הכדאיות בתאים על-ידי צביעת תאים באמצעות הכתם הכחול (0.4%).
8. השהה את התאים מחדש לריכוז של 1 x 10⁶ תאים/100 μl ב-1X PBS. התאים pipet ביסודיות כדי למנוע כל הגושים. לשמור על תאים סרטניים על קרח לפני ההזרקה.

3. הזרקת תאים סרטניים

1. מתחת לגיל 8 – 12-שבוע בן זכר (C57BL6) עכברים על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט.
2. לגלח את עור הבטן של העכברים באמצעות הקוצץ כדי למנוע זיהומים לאחר הניתוח.
3. הניחו עכברים במערכת הנסיגה המגנטית. ודא כי העכברים הם לגמרי תחת השפעת ההרדמה על ידי צובט אצבע או זנב.
4. הוסף טיפות מלוחים לתוך העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.
5. ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) לקיר הבטן מגולח לחטא את העור לפני ביצוע חתך כירורגי.
6. בתחילה להרים את העור עם מלקחיים שיניים ולעשות חתך באמצע קו בעזרת מספריים כירורגי. ואז, להרים את שריר הבטן ואת צפק ליצור חתך באמצע הדרך של כ 3 ס מ אורך (באמצע הבטן לתהליך xiphoid לחשוף את תכולת הבטן. יש להיזהר לא להאריך את החתך מעבר לתהליך xiphoid כדי למנוע דימום מעמיק.
7. מניחים את הדימום בשני צידי החתך ומתחת לתהליך xiphoid. מתחו את הבטן על ידי משיכת הזנב כלפי מטה ומקליטים אותו. השימוש המוליך 6 אינץ ' מכותנה סטרילית עצה להפריד לחשוף את הטחול מרקמת שומן הלבלב.
8. לפני ההזרקה לתוך הטחול, מערבולת התאים הסרטניים כדי למנוע כל הגושים תאים.
9. השתמש 0.5 mL 28 G (0.36 מ"מ x 13 מ"מ) מזרק אינסולין להזרקה. להימנע בועות אוויר.
10. לאט ובזהירות להזריק 100 μL של תאים לקצה הטחול. מניחים טיפ כותנה ומוסיפים לחץ עדין כדי למנוע חזרה לתוך אזור הבטן. זריקה מוצלחת ניתן לצפות על ידי זיהוי השינוי בצבע הכבד במהלך הזריקה.
11. מויסטן גזה סטרילית עם 1x PBS ומניחים אותו על שטח גזור.
12. להעביר את העכברים על משטח חימום עבור 15 דקות כדי לאפשר לתאי סרטן לזרום בתוך המערכת.
13. כדי להמשיך עם איסכמיה כירורגית פציעה reperfusion, בצע את השלבים 5.3-5.10.
    הערה: הליך זה הוא ללמוד את ההשפעה של הקמת I/R המושרה של foci גרורתי.

4. כריתת טחול

1. , כדי לבצע כריתת טחול. השתמש במכשיר הקאטרי שמוחזק ביד הרם בזהירות את הטחול עם מלקחיים חלקים וצרוב את כלי הדם בטחול כדי למנוע דימום מופרז. להסיר את הטחול על ידי הסטת הכלים בסעיף הצרוב.
2. מיד לאחר ההליך, לסגור את החתך בתבנית שכבה כפולה על ידי הראשון שכבת שריר ולאחר מכן את העור. השתמש בתפרים 4-0 פוליפרופילן לקיר הבטן ולעור.
3. לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים.
4. מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
5. הזרקת כאבים שלאחר הניתוח (בופרימטין 0.1 מ"ג/ק"ג) כל 12 שעות במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.

5. איסכמיה reperfusion פציעה

1. ב 5 ימים לאחר כריתת האונה הראשונה, העכברים מורדם על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט. בצע את השלבים 3.3 – 3.4.
2. ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) על הבטן מגולח של העכבר כדי לחטא את העור ולבצע כריתת באמצע הדרך כמתואר לעיל בשלב 3.6.
3. באמצעות שתי עצות כותנה לחלח, הזיזו בעדינות את המעיים מהחלל כדי לחשוף את המבנים המשויכים, כולל הווריד השער. . לנתח את הכבד מרקמת הסביבה
4. הרם את האונות הצדדיים שמאל נגד הסרעפת. הפרד את האונה מרובע האונה השמאלית על ידי מנתח את hilum הכבד עם מספריים האביב באמצעות מיקרוסקופ הפעלה כדי לאפשר ניראות ברורה לכיוון המבנה שילוש הפורטל.
5. מניחים משטח כותנה קטן לחות בין האונה החציוני והאונה הצדדית הימנית כדי ליצור מקום מספיק להדית. באמצעות מלקחיים כלי הקיבול, בזהירות לעבור את 10 ס מ חוט (4.0 פוליפרופילן תפר) כדי להרים את שילוש הפורטל. סגר את כל המבנים שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, ואת צינור המרה) לאונות הכבד החציוני שמאל על ידי הצבת מהדק מיקרוכלי דם באמצעות מיקרו-serrefine המוליך מהדק עם נעל.
6. אם האונות לא להראות שחיקת משמעותי, לקרוא רק את המלחציים על ידי הסרת והחלה.
   הערה: אם הקושי המיידי של הכבד אינו מתרחש גם לאחר הקראת התפס, שקול בזהירות אם להמשיך עם ה-I/R.
7. להסיר את הספוגית כותנה קטנה ממוקם בין האונות לרוחב החציוני הימני. החליפו בעדינות את המעיים בחלל הבטן. לכסות את קיר הבטן עם גזה לח (ספוגה עם 1x PBS) ולכסות עם עטיפת פלסטיק כדי למזער את אובדן הסלע העצמי.
8. מניחים את העכבר על כרית החימום ומחילים את המלחציים לתקופה של 60 דקות.
9. במהלך מרווח האיסכמי, מחפשים ראיות של פציעה איסכמיה על ידי המחשה של החיוור האמצעי של ימין המדיאלי הימני האמצעי ואת האונות הצדדיים.
10. התחל reperfusion על ידי הסרת התפסים לאחר 60 דקות.
    הערה: ראיות של reperfusion ניתן לצפות על ידי שינוי צבע מיידי של האונות הרוחבי השמאלית לרוחב.
11. מיד לאחר reperfusion, לסגור את החתך עם דפוס כפול תפר על ידי הראשון תפירה את שכבת השריר ולאחר מכן את העור. השימוש 4-0 פוליפרופילן תפר בעזרת מחזיק מחט לסגור את קיר הבטן ואת העור.
12. לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים מחומם.
13. מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
14. להזריק כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק ג של buprenorphine) כל 12 h במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.
15. עבור עכברים בעלי/R בעלי הכבד, בצע ניתוח לפני, היליום ותפרים בבטן.
    הערה: התפקיד של לחץ כירורגי המשפיעים על הקמתה של גרורות בכבד ניתן לחקור באמצעות שני עיצובים ניסיוניים שונים. הפרוטוקול הנ ל (דגם -1) משמש להקמת מחלת כבד מיקרומטר וללמוד את ההשפעה של הכבד I/R על התפתחותם (איור 1a). לחילופין, הכבד I/R והזרקת הגידול ניתן לבצע במקביל (דגם -2) כדי ללמוד את ההשפעה של פציעה I/R בהקמת וקדי גרורתי חדש (איור 1b). כדי לעשות זאת, להזריק תאים סרטניים לתוך הטחול כמתואר לעיל ולאפשר להם להסתובב עבור 15 דקות. לבצע ניתוח I/R הכבד או לאחר תקופת המחזור עבור 60 דקות. בצע כריתת טחול לרוחב 60 דקות מאוחר יותר, ולאחר מכן לסגור את החתך לתוך האונה.

6. הערכת עכברים מופעלים

1. במהלך ההליך הכירורגי להבטיח כי העכברים נמצאים תחת השפעת הרדמה בשלב III על ידי ביצוע בדיקת רפלקס palpebral והקרנית. מינון נוסף של הרדמה חייב להינתן על סימני רפלקסים.
2. לספק כאבים שלאחר הניתוח (Buprenorphine 0.1 מ"ג/ק"ג) מיד לאחר הניתוח וכל 12h במשך יומיים כדי למנוע כאבים פוסט כירורגי.
3. אפשר לעכברים 30 – 60 דקות של זמן ההחלמה מהרדמה. כל הזמן לפקח על עכברים ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד התאוששות מלאה.
4. חפשו סימני מצוקה כגון: גב מסוגר, עיניים עצומות, תנועה איטית וכישלון החתן. התייחס בהתאם עד שעכברים יחזרו לפעילותם הרגילה.
5. טיפול מספק כולל נוזלים, חום, Yo, היפוך הסוכן מאפשר xylazine, נייר רך מגבת מצעים (כדי למנוע שאיפה) צריך להינתן לאחר הניתוח כדי לשפר את תקופת ההחלמה.

7. הערכה של איסכמיה של הכבד reperfusion פציעה

1. מיד לאחר החלת המלחציים, לוודא את הציפוי החיוור של החציון ואת האונות לרוחב השמאלי מתרחשת לעומת מזונבת ואת האונות לבני.
2. הערכת פגיעה איסכמיה של הכבד על ידי מדידת סרום אלטין טרנסאמיאז (מלח), סרום אספאנאז (sAST) ו סרום לקטט דהידרוגנאז (sLDH) רמות. הדם יכול להיגרר מווריד הפנים כדי לחלץ סרום 3 – 6 h לאחר החניכה של reperfusion. לבצע היסטולוגיה הכבד כדי לנתח את האזור הגידול אחוז בתוך האונה האיסכמי.

תוצאות

כל סוג wildtype C57BL6) עכברים (n = 20) היו חשופים המודל גרורות בכבד באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. כל העכברים המוזרקים עם או ללא פציעה reperfusion איסכמיה שרדו עד לתאריך ההקרבה. התרשים הסכמטי באיור 1A של הכבד מוזרק סרטן ממחיש את הפקקת של שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, וצינור המרה) אשר...

Discussion

המודל החי המתואר בכתב יד זה מתבסס על שתי גישות עיקריות. הראשון הוא להכיר את היכולת של תאים סרטניים לוקליזציה ומתרבים באונות הכבד. השני הוא ללמוד את ההשפעה של איסכמיה הכבד reperfusion פציעה השפעה על צמיחת הגידול גרורות. מודל זה מתיר את המחקר הרלוונטי של גרורות בכבד בהעדר גרורות משניות בעכבר חיסו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum	Lonza	900-108
L-Glutamin	Gibco	25030-081
Penicilin	Fisher scientific	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientific	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific	SH3023701
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Cell culture Flask 75cm	5 Cells Star	658170
15ml PP Conical Tubes	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gauze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
Microvascular clamp	Finescience tools	18055-03
Micro-Serrefine clamp applicator with lock	Fine science toosl	FST-18056-14
Spring scissor	Fine science toosl	FST-15021-15
Vessel Dilator	Fine science toosl	FST-00276-13
Magnetic fixator Retraction system	Fine science toosl	FST-18200020
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11019-12
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 polypropylene suture	Ethicon	K881H
Needle holder	Harvard Apparatus	72-8826
Heating Pad	Fisher scientific	1443915
Clipper	Oster	559A
Povidone-Iodine solution	Medline	MDS093945
Syringe 1ml 25G	BD safety Glide	305903
Insulin syringe 0.5 ml	BD insulin Syringes	32946
Cotton -Tipped Applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Surgical Microscope	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Ketamine	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
ALT strip	Heska	15809554
AST strip	Heska	15809542
LDH strip	Heska	15809607