Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Resumen

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Resumen

La isquemia hepática y la lesión por reperfusión (I/R), un desafío clínico común, sigue siendo un proceso fisiopatológico inevitable que se ha demostrado que induce múltiples daños en los tejidos y órganos. A pesar de los recientes avances y enfoques terapéuticos, la morbilidad general ha permanecido insatisfactoria, especialmente en pacientes con anomalías parénquimas subyacentes. En el contexto del crecimiento agresivo del cáncer y la metástasis, se sospecha que la I/R quirúrgica es el promotor que regula la recurrencia tumoral. Este artículo tiene como objetivo describir un modelo murino clínicamente relevante de I/R hepática y metástasis hepática colorrectal. Al hacerlo, nuestro objetivo es ayudar a otros investigadores a establecer y perfeccionar este modelo para su práctica de investigación rutinaria para entender mejor los efectos de la I/R hepática en la promoción de metástasis hepáticas.

Introducción

El hígado es uno de los sitios más comunes para el desarrollo de la enfermedad metastásica¹. La mortalidad es casi invariablemente atribuible a complicaciones asociadas con el crecimiento tumoral en el hígado. En pacientes con tumores sólidos metastásicos en el hígado, la cirugía sigue siendo una intervención crucial para el control de la enfermedad y un posible enfoque curativo. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes en última instancia presentan con enfermedad recurrente, predominantemente en el hígado^2,3. Durante la cirugía hepática, el sangrado intraoperatorio es común, a menudo requiere transfusión de sangre y diferentes enfoques técnicos para el control del sangrado, incluidos los métodos de sujeción vascular. Sin embargo, tales medidas causan isquemia hepática/reperfusión (I/R) al tejido hepático. Los efectos adversos de I/R sobre la función hepatocelular han sido bien documentados. El insulto de I/R del hígado enciende cascadas inflamatorias durante la restauración del flujo sanguíneo a través de vías inflamatorias⁴. La lesión de I/R hepática no sólo contribuye a la insuficiencia hepática, sino que la evidencia actual también muestra que la lesión por I/R estimula la adhesión de las células tumorales, y promueve la incidencia de la formación de metástasis y el crecimiento de la enfermedad micrometastásica existente⁵. Hemos informado previamente que el estrés quirúrgico induce la activación de las células inmunitarias que no sólo ayuda en el crecimiento del tumor primario, sino que también facilita las metástasis mediante la captura de células cancerosas dentro de la circulación⁶.

Aquí describimos en detalle una técnica para establecer un modelo de tumor de ratón de metástasis hepática. En este modelo, también presentamos un método para inducir una lesión por reperfusión de isquemia hepática que actúa como sustituto del estrés quirúrgico presente clínicamente durante las hepatectomías. Los métodos combinados de inyección de cáncer e I/R hepática pueden interpretar con éxito el desarrollo de CRLM en pacientes que se han sometido a una resección tumoral primaria.

Protocolo

Todos los protocolos de los animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se adhieren a las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los instrumentos utilizados para cualquier procedimiento quirúrgico fueron completamente esterilizados.

1. Preparación inicial

1. Antes de inyectar células cancerosas en el bazo del ratón, autoclave y esterilizar todos los instrumentos que se utilizarán durante el procedimiento.
2. Esterilice y/o autoclave una almohadilla de calentamiento, guantes quirúrgicos, gasa, pares de tijeras, abrazaderas pequeñas, dilatador de recipientes, fórceps quirúrgicos y un porta agujas.
3. Preparar analgésicos postoperatorios (0,1 mg/kg de buprenorfina) para administrarse después de la esplenectomía y cada 12 h durante 2 días.

2. Cultivo celular

1. Asegúrese de que las células cancerosas estén libres de contaminación por micoplasma mediante el uso de un kit ELISA de micoplasma.
2. Preparar una solución de 500 ml del medio de cultivo del águila modificada (DMEM) de Dulbecco a 4 oC para el cultivo de células cancerosas colorrectales murinas (MC38). Los medios de cultivo deben complementarse con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 15 mM de HEPES y 200 mM de L-glutamina.
3. Cultivar células cancerosas en un matraz libre de ANA y ARNsa (75 cm²). Incubar el cultivo celular en una incubadora humidificada celular/tejido que contenga 5% CO₂. Mantener la temperatura a 37oC.
4. Una vez que las células que proliferan alcanzan 90-100% de confluencia, aspiran a los medios antiguos, lavan las células con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS) y luego las tratan con 1x trippsina (0,25%) para separar las células del matraz.
5. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 700 x g.
6. Aspirar el medio y lavar con 1pbS dos veces por centrifugación repetida.
7. Proceda a confirmar la viabilidad celular mediante la tinción de células con mancha azul tripa (0,4%).
8. Resuspender las células a una concentración de 1 x 10⁶ células/ 100 l en 1x PBS. Células de pipeteo a fondo para evitar grumos. Mantenga las células cancerosas en hielo antes de la inyección.

3. Inyección de células tumorales

1. Anestetizar ratones macho de 8 a 12 semanas (C57BL6) mediante la administración de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) utilizando una aguja de 1 ml de 25 G (0,5 mm x 16 mm).
2. Afeitar la piel abdominal de los ratones usando cortadoras para evitar cualquier infección postoperatoria.
3. Coloque ratones en el sistema de retracción del fijador magnético. Confirme que los ratones están completamente bajo el efecto de la anestesia pellizcando un dedo del dedo del dedo o la cola.
4. Agregue gotas salinas en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento.
5. Solución de povidona-yodo (7,5%) a la pared abdominal asecada para desinfectar la piel antes de hacer una incisión quirúrgica.
6. Inicialmente levante la piel con los fórceps dentados y haga una incisión de línea media con la ayuda de tijeras quirúrgicas. Luego, levante el músculo abdominal y el peritoneo para crear una incisión de línea media de aproximadamente 3 cm de longitud (proceso de medio abdomen a xifoide para exponer el contenido abdominal. Tenga cuidado de no extender la incisión más allá del proceso de xifoide para evitar sangrado extenso.
7. Coloque el hemostat a ambos lados de la incisión y debajo del proceso de xifoide. Extienda el abdomen tirando de la cola hacia abajo y pegándola. Utilice el aplicador de punta de algodón estéril de 6 pulgadas para separar y exponer el bazo del tejido graso pancreático.
8. Antes de la inyección en el bazo, vórtice las células cancerosas para evitar cualquier grumos celulares.
9. Utilice una jeringa de insulina de 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) para inyección. Evite las burbujas de aire.
10. Inyecte lentamente y cuidadosamente 100 s de células en la punta del bazo. Coloque una punta de algodón y agregue una presión suave para evitar el flujo de espalda en la región abdominal. Se puede observar una inyección exitosa identificando el cambio en el color del hígado durante la inyección.
11. Humedezca una gasa estéril con 1pbS y colóquela sobre el área diseccionada.
12. Transfiera los ratones a una almohadilla de calentamiento durante 15 minutos para permitir que las células cancerosas circulen dentro del sistema.
13. Para proceder con la isquemia quirúrgica y la lesión por reperfusión, siga los pasos 5.3-5.10.
    NOTA: Este procedimiento consiste en estudiar el efecto del establecimiento inducido por I/R de focos metastásicos.

4. Esplenectomía

1. Para realizar una esplenectomía, usa un dispositivo de cauterización portátil. Levante cuidadosamente el bazo con fórceps lisos y cauterice los vasos sanguíneos esplénicos para evitar el sangrado excesivo. Retire el bazo transectando los vasos en la sección cauterizada.
2. Inmediatamente después del procedimiento, cierre la incisión en un patrón de doble capa suturando primero la capa muscular y luego la piel. Utilice suturas de polipropileno 4-0 tanto para la pared abdominal como para la piel.
3. Antes de repetir el procedimiento sobre otro animal, desinfecte todos los instrumentos rociándolos con un 70% de isopropanol o insertándolos en un baño de cuentas.
4. Coloque los ratones de nuevo en jaulas originales y busque signos de angustia y dolor postquirúrgico.
5. Inyectar analgésico postoperatorio (Buprenorfina 0,1 mg/kg) cada 12 h durante 2 días para evitar el dolor postquirúrgico.

5. Lesión por reperfusión de isquemia

1. A los 5 días de la primera laparotomía, los ratones anestesian mediante la administración de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) utilizando una aguja de 1 ml de 25 G (0,5 mm x 16 mm). Siga los pasos 3.3–3.4.
2. Solución de povidona-yodo (7,5%) en el abdomen afeitado del ratón para desinfectar la piel y realizar una laparotomía de línea media como se describe anteriormente en el paso 3.6.
3. Usando dos puntas de algodón humedecidas, mueva suavemente el intestino de la cavidad para exponer las estructuras asociadas, incluyendo la vena porta. Diseccionar el hilum hepático libre del tejido circundante.
4. Levante la mediana y los lóbulos laterales izquierdos contra el diafragma. Separe el lóbulo del cuadrante del lóbulo lateral izquierdo disección el hilum hepático con las tijeras de resorte utilizando un microscopio operativo para permitir una visibilidad clara hacia la estructura de la tríada del portal.
5. Coloque un pequeño hisopo de algodón húmedo entre el lóbulo mediano y el lóbulo lateral derecho para crear suficiente espacio para la sujeción. Usando el fórceps dilatador del recipiente, pase cuidadosamente el hilo de 10 cm (sutura de polipropileno 4.0) para levantar la tríada del portal. Ocluir todas las estructuras de la tríada portal (arteria hepática, vena porta y conducto biliar) a la izquierda y media de los lóbulos hepáticos mediante la colocación de una abrazadera microvascular utilizando un aplicador de abrazadera microserrefine con bloqueo.
6. Si los lóbulos no muestran un blanqueamiento significativo, reajuste la abrazadera quitando y volviendo a aplicar.
   NOTA: Si el blanqueamiento inmediato del hígado no se produce incluso después de reajustar la abrazadera, considere cuidadosamente si procede o no con la I/R.
7. Retire el pequeño hisopo de algodón colocado entre los lóbulos laterales medianos y rectos. Reemplace suavemente el intestino en la cavidad abdominal. Cubra la pared abdominal con una gasa húmeda (remojada con 1x PBS) y cubra con una envoltura de plástico para minimizar la pérdida evaporativa.
8. Coloque el ratón sobre la almohadilla de calentamiento y aplique la abrazadera durante un período de 60 minutos.
9. A lo largo del intervalo isquémico, busque evidencia de lesión por isquemia visualizando el blanqueamiento pálido de los lóbulos medios y laterales izquierdos.
10. Inicie la reperfusión quitando las abrazaderas después del período de 60 minutos.
    NOTA: La evidencia de reperfusión se puede observar mediante un cambio de color inmediato de la mediana y los lóbulos laterales izquierdos.
11. Inmediatamente después de la reperfusión, cierre la incisión con un patrón de sutura de doble capa suturando primero la capa muscular y luego la piel. Utilice la sutura de polipropileno 4-0 con la ayuda de un soporte de aguja para cerrar la pared abdominal y la piel.
12. Antes de repetir el procedimiento sobre otro animal, desinfecte todos los instrumentos rociándolos con un 70% de isopropanol o insertándolos en un baño de cuentas calentado.
13. Coloque los ratones de nuevo en jaulas originales y busque signos de angustia y dolor postquirúrgico.
14. Inyectar analgésico postoperatorio (0,1 mg/kg de buprenorfina) cada 12 h durante 2 días para evitar el dolor postquirúrgico.
15. Para ratones falsos de I/R del hígado, realice laparotomía, disección de hilum y suturas abdominales.
    NOTA: El papel del estrés quirúrgico que influye en el establecimiento de metástasis hepáticas se puede investigar a través de dos diseños experimentales diferentes. El protocolo anterior (Modelo-1) se utiliza para establecer la enfermedad hepática micrometastásica y estudiar el efecto de la I/R hepática en su crecimiento (Figura 1A). Alternativamente, la I/R hepática y la inyección tumoral se pueden realizar simultáneamente(Modelo-2) para estudiar el efecto de la lesión de I/R en el establecimiento de nuevos focos metastásicos (Figura1B). Para ello, inyectar células cancerosas en el bazo como se describió anteriormente y permitir que circulen durante 15 minutos. Realizar I/R hepática o cirugía falsa después del período circulante durante 60 min. Realizar esplenectomía lateral 60 min más tarde, y luego cerrar la incisión de laparotomía.

6. Evaluación de ratones operados

1. Durante el procedimiento quirúrgico asegúrese de que los ratones están bajo la influencia de la anestesia en estadio III mediante la realización de pruebas de reflejo palpebraal y corneal. Se debe administrar dosis anestésica adicionales sobre los signos de los reflejos.
2. Proporcionar analgésico postoperatorio (Buprenorfina 0,1mg/kg) justo después de la cirugía y cada 12h durante 2 días para evitar el dolor post quirúrgico.
3. Permita a los ratones de 30 a 60 minutos de tiempo de recuperación de la anestesia. Monitoree constantemente a los ratones y no los deje desatendidos hasta la recuperación completa.
4. Busque signos de angustia como espalda encorvada, ojos cerrados, movimiento lento y falta de cuidado. Tratar en consecuencia hasta que los ratones vuelvan a su actividad normal.
5. Cuidado suplicante incluyendo líquidos, calor, Agente de inversión de yohimbina para la xilazina, ropa de cama de papel suave (para evitar la aspiración) debe proporcionarse después de la cirugía para mejorar el período de recuperación.

7. Evaluación de la lesión por reperfusión de isquemia hepática

1. Inmediatamente después de aplicar la abrazadera, asegúrese de que el blanqueamiento pálido de la mediana y los lóbulos laterales izquierdos se produce en comparación con los lóbulos caudado saqueo y cuadrático.
2. Evaluar la lesión por isquemia hepática midiendo los niveles de alanina transaminasa sérica (sALT), transaminasa de aspartato sérico (sAST) y lactato deshidrogenasa sérica (sLDH). La sangre se puede extraer de la vena facial para extraer suero 3-6 h después del inicio de la reperfusión. Realizar histología hepática para analizar el porcentaje de área tumoral dentro del lóbulo isquémico.

Resultados

Todos los ratones de tipo salvaje (C57BL6) (n x 20) fueron sometidos al modelo de metástasis hepáticas utilizando el protocolo descrito anteriormente. Todos los ratones inyectados con o sin lesión por reperfusión de isquemia sobrevivieron hasta la fecha del sacrificio. El diagrama esquemático Figura 1A de un hígado inyectado por cáncer ilustra la sujeción de la tríada del portal (arteria hepática, vena porta y conducto biliar) que induce una isquémica hepática parcial (70%) insul...

Discusión

El modelo animal descrito en este manuscrito se basa en dos enfoques principales. La primera es reconocer la capacidad de las células cancerosas para localizar y proliferar en los lóbulos hepáticos. El segundo es estudiar el efecto de la lesión por reperfusión de isquemia hepática que influye en el crecimiento tumoral y las metástasis. Este modelo permite el estudio relevante de metástasis hepáticas en ausencia de metástasis secundarias en un ratón inmunocompetente. El modelo es útil para abordar las cuestion...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum	Lonza	900-108
L-Glutamin	Gibco	25030-081
Penicilin	Fisher scientific	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientific	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific	SH3023701
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Cell culture Flask 75cm	5 Cells Star	658170
15ml PP Conical Tubes	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gauze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
Microvascular clamp	Finescience tools	18055-03
Micro-Serrefine clamp applicator with lock	Fine science toosl	FST-18056-14
Spring scissor	Fine science toosl	FST-15021-15
Vessel Dilator	Fine science toosl	FST-00276-13
Magnetic fixator Retraction system	Fine science toosl	FST-18200020
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11019-12
Micro-Adson Forceps	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 polypropylene suture	Ethicon	K881H
Needle holder	Harvard Apparatus	72-8826
Heating Pad	Fisher scientific	1443915
Clipper	Oster	559A
Povidone-Iodine solution	Medline	MDS093945
Syringe 1ml 25G	BD safety Glide	305903
Insulin syringe 0.5 ml	BD insulin Syringes	32946
Cotton -Tipped Applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Surgical Microscope	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Ketamine	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
ALT strip	Heska	15809554
AST strip	Heska	15809542
LDH strip	Heska	15809607