استخدام التصوير المقطعي المحوسب للأشعة السينية الدقيقة مع إعداد حمض فوسفيوالتنغستن لتصور الأنسجة الليفية البشرية

Summary

التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة فعال في الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد من عينات بشرية غير تالفة ولكن له نجاح محدود في مراقبة الأنسجة الرخوة. استخدام عامل تباين حمض فوسفوستجينستيك يمكن حل هذه المشكلة. نفذنا هذا العامل التباين لفحص الأنسجة الليفية الحساسة البشرية (الرباط الاحتفاظ orbicularis).

Abstract

تشريح يدوي والمراقبة النسيجية هي الأساليب الشائعة المستخدمة للتحقيق في الأنسجة البشرية. ومع ذلك، يمكن أن يضر التشريح اليدوي الهياكل الحساسة، في حين أن المعالجة والمراقبة النسيجية توفر معلومات محدودة من خلال التصوير المقطعي. التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة (microCT) هو أداة فعالة للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد دون عينات ضارة. ومع ذلك، فإنه يظهر كفاءة محدودة في التمييز بين أجزاء الأنسجة الرخوة. استخدام عوامل تعزيز التباين، مثل حمض فوسفيوالتنغستن (PTA)، يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق تحسين تباين الأنسجة الرخوة. قمنا بتنفيذ microCT مع PTA للتحقيق في الرباط الاحتفاظ orbicularis الإنسان (ORL)، وهو هيكل دقيق في منطقة المدار. في هذه الطريقة، يتم إصلاح العينات التي تم حصادها في formalin، المجففة في حلول الإيثانول التسلسلي، وملطخة بمحلول PTA. بعد تلطيخ، يتم إجراء المسح الضوئي microCT، وإعادة الإعمار 3D، والتحليل. الجلد, الأربطة, والعضلات يمكن تصورها بوضوح باستخدام هذه الطريقة. حجم العينة ومدة تلطيخ هي السمات الأساسية للطريقة. وكان سمك العينة المناسب حوالي 5-7 ملم، والتي تباطأت فوقها العملية، وكانت المدة المثلى 5-7 أيام، والتي تحدث تحتها ثقب فارغ في المنطقة الوسطى في بعض الأحيان. للحفاظ على موقع واتجاه القطع الصغيرة أثناء القطع، ينصح الخياطة على نفس المنطقة من كل جزء. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى تحليلات أولية للهيكل التشريحي لتحديد كل قطعة بشكل صحيح. يمكن استخدام Parafilm لمنع التجفيف، ولكن ينبغي توخي الحذر لمنع تشويه العينة. وأظهرت ملاحظتنا متعددة الاتجاهات أن ORL يتكون من شبكة متعددة الطبقات من لوحات مستمرة، بدلا من الألياف مثل الخيط، كما ذكر سابقا. وتشير هذه النتائج إلى أن المسح المجهري مع PTA مفيد لفحص مقصورات محددة داخل الهياكل المعقدة للأنسجة البشرية. قد يكون من المفيد في تحليلات أنسجة السرطان, أنسجة الأعصاب, وأجهزة مختلفة, مثل القلب والكبد.

Introduction

عادة ما يستخدم التشريح اليدوي والمراقبة النسيجية لفحص الأنسجة البشرية، مثل العضلات والأنسجة الضامة. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي التشريح اليدوي بسهولة إلى تلف الهياكل الحساسة، وتوفر المراقبة النسيجية معلومات محدودة حول الأسطح المسطحة المقطعية^1و2. لذلك، هناك حاجة إلى أساليب محسنة لفحص الأنسجة بشكل أكثر دقة وكفاءة.

يستخدم التصوير المقطعي المحوسب التقليدي (CT) بشكل عام في الممارسة السريرية، ولكنه يفتقر إلى القدرة على التمييز بين الهياكل الصغيرة^2،3. التصوير المقطعي المحوسب (microCT) هو أداة فعالة للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للهياكل الصغيرة من العينات، دون تدميرها. ومع ذلك، microCT لديها تطبيقات محدودة لأنه يمكن تصور الأنسجة الكثيفة فقط بوضوح. لا يمكن استخدامه للتمييز بين الأنسجة الرخوة. للتغلب على هذا القيد، يمكن استخدام عوامل تلطيخ. عوامل تعزيز التباين، مثل حمض فوسفيوالتنغستن (PTA)، وحمض فوسفلوميبديك، واليود لوغول، وتحسين معدل تباين الأنسجة الرخوة أثناء المسح^{الضوئي 4،5}. العديد من الدراسات مقارنة هذه العوامل تشير إلى أن PTA يدل على الأداء الجيد وسهلة للتعامل مع^6،7،8.

الأربطة الاحتفاظ orbicularis (ORL) هو بنية حساسة حول المدار، والتي يمكن أن تتلف بسهولة خلال المراقبة التقليدية⁹. قمنا بفحص واسترداد بنجاح المعلومات 3D على هذا الهيكل باستخدام microCT مع PTA كعامل تباين. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الدراسات على الأنسجة البشرية الأخرى، مثل القلب والكبد، مع التعديلات المناسبة^10،11،12.

Protocol

تم التبرع بصورة قانونية لجميع الجثث المستخدمة في هذه الدراسة إلى مركز تعليم التشريح الجراحي في كلية الطب بجامعة يونسي.

1. الحصول على عينات

1. رسم خط شق على الجثة مع قلم رصاص ملون للإشارة إلى منطقة القطع لحصاد العينة. تحقق من أن خط الشق المرسوم يمتد ميديا إلى canthus الوسيطة، أفقيا إلى canthus الجانبية، متفوقة على حدود متفوقة من الجفن السفلي، وأدنى إلى 1 سم تحت الخط من الحافة المدارية.
   ملاحظة: خذ بعينة الحجم استناداً إلى الحد الأقصى لحجم المسح الضوئي لمعدات التصوير المقطعي المحوسب (يمكن لمعداتنا الحصول على صورة ذات بعد كائن أقصى قدره 7 × 7 سم). هنا، تم حصاد عينة حوالي 1 سم في العرض، 3 سم في الطول، و 1.25 غرام من الوزن من منطقة ORL.
2. قطع أنسجة الوجه بعد خط الشق مع شفرة. تأكد من أن القطع عميق بحيث يلامس طرف النصل العظم. يجب أن تشمل العينة الجلد والأنسجة تحت الجلد والعضلات والدهون وperiosteum.
3. إصلاح العينة في شكلي 10٪ على الفور والحفاظ عليه لمدة 5 إلى 7 أيام في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1A).
   ملاحظة: يمكن استخدام كل من الجثث المحفورة والجثث الطازجة لهذه الدراسة. ومع ذلك، قد يختلف حل التثبيت للجثث قليلاً عن الحل المستخدم في التجربة البيولوجية. لذلك، نقترح إصلاح العينة مع 10٪ فورمالين مرة أخرى حتى بعد الحصول على عينة من الجثث المحفورة.

2. التحضير للتلطيخ

1. بعد التثبيت، قم بتقطيع العينة إلى 3 قطع (5-7 مم في سمكها). لا تفقد موقع واتجاه كل قطعة خلال هذه العملية.
   ملاحظة: الماسح الضوئي microCT نستخدميمكن أن تغطي الحد الأقصى لحجم 7 سم³، ولكن الحل PTA لا يمكن اختراق العينة بنجاح إذا كان سميكا جدا.
2. خياطة الجانب superolateral من كل قطعة باستخدام إبرة والخيط الأسود بحيث يمكن التحقق من اتجاه العينة في وقت لاحق.
3. تجفيف العينة في سلسلة من 30٪، 50٪، و 70٪ حلول الإيثانول لمدة يوم واحد لكل منهما.
4. وضع العينة في الإيثانول 70٪ حتى تلطيخ.

3- إعداد منطقة التجارة التفضيلية

1. ابدأ عملية تلطيخ PTA قبل أسبوع واحد من جدولة المسح المجهري.
2. إعداد 210 مل من محلول الإيثانول 70٪ وإضافة 2.1 غرام من الطاقة PTA لذلك. مزيج جيدا باستخدام شاكر في 55-60 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يجب أن يكون تركيز حل منطقة التجارة التفضيلية 1٪ في الإيثانول.
3. إعداد ثلاث حاويات بلاستيكية 70 مل لكل قطعة شرائح. ملء الحاويات مع الحل PTA. نقع العينات في الحاويات ووضعها على شاكر لاختراق فعال. ترك العينات لمدة 5-7 أيام(الشكل 1B).
4. عند الانتهاء من تلطيخ، تخزين العينة في الإيثانول 70٪ للتحضير للمسح الضوئي.
   ملاحظة: يمكن الحفاظ على العينات الملونة لعدة أشهر، ولكن من المستحسن أن يتم مسح العينات في أقرب وقت ممكن لضمان تلطيخ كامل.

4. ميكروت المسح الضوئي

1. التفاف العينة مع parafilm لمنع التجفيف. لا التفاف العينات ضيقة جدا، لأن ذلك قد يؤدي إلى تشوه.
2. فتح الماسح الضوئي ووضع العينة على علبة(الشكل 2).
3. تعيين معلمات المسح الضوئي على النحو التالي: الجهد المصدر (كيلوفولت) = 70، مصدر الحالي (μA) = 114، مرشح Al = 0.5 ملم، حجم بكسل الصورة (ميكرومتر ²) = 20، بكسل = 2240 × 2240، التعرض (مللي ثانية) = 500، خطوة دوران (deg) = 0.3.
   ملاحظة: قد يتم تعديل المعلمات وفقًا للعينات و/أو الماسحات الضوئية المستخدمة.
4. بدء المسح الضوئي.
   ملاحظة: يستغرق المسح الضوئي 30 إلى 60 دقيقة استناداً إلى الدقة المقصودة وسرعة الماسح الضوئي.

5 - إعادة بناء البيانات والاستفادة منها إلى أقصى حد

1. تشغيل برنامج إعادة الإعمار. حدد فتح مجموعة البيانات في القائمة إجراءات لتشغيل الملفات الممسوحة ضوئيًا.
2. حدد علامة التبويب إعدادات في إطار إعادة الإنشاء. تعيين المعلمات كما يلي: تقليل قطع الحلقي = 7، تصحيح تصلب الحزمة (٪) = 40.
   ملاحظة: يمكن تعديل المعلمات استناداً إلى العينة.
3. ابدأ إعادة الإنشاء بتحديد البدء في علامة التبويب ابدأ. سيتم تخزين البيانات النهائية في المجلد المعين.
4. تشغيل برنامج تغيير حجم الملف. حدد مجموعة بيانات المصدر لتشغيل الملفات التي تم إعادة بنائها.
5. حدد jpg في علامة التبويب مجموعة البيانات الوجهة.
6. اختر خيار تغيير الحجم 1/2 مع خيار الجودة من لا الاستيفاء (سريع).
7. ضبط شريط الشرائح إلى 100 (أعلى) في علامة التبويب ضغط الصورة.
   ملاحظة: خيار تغيير الحجم لتجنب إبطاء سرعة الكمبيوتر عند تقديم 3D; ومع ذلك، يمكن أن يؤدي إلى دقة أقل عند تغيير حجمها على نطاق واسع. ونقترح تغيير الحجم إلى النصف من أجل التوصل إلى حل مقبول مع معالجة أفضل.

6. إعادة الإعمار 3D

1. تشغيل برنامج تقديم وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد.
2. حدد الإجراءات > تحميل بيانات وحدة التخزين لتشغيل مجموعة البيانات.
3. ضبط مستوى السطوع والتباين عن طريق تعديل وظيفة نقل الشكل في الرسم البياني في علامة التبويب محرر وظيفة النقل.
4. حدد خيارات > إضاءة.
5. حدد رموز الظلال وإضاءة السطح. هذه الآثار توفر لهجة النمذجة واقعية.
6. العثور على أفضل طريقة عرض عن طريق التحرك(انقر واسحب)،والدورية(انقر بزر الماوس الأيمن واسحب)،والتكبير أو التصغير من (التمرير) النموذج.
7. حرك المستوى(التحول + انقر واسحب في الاتجاه الداخلي) لإظهار الصور المقطعية(الشكل 3).
8. قم بتشغيل رمز الضوء. ضبط شريط إشارة الإضاءة والعثور على أفضل الإضاءة للعرض. ثم قم بإيقاف تشغيل الرمز وإغلاق علامة التبويب الإضاءة.
9. حدد خيارات > إظهار > مربع القطع لإخفاء المربع للصورة النهائية.
10. حدد الإجراءات > حفظ الصورة لتخزين الصورة.

النتائج

وقد تم تحقيق إعادة بناء مفصلة من ORL عن طريق microCT مع إعداد PTA(الشكل 4). وقد لوحظ بوضوح الهيكل العضلي الليفي الأربطة التي تمتد بشكل غير مباشر بين الأدمة وperiosteum(الشكل 4A). في وجهة النظر الإكليلية(الشكل 4B)،زادت كمية وتعقيد الألياف أفقيا. في الرؤية ال?...

Discussion

نفذنا microCT مع إعداد PTA في فحص الأنسجة الرخوة البشرية. باختصار، يتم حصاد العينات وثابتة في formalin لبضعة أيام، تليها الجفاف في حلول الإيثانول المسلسل. وضع العينة في حل PTA مباشرة بعد تثبيت formalin يمكن أن يؤدي إلى بعض تكسير الأنسجة بسبب الجفاف السريع. لذلك، هناك حاجة إلى الجفاف التسلسلي قبل تلطيخ PTA....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid	Junsei	84220-0410	PTA powder
CTvox	Bruker	ver 2.7	3D recon software
Nrecon	Bruker	ver 1.7.0.4	Reconstruction software
Skyscan	Bruker	1173	MicroCT scanner
Tconv	Bruker	ver 2.0	File resizing software