Uso de tomografía computarizada de micro rayos X con preparación de ácido fosfotúrtico para visualizar el tejido fibromuscular humano

Resumen

La tomografía computarizada de micro rayos X es eficaz para obtener información tridimensional de muestras humanas no dañadas, pero tiene un éxito limitado en la observación de tejidos blandos. El uso de agente de contraste de ácido fosfotúmético puede resolver este problema. Implementamos este agente de contraste para examinar los tejidos fibromusculares delicados humanos (el ligamento de retención orbicularis).

Resumen

La disección manual y la observación histológica son métodos comunes utilizados para investigar los tejidos humanos. Sin embargo, la disección manual puede dañar estructuras delicadas, mientras que el procesamiento y la observación histológica proporcionan información limitada a través de imágenes transversales. La tomografía computarizada de micro rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional sin dañar las muestras. Sin embargo, muestra una eficiencia limitada en la diferenciación de partes de tejido blando. El uso de agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), puede resolver este problema mejorando el contraste de los tejidos blandos. Implementamos microCT con PTA para investigar el ligamento de retención orbicularis humano (ORL), que es una estructura delicada en el área de la órbita. En este método, los especímenes cosechados se fijan en formalina, se deshidratan en soluciones de etanol en serie y se tiñen con una solución de PTA. Después de la tinción, se realiza la exploración de microCT, la reconstrucción 3D y el análisis. La piel, los ligamentos y los músculos se pueden visualizar claramente utilizando este método. El tamaño de la muestra y la duración de la tinción son características esenciales del método. El espesor adecuado de la muestra fue de unos 5-7 mm, por encima de los cuales el proceso se desaceleró, y la duración óptima fue de 5-7 días, por debajo de los cuales ocasionalmente se producía un agujero vacío en el área central. Para mantener la ubicación y la dirección de las piezas pequeñas durante el corte, se recomienda coser en la misma región de cada pieza. Además, se necesitan análisis preliminares de la estructura anatómica para identificar correctamente cada pieza. El parafilm se puede utilizar para evitar el secado, pero se debe tener cuidado para evitar la distorsión de la muestra. Nuestra observación multidireccional mostró que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas, en lugar de fibras similares a hilos, como se informó anteriormente. Estos resultados sugieren que la exploración por microCT con PTA es útil para examinar compartimentos específicos dentro de estructuras complejas de tejido humano. Puede ser útil en los análisis de tejidos cancerosos, tejidos nerviosos y varios órganos, como el corazón y el hígado.

Introducción

La disección manual y la observación histológica se utilizan normalmente para examinar los tejidos humanos, como los músculos y los tejidos conectivos. Sin embargo, la disección manual puede dañar fácilmente estructuras delicadas, y la observación histológica proporciona información limitada sobre superficies transversales planas^1,2. Por lo tanto, se necesitan métodos mejorados para examinar los tejidos de manera más precisa y eficiente.

La tomografía computarizada convencional (TC) se utiliza generalmente en la práctica clínica, pero carece de la capacidad de distinguir estructuras pequeñas^2,3. Micro Tc de rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional (3D) de pequeñas estructuras a partir de muestras, sin destruirlas. Sin embargo, la microCT tiene aplicaciones limitadas porque sólo los tejidos densos se pueden visualizar claramente; no se puede utilizar para diferenciar los tejidos blandos. Para superar esta limitación, se pueden utilizar agentes de tinción. Los agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), el ácido fosfomolíbódico y el yodo de Lugol, mejoran la tasa de contraste de los tejidos blandos durante la exploración^4,5. Varios estudios que comparan estos agentes sugieren que la PTA demuestra un buen rendimiento y es fácil de manejar^6,7,8.

El ligamento de retención orbicular (ORL) es una estructura delicada alrededor de la órbita, que puede dañarse fácilmente durante la observación convencional^9. Examinamos y recuperamos con éxito información 3D sobre esta estructura utilizando microCT con PTA como agente de contraste. Este método se puede aplicar a estudios sobre otros tejidos humanos, como el corazón y el hígado, con las modificaciones apropiadas^10,11,12.

Protocolo

Todos los cadáveres utilizados en este estudio fueron legalmente donados al Centro de Educación de Anatomía Quirúrgica en la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei.

1. Obtención de muestras

1. Dibuje una línea de incisión en el cadáver con un lápiz de color para indicar el área de corte para la cosecha de muestras. Compruebe que la línea de incisión dibujada se extiende medialmente a un canthus medial, lateralmente a un canthus lateral, superiormente a un borde superior del párpado inferior, e inferiormente a 1 cm por debajo de la línea desde el borde orbital.
   NOTA: Tenga en cuenta el tamaño de la muestra en función del tamaño máximo de escaneado del equipo de micro-CT (nuestro equipo podría adquirir una imagen con una dimensión máxima del objeto de 7 x 7 cm). Aquí, una muestra de aproximadamente 1 cm de ancho, 3 cm de longitud, y 1,25 g de peso se extrajeron de la región ORL.
2. Cortar los tejidos faciales siguiendo la línea de incisión con una cuchilla. Asegúrese de que el corte es profundo de tal forma que la punta de la hoja toque el hueso. La muestra debe incluir la piel, el tejido subcutáneo, el músculo, la grasa y el periosteum.
3. Fijar la muestra en 10% de formalina inmediatamente y conservarla durante 5 a 7 días a temperatura ambiente(Figura 1A).
   NOTA: Para este estudio se pueden utilizar cadáveres embalsamados y frescos. Sin embargo, la solución de fijación para cadáveres puede diferir ligeramente de la solución utilizada en un experimento biológico. Por lo tanto, sugerimos arreglar la muestra con 10% de formalina de nuevo incluso después de obtener la muestra de cadáveres embalsamados.

2. Preparación para la tinción

1. Después de la fijación, cortar la muestra en 3 piezas (5-7 mm de espesor). No pierda la ubicación y dirección de cada pieza durante este proceso.
   NOTA: El escáner microCT que utilizamos puede cubrir un tamaño máximo de 7 cm3, pero la solución PTA no puede penetrar la muestra con éxito si es demasiado gruesa.
2. Coser el lado superolateral de cada pieza usando una aguja y un hilo negro de tal forma que la dirección de la muestra se pueda comprobar más adelante.
3. Deshidratar la muestra en una serie de soluciones de etanol 30%, 50% y 70% para 1 día cada una.
4. Coloque la muestra en 70% de etanol hasta la tinción.

3. Preparación de la PTA

1. Comience el proceso de tinción de la PTA 1 semana antes de que se programe la exploración de microCT.
2. Prepare 210 ml de solución de etanol al 70% y agregue 2,1 g de potencia de la PTA. Mezcle bien con una coctelera a 55-60 rpm.
   NOTA: La concentración de la solución de PTA debe ser del 1% en etanol.
3. Prepare tres envases de plástico de 70 ml para cada pieza en rodajas. Llene los recipientes con la solución PTA. Remoje las muestras en los recipientes y colóquelas en una coctelera para una penetración efectiva. Deje las muestras durante 5-7 días(Figura 1B).
4. Cuando se complete la tinción, almacene la muestra en 70% de etanol para prepararse para el escaneo.
   NOTA: Las muestras manchadas se pueden mantener durante varios meses, pero se recomienda escanear las muestras lo antes posible para garantizar la tinción completa.

4. Escaneo de MicroCT

1. Envuelva la muestra con parafilm para evitar el secado. No envuelva las muestras demasiado apretadas, ya que eso puede conducir a la deformación.
2. Abra el escáner y coloque la muestra en la bandeja(Figura 2).
3. Establezca los parámetros de escaneado de la siguiente manera: voltaje de la fuente (kV) a 70, corriente de origen (A) a 114, filtro Al a 0,5 mm, tamaño de píxel de la imagen (m2) a 20, píxeles a 2240 a 2240, exposición (ms) a 500, paso de rotación (deg) a 0,3.
   NOTA: Los parámetros pueden modificarse de acuerdo con las muestras y/o escáneres utilizados.
4. Comience a escanear.
   NOTA: El escaneo tarda de 30 a 60 minutos dependiendo de la resolución deseada y la velocidad del escáner.

5. Reconstrucción y optimización de datos

1. Ejecute el software de reconstrucción. Seleccione Abrir conjunto de datos en el menú Acciones para iniciar los archivos escaneados.
2. Seleccione la pestaña Configuración en la ventana Reconstrucción. Establezca los parámetros de la siguiente manera: Reducción de artefactos de anillo: 7, Corrección de endurecimiento de haz (%) a 40.
   NOTA: Los parámetros se pueden modificar según la muestra.
3. Comience la reconstrucción seleccionando Inicio en la pestaña Inicio. Los datos finales se almacenarán en la carpeta designada.
4. Ejecute el software de cambio de tamaño de archivo. Seleccione Conjunto de datos de origen para iniciar los archivos reconstruidos.
5. Seleccione jpg en la pestaña Conjunto de datos de destino.
6. Elija la opción Cambiar tamaño 1/2 con una opción Calidad de Sin interpolación (rápida).
7. Ajuste la barra deslizante a 100 (más alto) en la pestaña Compresión de imagen.
   NOTA: La opción de cambio de tamaño es evitar ralentizar la velocidad del equipo cuando se renderiza en 3D; sin embargo, puede resultar en una resolución más baja cuando se redimensiona ampliamente. Sugerimos cambiar el tamaño por la mitad para una resolución aceptable con un mejor manejo.

6. Reconstrucción 3D

1. Ejecute el software de renderizado de volumen 3D.
2. Seleccione Acciones > Cargar datos de volumen para iniciar el conjunto de datos.
3. Ajuste el brillo y el nivel de contraste modificando la función de transferencia de forma en el histograma en la pestaña Editor de funciones de transferencia.
4. Seleccione Opciones > Iluminación.
5. Seleccione los iconos Sombras e Iluminación de superficie. Estos efectos proporcionan un tono de modelado realista.
6. Encuentre la mejor vista moviendo(haga clic y arrastre),girando (haga clic con elbotón derecho y arrastre)y acerque o aleje(desplace)el modelo.
7. Deslice el plano(desplazamiento + clic y arrastre en la dirección interior) para mostrar las imágenes seccionales(Figura 3).
8. Activa el icono Luz. Ajuste la barra de indicación de iluminación y encuentre la mejor iluminación para la visualización. A continuación, apague el icono y cierre la pestaña Iluminación.
9. Seleccione Opciones > Mostrar > Cuadro de recorte para ocultar el cuadro de la imagen final.
10. Seleccione Acciones > Guardar imagen para almacenar la imagen.

Resultados

La reconstrucción detallada del ORL se logró mediante microCT con preparación de la PTA(Figura 4). La estructura fibromuscular ligamentosa que se extiende oblicuamente entre la dermis y el periosteum se observó claramente(Figura 4A). En la vista coronal(Figura 4B),la cantidad y complejidad de las fibras aumentó lateralmente. En la vista horizontal(Figura 4C),se observó un elaborado mallado con una...

Discusión

Implementamos microCT con preparación de LA PTA en el examen de los tejidos blandos humanos. Brevemente, los especímenes se cosechan y fijan en formalina durante unos días, seguidos de la deshidratación en soluciones de etanol en serie. Colocar la muestra en la solución de la PTA directamente después de la fijación de la formalina puede resultar en algunos agrietamiento del tejido debido a la rápida deshidratación. Por lo tanto, se necesita deshidratación en serie antes de la tinción de la PTA. A continuación...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid	Junsei	84220-0410	PTA powder
CTvox	Bruker	ver 2.7	3D recon software
Nrecon	Bruker	ver 1.7.0.4	Reconstruction software
Skyscan	Bruker	1173	MicroCT scanner
Tconv	Bruker	ver 2.0	File resizing software