İnsan Fibromusküler Doku Görselleştirmek için Fosfotungstik Asit Hazırlık ile Mikro X-Ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Özet

Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi, hasar görmemiş insan örneklerinden üç boyutlu bilgi elde etmede etkilidir ancak yumuşak dokuları gözlemlemede sınırlı başarıya sahiptir. Fosfotungstik asit kontrast madde kullanımı bu sorunu çözebilir. Biz insan hassas fibromusküler dokuları incelemek için bu kontrast ajan uygulanan (orbicularis istinligament).

Özet

Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem insan dokularını araştırmak için kullanılan yaygın yöntemlerdir. Ancak, manuel diseksiyon hassas yapılara zarar verebilir, işleme ve histolojik gözlem kesitsel görüntüleme yoluyla sınırlı bilgi sağlarken. Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi (mikroCT) örneklere zarar vermeden üç boyutlu bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, yumuşak doku parçaları ayırt sınırlı verimlilik gösterir. Fosfotungstik asit (PTA) gibi kontrast arttırıcı ajanların kullanımı, yumuşak doku kontrastını geliştirerek bu sorunu çözebilir. Yörünge alanında hassas bir yapı olan insan orbicularis istinat ligamentini (ORL) araştırmak için PTA ile mikroCT uyguladık. Bu yöntemde, hasat edilen numuneler formalin olarak sabitlenir, seri etanol çözeltilerinde susuz kalır ve PTA çözeltisi ile boyanmıştır. Boyama sonrası mikroCT taraması, 3Boyutlu rekonstrüksiyon ve analiz yapılır. Cilt, ligamentler ve kaslar bu yöntemle açıkça görselleştirilebilir. Numune boyutu ve boyama süresi yöntemin temel özellikleridir. Uygun numune kalınlığı yaklaşık 5-7 mm idi ve bu işlem yavaşladı ve optimum süre 5-7 gün idi, aşağıda merkezi alanda bir boşluk zaman zaman oluştu. Kesme sırasında küçük parçaların yerini ve yönünü korumak için, her parçanın aynı bölgesinde dikiş önerilir. Ayrıca, her parçanın doğru bir şekilde tanımlanması için anatomik yapının ön analizlerine ihtiyaç vardır. Parafilm kurumasını önlemek için kullanılabilir, ancak numune bozulmasını önlemeye özen verilmelidir. Çok yönlü gözlemimiz, ORL'nin daha önce bildirildiği gibi iplik benzeri lifler yerine sürekli plakalardan oluşan çok katmanlı bir örgüden oluştuğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, PTA ile mikroCT taramasının insan dokusunun karmaşık yapıları içindeki belirli bölmeleri incelemek için yararlı olduğunu göstermektedir. Bu kanser dokularının analizlerinde yararlı olabilir, sinir dokuları, ve çeşitli organlar, kalp ve karaciğer gibi.

Giriş

Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem genellikle kaslar ve bağ dokuları gibi insan dokuları incelemek için kullanılır. Ancak, manuel diseksiyon kolayca hassas yapılara zarar verebilir, ve histolojik gözlem düz kesit yüzeyleri hakkında sınırlı bilgi sağlar^1,2. Bu nedenle dokuları daha hassas ve verimli bir şekilde incelemek için geliştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.

Konvansiyonel bilgisayarlı tomografi (BT) genellikle klinik uygulamada kullanılır, ancak küçük yapıları ayırt etme yeteneği^{yoksundur 2,3}. Mikro X-ışını CT (microCT) onları yok etmeden, örneklerden küçük yapıların üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, sadece yoğun dokular açıkça görselleştirilebildiği için microCT sınırlı uygulamalara sahiptir; yumuşak dokuları ayırt etmek için kullanılamaz. Bu sınırlamayı aşmak için boyama maddeleri kullanılabilir. Kontrast arttırıcı ajanlar, fosfotungstik asit gibi (PTA), fosfathomolybdic asit, ve Lugol iyot, tarama sırasında yumuşak doku kontrast oranını artırmak^4,5. Bu ajanları karşılaştıran çeşitli çalışmalar PTA iyi performans gösterir ve⁶,^7,8işlemek kolaydır öneririz.

Orbicularis istinat ligament (ORL) yörünge etrafında hassas bir yapıdır, hangi kolayca konvansiyonel gözlem sırasında zarar görebilir⁹. Kontrast madde olarak PTA ile mikroCT kullanarak bu yapıdaki 3Boyutlu bilgileri inceledik ve başarıyla aldık. Bu yöntem, kalp ve karaciğer gibi diğer insan dokuları üzerinde yapılan çalışmalara uygulanabilir, uygun değişiklikler ile^10,11,12.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm kadavralar yasal olarak Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi'ne bağışlandı.

1. Numune alma

1. Örnek hasat için kesme alanını belirtmek için renkli bir kalemle kadavraüzerine bir kesi çizgisi çizin. Çizilen kesi çizgisinin medial kanthus'a, yanal olarak yanal bir kanthusa, alt göz kapağının üstün bir sınırına ve orbital jantın 1 cm altına kadar aşağı bir şekilde uzanıp inferiora uzandığını kontrol edin.
   NOT: Mikro-CT ekipmanının maksimum tarama boyutuna göre numune boyutunu göz önünde bulundurun (ekipmanımız maksimum nesne boyutu7 × 7 cm olan bir görüntü elde edebilir). Burada ORL bölgesinden yaklaşık 1 cm genişliğinde, 3 cm uzunluğunda ve 1,25 g ağırlığında bir numune alındı.
2. Kesi çizgisini takip eden yüz dokularını bıçakla kesin. Bıçağın ucunun kemiğe değecek kadar derin olduğundan emin olun. Örnek deri, deri altı doku, kas, yağ ve periost içermelidir.
3. Numuneyi hemen %10 formalin olarak sabitle ve oda sıcaklığında 5-7 gün saklayın(Şekil 1A).
   NOT: Bu çalışmaiçin hem mumyalanmış hem de taze kadavralar kullanılabilir. Ancak kadavralar için fiksasyon çözümü biyolojik bir deneyde kullanılan çözeltiden biraz farklı olabilir. Bu nedenle, mumyalanmış kadavralardan numune alındıktan sonra bile numunenin %10 formalin ile sabitlenmesini öneririz.

2. Boyama için hazırlık

1. Sabitleme den sonra numuneyi 3 parçaya (5-7 mm kalınlığında) dilimleyin. Bu işlem sırasında her parçanın konumunu ve yönünü kaybetmeyin.
   NOT: Kullandığımız microCT tarayıcı sıc7 cm³ maksimum boyutu kapsayabilir, ancak PTA çözeltisi çok kalın sayılsa bile numuneye başarılı bir şekilde nüfuz edemez.
2. Numunenin yönü daha sonra kontrol edilebilen bir iğne ve siyah iplik kullanarak her parçanın süperolateral tarafını dikin.
3. Numuneyi %30, %50 ve %70 etanol çözeltisi halinde 1'er gün boyunca susuz kalın.
4. Boyama kadar% 70 etanol örnek yerleştirin.

3. PTA hazırlama

1. MikroCT taraması planlanmadan 1 hafta önce PTA boyama işlemine başlayın.
2. 210 mL %70 etanol çözeltisi hazırlayın ve 2,1 g PTA gücü ekleyin. 55-60 rpm bir shaker kullanarak iyice karıştırın.
   NOT: PTA çözeltisinin konsantrasyonu etanolde %1 olmalıdır.
3. Her dilimlenmiş parça için üç adet 70 mL plastik kap hazırlayın. Kapları PTA çözeltisi ile doldurun. Numuneleri kaplara batırın ve etkili penetrasyon için bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Örnekleri 5-7 gün bekletin (Şekil 1B).
4. Boyama tamamlandığında, tarama için hazırlamak için% 70 etanol içinde örnek saklayın.
   NOT: Lekeli numuneler aylarca saklanabilir, ancak tam boyama sağlamak için numunelerin mümkün olan en kısa sürede taranması önerilir.

4. MikroCT tarama

1. Kurutmayı önlemek için numuneyi parafilm ile sarın. Deformasyona yol açabileceğinden örnekleri çok sıkı sarmayın.
2. Tarayıcıyı açın ve örneği tepsiye yerleştirin (Şekil 2).
3. Tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: kaynak gerilimi (kV) = 70, kaynak akımı (μA) = 114, Al filtresi = 0,5 mm, görüntü piksel boyutu (μm²) = 20, piksel = 2240 × 2240, pozlama (ms) = 500, dönüş adımı (deg) = 0,3.
   NOT: Parametreler kullanılan numunelere ve/veya tarayıcılara göre değiştirilebilir.
4. Taramaya başla.
   NOT: Tarama, tarayıcının istenilen çözünürlüğe ve hızına bağlı olarak 30 ila 60 dakika sürer.

5. Verilerin yeniden yapılandırılması ve optimizasyonu

1. Yeniden yapılandırma yazılımını çalıştırın. Taranan dosyaları başlatmak için Eylemler menüsünde Veri Kümesi'ni Aç'ı seçin.
2. Yeniden Yapılandırma penceresindeayarlar sekmesini seçin. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Halka yapıları azaltma = 7, Işın sertleştirme düzeltmesi (%) = 40.
   NOT: Parametreler örneğe göre değiştirilebilir.
3. Başlat sekmesinde Başlat'ı seçerek yeniden yapılandırmaya başlayın. Son veriler belirlenen klasörde depolanır.
4. Dosya yeniden boyutlandırma yazılımını çalıştırın. Yeniden oluşturulan dosyaları başlatmak için Kaynak veri kümesini seçin.
5. Hedef veri kümesi sekmesinde jpg'yi seçin.
6. Hiçbir enterpolasyon (hızlı) Kalite seçeneği ile Yeniden Boyutlandırma seçeneğini 1/2 seçin.
7. Slayt çubuğunu Resim sıkıştırma sekmesinde 100 (en yüksek) olarak ayarlayın. Dönüştürmeye başlayın.
   NOT: Yeniden boyutlandırma seçeneği, 3B işlendiğinde bilgisayar hızını yavaşlatmamaktır; ancak, kapsamlı olarak yeniden boyutlandırıldığında daha düşük çözünürlükneden olabilir. Daha iyi kullanımla kabul edilebilir çözünürlük için ikiye yeniden boyutlandırmanızı öneririz.

6. 3D rekonstrüksiyon

1. 3B ses oluşturma yazılımını çalıştırın.
2. Veri kümesini başlatmak için Eylemler > Yük hacmi verilerini seçin.
3. Aktarım Fonksiyonu Düzenleyicisi sekmesinde histogramında şekil aktarım işlevini değiştirerek parlaklık ve kontrast düzeyini ayarlayın.
4. Seçenekler > Aydınlatma'yıseçin.
5. Gölgeler ve Yüzey Aydınlatma simgelerini seçin. Bu efektler gerçekçi bir modelleme sesi sağlar.
6. Modeli hareket ettirerek(tıklatıp sürükleyin),döndürerek(sağ tıklatArak ve sürükleyerek)ve(kaydırma)modeli yakınlaştırarak veya kaydırarak en iyi görünümü bulun.
7. Kesit resimlerini göstermek için düzlemi kaydırın(shift + click and drag in inner direction ( Şekil3).
8. Işık simgesini açın. Aydınlatma gösterge çubuğunu ayarlayın ve görüntülemek için en iyi aydınlatmayı bulun. Ardından simgeyi kapatın ve Aydınlatma sekmesini kapatın.
9. Son görüntü için kutuyu gizlemek için Seçenekler > Göster > Kırpma Kutusu'nu seçin.
10. Görüntüleri depolamak için Eylemler > Görüntüyü kaydet'i seçin.

Sonuçlar

ORL'nin detaylı rekonstrüksiyonu PTA preparatı ile mikroCT ile sağlanmıştır (Şekil 4). Dermis ve periost arasında eğik olarak uzanan bağsel fibromusküler yapı belirgin bir şekilde gözlenmiştir(Şekil 4A). Koronal görünümde(Şekil 4B),liflerin miktarı ve karmaşıklığı yanal olarak artmıştır. Yatay görünümde(Şekil 4C),ağaçlandırmalı bir formasyona sahip ayrıntılı bir ...

Tartışmalar

İnsan yumuşak dokularının incelenmesinde PTA preparatlı mikroCT uyguladık. Kısaca, numuneler hasat edilir ve birkaç gün formalin sabit, seri etanol çözeltilerinde dehidratasyon takip. Resmiin fiksasyonundan hemen sonra numunenin PTA çözeltisine yerleştirilmesi, hızlı dehidratasyon nedeniyle bazı doku çatlamalarına neden olabilir. Bu nedenle PTA boyamadan önce seri dehidratasyon gereklidir. Daha sonra, örnekler yaklaşık bir hafta boyunca PTA çözeltisi kullanılarak lekelenir. MikroCT taraması, 3D...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid	Junsei	84220-0410	PTA powder
CTvox	Bruker	ver 2.7	3D recon software
Nrecon	Bruker	ver 1.7.0.4	Reconstruction software
Skyscan	Bruker	1173	MicroCT scanner
Tconv	Bruker	ver 2.0	File resizing software