المناعية انحطاط Myofiber في العضلات الخزعات

Summary

وصف هنا هو بروتوكول للمناعة المباشرة من ألياف العضلية الميتة في العضلات. الخلايا الميتة هي نفاذيه للبروتينات المصل ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي G (مفتش). الكشف عن امتصاص مفتش من قبل myofibers يسمح لتحديد والتقدير الكمي من ألياف العضلية التي تخضع لنخر بغض المثل عن حاله العضلات.

Abstract

نخر ألياف العضلات (فرط التعرق) يلعب دورا مركزيا في التسبب في العديد من الحالات العضلية, بما في ذلك حثل العضلات. من المتوقع ان تخفف الخيارات العلاجية التي تعالج أسباب الضمور العضلي من انحطاط العضلات. لذلك ، هناك حاجه إلى طريقه لفحص وقياس مدي موت الخلايا في الخزعات العضلية. الطرق التقليدية لمراقبه تنكس ألياف العضلية في الموقع اما ضعيفه الكمية أو تعتمد علي حقن الاصباغ الحيوية. في هذه المقالة ، يوصف بروتوكول المناعية ان البقع ألياف العضلية الميتة عن طريق استهداف الغلوبولين المناعي G (مفتش) امتصاص من قبل ألياف العضلية. ويستند أسلوب امتصاص مفتش علي ميزات الخلية تميز زوال نخريه ، بما في ذلك 1) فقدان سلامه غشاء البلازما مع الإفراج عن الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية و 2) امتصاص البروتينات البلازما. في الأجزاء المتقاطعة murine ، والمناعية المشتركة من ألياف العضلية ، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية ، والماوس مفتش يسمح بالتحديد النظيف والمباشر للألياف العضلية مع مصير نخريه. هذه الطريقة البسيطة مناسبه للتحليل الكمي وقابله للتطبيق علي جميع الأنواع ، بما في ذلك العينات البشرية ، ولا تتطلب حقن صبغه حيوية. ويمكن أيضا تلطيخ من ألياف العضلية نخريه من امتصاص مفتش ان يقترن مع غيرها من المناعية المشتركة.

Introduction

العضلات الهيكلية الشريطية تتكون أساسا من ألياف العضلات (ألياف العضلية) ، والتي هي المسؤولة عن وظيفة مقلص الطوعية المميزة. هذه الخلايا هي نوى ، وهياكل ما بعد الانقسام التي تدعم الإجهاد الميكانيكية التي تحدث اثناء الانكماش. الاستقرار الهيكلي لغشاء ميوليف (ساركولايما) ومصفوفة خارج الخلية هي حاسمه للتوازن الانسجه. خلايا الأقمار الصناعية تشكل العضلات الرئيسية السكان السلف في العضلات الهيكل العظمي ناضجه وموجودة في حاله هادئه في عضلات صحية. بعد وفاه ألياف العضلية ، يتم دعم تجديد العضلات بواسطة خلايا الأقمار الصناعية التي تتبع البرنامج العضلي الذي ينطوي علي تنشيط الخلايا الساتليه ، والانتشار ، والتمايز ، والانصهار لتشكل في نهاية المطاف نوى ليف جديده.

يمكن ان يحدث زوال ألياف العضلية في حالات العضلات المتعددة ، بما في ذلك الصدمات الميكانيكية ، وإصابات نقص التروية ، أو حثل العضلي ، ويرتبط بالتشكل الميت للخلايا النافقة^1،2. ويتميز الموت نخريه من نفاذيه السريع لغشاء البلازما والإفراج عن محتوي الخلية في المقصورة خارج الخلية³. ويمكن ان ينتج اما عن عمليه غير منظمه لا تنطوي علي اشاره الخلية السليمة (اي النخر العرضي) ، أو مسار منظم داخل الخلايا (اي النخر المنظم). في ألياف العضلية ، وينظم كل من⁴ وغير المنظم⁵ عمليات يمكن ان يؤدي إلى نخر. ومن النتائج النموذجية للتهاب المفاصل هو الإفراج عن أنماط الجزيئات المرتبطة بالضرر ، وتفعيل استجابه التهابيه قويه⁶. لوحظ وجود الضامة في حوالي 48 h و 72 h بعد الاصابه⁷. وبالاضافه إلى دورها في أزاله الحطام نخريه ، فهي أيضا مهمة في تجديد العضلات^8،9.

حثل العضلي (MDs) هي مجموعه غير متجانسة من الامراض التي غالبا ما تنجم عن عيب في بنيه ساركولايما. ضمور العضلات duchenne (DMD) هو مرض الاحداث المرتبطة ب X التي تؤثر علي ما يقرب من 1 من كل الولادات الذكور 3,500 في جميع انحاء العالم¹⁰، وسببه عدم وجود dystrophin التعبير في sarcolemma. الانحطاط المزمن للانسجه العضلية في DMD الأولاد يؤدي إلى ضعف العضلات المدقع والوفاات المبكرة. التهاب الناتج عن الموت نخريه يعزز السمية الخلوية ، ويعزز التليف العضلي وفقدان وظيفة العضلات^11،12. العلاجات الحالية في التجارب السريرية التي تستهدف جذور الاضطرابات التنكسية العضلية ، مثل العلاج الجيني ، من المتوقع ان تخفف من التهاب المفاصل. ولذلك هناك حاجه إلى تقنيات بسيطه لقياس انحطاط العضلات بدقه.

يتم استخدام عده طرق بشكل روتيني لمراقبه فقدان ألياف العضلية في الجسم المجري. قياس النشاط الانزيمي من الكرياتين كيناز (CK) في الدم يسمح كميات موثوقه من النخر المستمر في انسجه العضلات والقلب. في الموقع ، وتلطيخ هيماتوكسيلين و ايوسين (H & E) هو الأسلوب الأكثر شعبيه المستخدمة حاليا في التشخيص لتقييم انحطاط التجديد أعاده النمذجة. بيد ان الأساس الجزيئي لوسم الخلايا الميتة & E لا يزال غير واضح. وعلاوة علي ذلك ، التعديلات اللون مما يوحي الموت ليف في تلطيخ H & E هي خفيه نسبيا ولا تسهل التحديد الكمي موثوق بها واستنساخها. طرق الكشف عن تجزئه الحمض النووي ، مثل المحطة الطرفية ديكسينوكليوديتيل الناقل dutp نك نهاية الوسم (tunel) ، التسمية ناقص الموت نخريه³. كما انها غير مهياه بشكل سيء لرصد وفاه الخلايا الخلوية مثل ألياف العضلية. حقن الاصباغ الحيوية ، مثل صبغه ايفان الزرقاء (EBD) ، يمثل بديلا مفيدا لتقييم ألياف العضلية التي فقدت سلامه ساركولايما ، ولكن ليس بالضرورة مريحه في بعض البروتوكولات التجريبية. فعلي سبيل المثال ، يمكن ان يؤثر وجود EBD في عينات الدم علي نتائج قياسات الكورونا التشيكية ، وهو فحص لوني. وعلاوة علي ذلك ، امتصاص داخل الخلايا من EBD يجعل التعاون المناعي تحديا. ولذلك ، فان الطريقة البديلة التي تسمح بالوسم المباشر للألياف العضلية التي تمر بالنخر هي ذات فائده.

تعتمد اليه عمل الاصباغ الحيوية علي فقدان سلامه غشاء البلازما في ألياف العضلية الميتة والامتصاص السلبي لصبغه الحقن. المثل ، امتصاص ميونوتيك بروتينات الدم مثل الزلال ، والتي EBD لديه تقارب قوي^13،14، الغلوبولين المناعي G (مفتش) ، و¹⁵الغلوبولين. التالي فان وجود غير طبيعي للبروتينات الدم داخل ألياف العضلية يمثل علامات مريحه للتهاب المفاصل في الموقع. تلطيخ هذه البروتينات يمكن ان يكون بديلا لاستخدام الاصباغ الحيوية.

باستخدام امتصاص مفتش كعلامة علي فرط التعرق في الموقع, ويستخدم هذا البروتوكول لتقييم انحطاط العضلات في الامامي الظنبوبي (TA) من الفئران mdx dystrophin ناقص. ويقدم هذا الأسلوب مزايا كبيره علي التقنيات البديلة: 1) انها قابله للاستنساخ وبسيطه في تنفيذه ؛ 2) انه لا يتطلب اي علاج الحيوانية قبل جمع العضلات ، مثل حقن الاصباغ الحيوية المتداولة ، و 3) كما اي المناعية التقليدية ، فانه متوافق مع وضع العلامات المشتركة.

Protocol

وأجريت التجارب وفقا للتشريع الفرنسي وتشريع الجماعة الاوروبيه (رقم الترخيص 11-00010).

1. اعداد اللثة تراغاكانث

1. في كوب زجاجي ، ذوب 6 غرام من مسحوق تراغاكانث في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. غطيه بورق القصدير واتركيه لمده 3 ساعات علي الأقل. يحرك أحيانا يدويا مع ملعقة معدنيه كما يصبح الخليط بسرعة لزج.
2. يترك الخليط تراغاكانث عند 60 درجه مئوية ليلا في حمام مائي أو في الفرن. ختم بعناية الكاس لتجنب التجفيف. يحرك علي الأقل مره واحده قبل الاقتباس.
3. Aliquot وتخزين في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.

2. جمع العضلات

ملاحظه: بالنسبة لهذه التجربة ، تم التضحية بماوس mdx الذكور البالغ من العمر 4 أسابيع عن طريق خلع عنق الرحم. ولا يتطلب هذا الاجراء التخدير وهو أسلوب قتل انساني وفقا للتشريعات المحلية.

1. تشريح العضلات الاماميه (TA) الظنبوبي
   1. بعد حلاقه الساق الماوس ، وضع الماوس علي ظهرها ودبوس القدمين علي اللوح مع الابر. باستخدام مقص الدقة (أو مشرط) والملقط ، وأزاله الجلد الساق من القدم حتى الركبة للكشف عن طول كامل الساق و TA.
   2. مع مقص ، وجعل شق بين الساق و TA. وهذا سوف يسهل فصل TA من العظم وتوفير قبضه سهله لغمد. باستخدام ملقط الدقة ، وأزاله بعناية طبقه غمد من سطح TA.
      ملاحظه: من هذه الخطوة ، TA قد تكون أكثر عرضه للتجفيف ، والتي ينبغي تجنبها.
   3. في منطقه الكاحل ، وعزل وتر TA من الأوتار الأخرى مع ملقط. سحب برفق حتى وتر TA لعزله من الساق والعضلات المحيطة بها.
   4. عندما يتم فصل بطن TA تماما ، وعقد وتر حتى ان الجزء القريب فقط من العضلات TA تعلق علي الركبة. تقطع برفق الوتر القريب أقرب ما يمكن إلى عظم الركبة.
   5. وضع TA في الشاش الذي قللت بخفه مع المالحة لتجنب التجفيف قبل تجميد العضلات.
2. قبل بارد 70 − 100 مل من نظير في كوب من البلاستيك أو تترافلوروايثيلين من خلال غمس جزئيا في النيتروجين السائل. السماح لها لتبرد حتى نظير في الجزء السفلي من الكاس يصبح صلبه بيضاء.
3. علي قطعه دائريه من الفلين (20 مم × 11 مم × 8 مم) ، مكان ~ 0.5 مل من الصمغ تراغاكانث. بعناية قبل تسميه الجانب الآخر من الفلين بحيث يمكن تحديد الخزعة بشكل صحيح بعد خطوه التجميد.
4. تضمين TA في اللثة مع ملقط ، وتر البعيدة. للسماح المقاطع العرضية المناسبة من العضلات, عقد العضلات مع محورها عمودي علي سطح الفلين. وسوف تتحسن نوعيه الحلوى إذا لم يتم تضمين الخزعة تماما في اللثة. السماح لمده لا تقل عن نصف TA (الجانب وتر) ليتم كشفها من قبل اللثة.
5. تراجع بسرعة الفلين مع العضلات المضمنة في طبقه نظير الباردة التي لم يتم تجميدها. لاحظ ان الفلين سوف تطفو في isopentane السائل. عقد العينة راسا علي عقب لان العضلات تحتاج إلى ان انخفض إلى isopentane. ترك العينات في نظير لحوالي 2 دقيقه للسماح تجميد كامل.
   ملاحظه: من هذه المرحلة ، يجب ان تبقي TA المجمدة حتى البرودة. تخزين العضلات في الجليد الجاف قبل التخزين علي المدى الطويل في 80 درجه مئوية الفريزر.

3. التجميد

1. تعيين درجه حرارة التبريد عند-25 درجه مئوية. الحفاظ علي درجه حرارة الجسم في جميع انحاء-20 درجه مئوية. إصلاح الكائن في التبريد باستخدام مركب درجه حرارة القطع الأمثل (أكتوبر). تقليم العضلات حتى تصل إلى بطن العضلات ثم قطع 7 − 10 ميكرومتر المقاطع.
   ملاحظه: يتطلب تثبيت درجه حرارة الكائن 10 دقائق علي الأقل.
2. الحفاظ علي الشرائح الزجاجية المستخدمة لجمع الحلويات في درجه حرارة الغرفة (RT). جمع قسمين علي الأقل علي كل شريحة. سوف المقاطع العضلات عصا تلقائيا وذوبان الجليد في الاتصال من الشريحة الزجاجية الدافئة. أزاله الشريحة والاحتفاظ بها في RT.
3. السماح للمقاطع لتجف 20 دقيقه علي الأقل في RT في بيئة التهوية.
4. تخزين الحلوى علي الشرائح الزجاجية في-80 درجه مئوية حتى الاستخدام.

4. المناعة

1. ذوبان الشرائح في RT لمده 15 دقيقه علي الأقل في بيئة التهوية.
2. يرسم منطقه الأقسام بقلم مسعور. السماح لحاجز مسعور لتجف.
3. إصلاح الانسجه مع 2 ٪ بارافورمالدهيد لمده 10 دقيقه في غرفه الرطبة.
4. غسل الأقسام مع الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 2x لمده 5 دقائق لكل منهما.
5. منع أقسام العضلات مع المصل الماعز 10 ٪ المخفف في التليفزيون لمده 1 ساعة في RT في غرفه الرطبة.
6. احتضان الأقسام ل 2 ح في RT (أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية) في غرفه رطبه مع الأجسام المضادة الاساسيه المخففة في مصل الماعز 5 ٪. لوضع العلامات البسيطة لامتصاص اللقاحات في ألياف العضلية ، فقط الأقسام المحتضنة مع الأجسام المضادة لأرنب لlaminin الفار.
   ملاحظه: يمكن استهداف مستضدات أخرى من المصفوفة خارج الخلية طالما انها توفر وسم واضح لمصفوفة خارج الخلية المحيطة من ألياف العضلية. علامات لتجديد العضلات, التهاب, أو المعلمات الأخرى يمكن الجمع بين طالما لم يتم رفع الأجسام المضادة في مضيف الماوس. وينبغي ان يتضمن المجهر المستخدم في التحليل لونا مضانا تكميليا.
7. اغسل الأقسام مع 3x تلفزيوني لمده 5 دقائق لكل منهما.
8. احتضان الأقسام مع الأحمر الرطب الماعز الأجسام المضادة الثانوية إلى الأرنب مفتش h & l والأخضر الرطب الماعز بولكلونل الأجسام المضادة الثانوية إلى الماوس مفتش h & ل. احتضان في RT ل 45 دقيقه في غرفه الرطبة.
9. غسل مع تلفزيوني 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما.
10. جبل الأقسام في الفلورسنت تركيب المتوسطة التي تحتوي علي 100 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) وتغطي كل شريحة مع coverslip.
11. السماح بالتجفيف بين عشيه وضحيها عند 4 درجه مئوية قبل التصوير.

النتائج

ألياف العضلية محاطه بمصفوفة خارج الخلية تحتوي علي laminin. الأحمر تلطيخ يحدد ميونوليف محيط ويسمح للتعرف عليها. ويظهر مفتش باللون الأخضر. النوى ملطخه DAPI ويتم العثور علي الأزرق تحت المجهر. ومع ذلك ، يتم عرض النوى باللون الأبيض هنا (الشكل 1). ومن المتوقع ان المناع...

Discussion

نخر myofiber هو نتيجة شائعه لممارسه الصدمة في العضلات العادية. ويعوض جيدا من قدره التجدد قويه من المولدين العضلات المحلية. ومع ذلك, في العديد من الحالات العضلات مثل في MDs, القدرة علي التجدد من الخلايا الأقمار الصناعية للخطر من قبل التهاب المفاصل المزمن والتليف المفرط. وتظهر النتائج الاخيره ان ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C