肌肉活检中的免疫标记肌纤维退化

摘要

这里描述的是肌肉冷冻科坏死肌纤维直接免疫标签的协议。坏死细胞可渗透到血清蛋白，包括免疫球蛋白G（IgG）。揭示肌纤维对IgG的摄取，允许识别和定量肌纤维，无论肌肉状况如何，都会发生坏死。

摘要

肌肉纤维坏死（肌骨病）在多种肌肉状况的发病机制中起着核心作用，包括肌肉萎缩症。解决肌肉营养不良发病机制原因的治疗方案有望缓解肌肉退化。因此，需要一种方法来测定和量化肌肉活检中细胞死亡的程度。观察原位肌纤维退化的常规方法要么定量不足，要么依靠注射重要染料。本文描述了免疫荧光方案，通过靶向肌纤维的免疫球蛋白G（IgG）的摄入来染色坏死肌纤维。IgG的取法基于细胞特征特征，包括1）血浆膜完整性的丧失与损伤相关的分子模式的释放，以及2）血浆蛋白的接受。在鼠阵横截面中，肌纤维、细胞外基质蛋白和小鼠IgG的共免疫标签允许对肌纤维进行清洁和直接的识别，并造成坏死的命运。这种简单的方法适用于定量分析，适用于所有物种，包括人类样品，并且不需要注射重要染料。IgG吸收对坏死肌纤维的染色也可以与其他共免疫标签搭配使用。

引言

骨骼肌主要由肌肉纤维（肌纤维）组成，这些纤维负责典型的自愿收缩功能。这些细胞是多核的后线结构，支持收缩过程中发生的机械应力。肌纤维膜（沙科雷马）及其细胞外基质的结构稳定性对组织平衡至关重要。卫星细胞构成成熟骨骼肌中的主要肌肉祖体群体，在健康肌肉中处于静止状态。在肌纤维死亡后，肌肉再生由卫星细胞支持，其后是一个涉及卫星细胞活化、增殖、分化和融合的肌基程序，最终形成新的多核肌纤维。

肌纤维死亡可能发生在多种肌肉条件，包括机械创伤，缺血再灌注损伤，或肌肉营养不良，它与死细胞^1，2的坏死形态相关。死神死亡的特点是血浆膜的快速渗透和细胞外腔室细胞含量的释放^3。它可能导致一个不受管制的过程，没有适当的细胞信号（即意外坏死），或经过编排的细胞内通路（即调节坏死）。在肌纤维中，调节^的4和未调节^的5个过程都可能导致坏死。阴囊炎的典型后果是释放损伤相关分子模式，激活强大的炎症反应^6。在7号受伤后，在48小时和72小时观察到巨噬细胞的存在。除了在清除坏死碎片中的作用，它们在肌肉再生^8，9也很重要。

肌肉萎缩症（MDs）是一个异质的病理学组，通常由沙科勒马结构的缺陷引起。杜琴肌肉萎缩症（DMD）是一种青少年X相关疾病，影响全球每3，500名男性出生¹⁰个，并且是由沙眼缺乏肌营养不良素表达引起的。DMD男孩肌肉组织的慢性退化会导致极度肌肉无力和过早死亡。坏死引起的炎症增强细胞毒性，促进肌肉纤维化和肌肉功能丧失^11，12。目前针对肌肉退行性疾病根源的临床试验，如基因治疗，有望缓解肌功能障碍。因此，需要简单的技术来准确量化肌肉退化。

一些方法通常用于监测体内肌纤维损失。测量血液中肌酸激酶 （CK） 的酶活性，可以可靠地定量肌肉和心脏组织中持续的坏死。原位，血氧林和欧辛（H&E）染色是目前用于诊断评估变性再生重塑的最流行的方法。然而，死细胞H&E标签的分子基础仍不清楚。此外，表明H&E染色中肌纤维死亡的色彩修饰相对微妙，不利于可靠和可重复的定量。揭示DNA分块的方法，如端溶脱氧核糖核酸酶转移酶dUTP刻末标签（TUNEL），不完全标称坏死死亡^3。它们也不太适应监测同步细胞（如肌纤维）的死亡。注射重要的染料，如埃文的蓝色染料（EBD），是评估已经失去沙科雷马完整性的肌纤维的有用替代品，但在某些实验协议中不一定方便。例如，血液样本中EBD的存在会影响CK测量的结果，这是一种色度测定。此外，细胞内对EBD的接受使得共免疫标签具有挑战性。因此，允许直接标记患有坏死的肌纤维的替代方法是值得关注的。

重要染料的作用机制依赖于坏死肌纤维中血浆膜完整性的丧失和注射染料的被动接受。同样，坏死肌纤维摄入血液蛋白，如白蛋白，其中EBD具有很强的亲和力^13，14，免疫球蛋白G（IgG）和^IgM15。因此，肌纤维中血液蛋白的异常存在为原位肌骨细胞分不位提供了方便的标记物。染色这些蛋白质可以是使用重要染料的替代方法。

通过使用IgG的接受作为原位肌性骨症的标记，此方案用于评估mdx营养不良症小鼠的tibialis前（TA）的肌肉退化。与替代方法技术不同，该方法具有显著的优势:1）其可重复性和执行简单性;2） 在肌肉收集之前不需要任何动物治疗，如注射循环的重要染料，以及3）作为任何常规免疫标签，它与共标签兼容。

研究方案

实验是根据法国和欧洲共同体的立法（许可证号11-00010）进行的。

1. 特拉加坎特牙龈制备

1. 在玻璃烧杯中，将6克的龙甘粉溶解在100 mL的去离子水中。用铝箔盖住，离开至少3小时。偶尔用金属铲子手动搅拌，因为混合物迅速变得粘稠。
2. 将酒水混合物放在60°C下过夜，放在水浴或烤箱中。小心密封烧杯，避免干燥。在等量报价之前至少搅拌一次。
3. 在4°C下储存长达2周。

2. 肌肉收集

注:在这个实验中，一只4周大的雄性mdx小鼠因宫颈错位而牺牲。这个程序不需要麻醉，是一种根据当地立法的人道杀人方法。

1. 切除前部 （TA） 肌肉
   1. 剃下鼠标腿后，将鼠标放在其背上，用针将脚固定在软木板上。使用精密剪刀（或手术刀）和钳子，从脚到膝盖删除腿皮，露出整个长的tibia和TA。
   2. 用剪刀，在头骨和TA之间切开。这将促进TA从骨骼分离，并提供一个容易的抓地力的表皮。使用精密钳子，小心地从 TA 表面去除表皮层。
      注:从此步骤中，TA 可能更容易干燥，应避免干燥。
   3. 在脚踝区域，用钳子将 TA 肌腱与其他肌腱隔离。轻轻地拉起TA肌腱，将其与肌腱和周围肌肉隔离。
   4. 当 TA 腹部完全分离时，将肌腱向上握住，以便只有 TA 肌肉的近端部分附着在膝盖上。轻轻地将近肌腱尽可能靠近膝骨。
   5. 将 TA 放在用盐水轻轻浸湿的纱布中，以免在冻结肌肉之前干燥。
2. 在塑料或聚四氟乙烯烧杯中预冷却 70–100 mL 的亚利坦，将其部分浸入液氮中。让它冷却，直到烧杯底部的苯苯成白色固体。
3. 在一块圆形软木塞上（20 毫米 x 11 毫米 x 8 毫米），放置 ±0.5 mL 的龙舌化口香糖。小心地预先标记软木塞的另一侧，以便在冻结步骤后正确识别活检。
4. 将 TA 嵌入到牙龈中，用钳子，远端肌腱向上。要允许适当的肌肉横截面，请保持其轴垂直于软木表面的肌肉。如果活检不完全嵌入牙龈，冷冻科的质量将会提高。允许牙龈发现至少一半的 TA（肌腱侧）。
5. 快速将软木塞与嵌入的肌肉浸入解冻的冷的可上层。请注意，软木塞将漂浮在液体中。将样品倒置，因为肌肉需要浸入苯并苯。将样品留在苯苯还苯，等待约 2 分钟，以便完全冻结。
   注:在此阶段起，TA 必须保持冻结状态，直到冷冻。将肌肉储存在干冰中，然后长期储存在-80°C冰柜中。

3. 冷冻切片

1. 将低温设定在-25°C。使物体温度保持在-20°C左右。使用最佳切割温度 （OCT） 化合物将物体固定在低温中。修剪肌肉，直到到达肌肉腹部，然后削减7×10 μm部分。
   注:稳定物体温度至少需要10分钟。
2. 保持用于在室温 （RT） 下收集冷冻部分的玻璃玻片。在每张幻灯片上至少收集两个部分。肌肉部分会自动粘住和解冻在温暖的玻璃幻灯片的接触。取出幻灯片并将其保持在 RT 上。
3. 在通风环境中，在 RT 下至少让部分干燥 20 分钟。
4. 将冷冻部分储存在-80°C的玻璃玻片上，直到使用。

4. 免疫标签

1. 在通风环境中在 RT 下解冻至少 15 分钟。
2. 用疏水笔划定截面区域。让疏水屏障干燥。
3. 在潮湿的室内用2%的甲醛固定组织10分钟。
4. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤各2次，每次5分钟。
5. 在潮湿的室内用10%山羊血清在PBS中稀释1小时，在RT中阻断肌肉部分。
6. 在RT（或在4°C下过夜）在潮湿室中孵育各部分2小时，在5%山羊血清中稀释原抗体。对于肌纤维的简单IgG接受标签，只用兔抗体孵育小鼠泛拉米宁。
   注:细胞外基质的其他抗原可以靶向，只要它们为肌纤维周围的细胞外基质提供清晰的标记。只要抗体不在小鼠宿主中升高，肌肉再生、炎症或其他参数的标记即可组合。用于分析的显微镜应包括补充荧光颜色。
7. 用 PBS 3x 清洗各部分 5 分钟。
8. 用红色荧光山羊多克隆二次抗体孵育兔子IgG H&L和绿色荧光山羊多克隆二级抗体，以小鼠IgG H&L.在RT孵育45分钟，在潮湿的腔室中。
9. 用PBS 3次清洗，每次10分钟。
10. 将部分安装在含有 100 纳克/mL 4°、6-二酰胺-2-苯胺醇 （DAPI） 的荧光安装介质中，并用盖玻片覆盖每张幻灯片。
11. 成像前，允许在4°C下干燥过夜。

结果

肌纤维被含有层宁的细胞外基质包围。红色染色划定了肌纤维的外围，并允许其识别。IgG 显示为绿色。核被DAPI染色，在显微镜下被发现为蓝色。然而，核在这里以白色显示（图1）。弱IgG免疫反应预计在细胞外腔，在炎症的情况下可以增加。肌纤维内的绿色染色反映了IgG的存在。

Mdx 小鼠 TA 的特点是在 3 ...

讨论

肌纤维坏死是正常肌肉创伤性运动的一个常见后果。它由本地肌肉祖孕者强大的再生能力很好地补偿。然而，在一些肌肉状况，如在MD，卫星细胞的再生能力受到慢性肌瘤病和过度纤维化的影响。最近的发现表明，肌肉纤维可以死于坏死，一种受管制的坏死形式。更具体地说，抑制肾上一代可能成为DMD治疗⁴的新治疗策略。调查肌肉退化障碍的细胞死亡途径需要可靠的肌肉细胞死?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C