Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

Riepilogo

Descritto qui è un protocollo per l'immunolabelling diretto delle minofibre necrotiche nelle criosezioni muscolari. Le cellule necrotiche sono permeabili alle proteine del siero, tra cui l'immunoglobulina G (IgG). Rivelare l'assorbimento di IgG da miofibre permette l'identificazione e la quantificazione delle miofibre che subiscono necrosi indipendentemente dalla condizione muscolare.

Abstract

La necrosi delle fibre muscolari (mionecrosi) svolge un ruolo centrale nella patogenesi di diverse condizioni muscolari, tra cui le distrofie muscolari. Le opzioni terapeutiche che affrontano le cause della patogenesi della distrofia muscolare dovrebbero alleviare la degenerazione muscolare. Pertanto, è necessario un metodo per testare e quantificare l'estensione della morte cellulare nelle biopsie muscolari. I metodi convenzionali per osservare la degenerazione della miofibra in situ sono scarsamente quantitativi o si basano sull'iniezione di coloranti vitali. In questo articolo, viene descritto un protocollo di immunofluorescenza che macchia le miofibre necrotiche prendendo di mira l'assorbimento dell'immunoglobulina G (IgG) da parte delle miofibre. Il metodo di assorbimento IgG si basa su caratteristiche cellulari che caratterizzano la scomparsa necrotica, tra cui 1) la perdita di integrità della membrana plasmatica con il rilascio di modelli molecolari associati ai danni e 2) l'assorbimento di proteine plasmatiche. Nelle sezioni trasversali murine, la co-immunolabelling di miofibre, proteine a matrice extracellulare e IgG di topo consente un'identificazione pulita e diretta delle miofibre con il destino necrotico. Questo semplice metodo è adatto per l'analisi quantitativa e applicabile a tutte le specie, compresi i campioni umani, e non richiede l'iniezione di tinri vitali. La colorazione delle miofibre necrotiche da parte dell'assorbimento DiGG può anche essere abbinata ad altre co-immunolabelling.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è costituito principalmente da fibre muscolari (miofibre), responsabili della caratteristica funzione contrattuale volontaria. Queste cellule sono multinucleate, strutture post-mitotiche che supportano lo stress meccanico che si verificano durante la contrazione. La stabilità strutturale della membrana della miofibra (sarcolemma) e della sua matrice extracellulare sono cruciali per l'omeostasi dei tessuti. Le cellule satellitari costituiscono la principale popolazione progenitrice muscolare nel muscolo scheletrico maturo ed esistono in uno stato quiescente nei muscoli sani. Dopo la morte della miofibra, la rigenerazione muscolare è supportata da cellule satellitari a seguito di un programma miogenico che prevede l'attivazione, la proliferazione, la differenziazione e la fusione delle cellule satellitari per formare in ultima analisi nuove miofibre multinucleate.

La scomparsa della mionina può verificarsi in più condizioni muscolari, tra cui traumi meccanici, lesioni da ischemia-reperfusione, o distrofie muscolari, ed è associata alla morfologia necrotica delle cellule morte^1,2. La morte necrotica è caratterizzata dalla rapida permeabilità della membrana plasmatica e dal rilascio del contenuto cellulare nel compartimento extracellulare³. Può derivare da un processo non regolamentato che non comporta una corretta segnalazione cellulare (cioè necrosi accidentale) o da un percorso intracellulare orchestrato (cioè necrosi regolamentata). Nelle miofibre, sia regolato⁴ e non regolamentato⁵ processi possono portare alla necrosi. Una conseguenza tipica della miocrosi è il rilascio di modelli molecolari associati ai danni, attivando una potente risposta infiammatoria⁶. La presenza di macrofagi è osservata a circa 48 h e 72 h a seguito della lesione⁷. Oltre al loro ruolo nella distanza dei detriti necrotici, sono importanti anche nella rigenerazione muscolare^8,9.

Le distrofie muscolari (MD) sono un gruppo eterogeneo di patologie che spesso derivano da un difetto nella struttura del sarcolemma. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia giovanile legata all'X che colpisce circa 1 su ogni 3.500 nascite maschiliⁱⁿtutto il mondo, ed è causata dall'assenza di espressione distrofina al sarcolemma. La degenerazione cronica del tessuto muscolare nei ragazzi della DMD porta a una debolezza muscolare estrema e alla mortalità precoce. L'infiammazione derivante dalla morte necrotica migliora la citotossicità e favorisce la fibrosi muscolare e la perdita della funzione muscolare^11,12. Si prevede che i trattamenti attualmente in sperimentazione clinica che colpiscono le radici dei disturbi degenerativi muscolari, come la terapia genica, alleviano la mioonecrosi. Sono quindi necessarie tecniche semplici per quantificare con precisione la degenerazione muscolare.

Diversi metodi sono regolarmente utilizzati per monitorare la perdita di miofibra in vivo. La misurazione dell'attività enzimatica della creatina chinasi (CK) nel sangue consente una quantificazione affidabile della necrosi in corso nei tessuti muscolari e cardiaci. In situ, la colorazione ematossia e eosina (H&E) è il metodo più popolare attualmente utilizzato nella diagnosi per valutare il rimodellamento della rigenerazione degenerazione. Tuttavia, la base molecolare dell'etichettatura H&E delle cellule morte rimane poco chiara. Inoltre, le modifiche del colore che suggeriscono la morte della miofibra nella colorazione H&E sono relativamente sottili e non facilitano la quantificazione affidabile e riproducibile. Metodi che rivelano la frammentazione del DNA, come il transfersasi dUTP nick end labelling (TUNEL) del deossinucleotidicolo terminale, la morte necrotica^{imperfetta 3}. Sono anche scarsamente adattati per monitorare la morte di cellule sinciziali come le miofibre. L'iniezione di coloranti vitali, come la tinta blu di Evan (EBD), rappresenta un'utile alternativa per valutare le miofibre che hanno perso l'integrità del sarcolemma, ma non è necessariamente conveniente in alcuni protocolli sperimentali. Ad esempio, la presenza di EBD nei campioni di sangue può influenzare i risultati delle misurazioni CK, un test colorimetrico. Inoltre, l'assorbimento intracellulare di EBD rende difficile la co-immunolabelling. Pertanto, un metodo alternativo che consente l'etichettatura diretta delle miofibre sottoposte a necrosi è di interesse.

Il meccanismo d'azione dei coloranti vitali si basa sulla perdita dell'integrità della membrana plasmatica nelle mitraglie necrotiche e sull'assorbimento passivo del coloranti iniettato. Allo stesso modo, le miofibre necrotiche assorbono proteine del sangue come l'albumina, per le quali EBD ha una forte affinità^13,14, immunoglobuina G (IgG) e IgM¹⁵. La presenza anomala di proteine ematiche all'interno delle miofibre rappresenta quindi marcatori convenienti per la mionecrosi in situ. Colorare queste proteine può essere un'alternativa per l'uso di coloranti vitali.

Utilizzando l'assorbimento di IgG come marcatore della miocrosi in situ, questo protocollo viene utilizzato per valutare la degenerazione muscolare nel tibialis anteriore (TA) di topi mdx distrophin-carenti. Questo metodo presenta vantaggi significativi rispetto alle tecniche alternative: 1) è riproducibile e semplice nella sua esecuzione; 2) non richiede alcun trattamento animale prima della raccolta muscolare, come l'iniezione di coloranti vitali circolanti, e 3) come qualsiasi immunoetichettatura convenzionale, è compatibile con la co-etichettatura.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la legislazione francese e comunitaria (numero di licenza 11-00010).

1. Preparazione della gomma tragacanth

1. In un bicchiere di vetro, sciogliere 6 g di polvere di tragacanto in 100 mL di acqua deionizzata. Coprire con un foglio e lasciare per almeno 3 h. Occasionalmente mescolare manualmente con una spatola metallica come la miscela diventa rapidamente viscoso.
2. Lasciare la miscela di tragacanto a 60 gradi durante la notte in un bagno d'acqua o in forno. Sigillare con cura il becher per evitare l'essiccazione. Mescolare almeno una volta prima dell'aliquota.
3. Aliquota e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.

2. Collezione muscolare

NOTA: Per questo esperimento, un topo mdx maschio di 4 settimane è stato sacrificato dalla lussazione cervicale. Questa procedura non richiede anestesia ed è un metodo di uccisione umano in conformità con la legislazione locale.

1. Dissezione del muscolo tibiale anteriore (TA)
   1. Dopo aver rasato la gamba del topo, posare il mouse sulla schiena e pin i piedi su una tavola di sughero con aghi. Utilizzando forbici di precisione (o bisturi) e pinze, rimuovere la pelle della gamba dal piede fino al ginocchio per esporre l'intera lunghezza della tibia e TA.
   2. Con le forbici, fare un'incisione tra la tibia e TA. Questo faciliterà la separazione della TA dall'osso e fornirà una facile presa all'epimysio. Utilizzando pinze di precisione, rimuovere con attenzione lo strato di epimysio dalla superficie dell'TA.
      NOTA: Da questo passaggio, il TA può essere più suscettibile all'essiccazione, che dovrebbe essere evitato.
   3. Nella regione della caviglia, isolare il tendine TA da altri tendini con pinze. Tirare delicatamente il tendine TA per isolarlo dalla tibia e dai muscoli circostanti.
   4. Quando il ventre TA è completamente separato, tenere il tendine in modo che solo la parte prossimale del muscolo TA è attaccata al ginocchio. Recidere delicatamente il tendine prossimale il più vicino possibile all'osso del ginocchio.
   5. Mettere la TA in una garza leggermente smorzata con salina per evitare l'essiccazione prima di congelare il muscolo.
2. Pre-raffreddare 70-100 mL di isopentane in un becher di plastica o politetrafluoroetilene immergendolo parzialmente in azoto liquido. Lasciare raffreddare fino a quando l'isopentane nella parte inferiore del becher diventa un solido bianco.
3. Su un pezzo circolare di sughero (20 mm x 11 mm x 8 mm), posizionare 0,5 mL di gomma tragacanth. Preetichettare attentamente l'altro lato del sughero in modo che la biopsia possa essere identificata correttamente dopo la fase di congelamento.
4. Incorporare la TA nella gomma con pinze, tendine distale. Per consentire sezioni trasversali appropriate del muscolo, tenere il muscolo con il suo asse perpendicolare alla superficie del sughero. La qualità delle criosezioni migliorerà se la biopsia non è completamente incorporata nella gomma. Lasciare che almeno la metà della TA (lato del tendine) sia scoperta dalla gomma.
5. Immergere rapidamente il tappo con il muscolo incorporato nello strato non congelato e freddo èopentane. Si noti che il tappo galleggia nel liquido èopentane. Tenere il campione a testa in giù come il muscolo deve essere immerso in isopentane. Lasciare i campioni nell'isopentane per circa 2 min per consentire il congelamento completo.
   NOTA: Da questa fase, la TA deve rimanere congelata fino alla criosezione. Conservare il muscolo nel ghiaccio secco prima di essere conservato a lungo termine in un congelatore a -80 gradi centigradi.

3. Criosezione

1. Impostare la temperatura criostat a -25 gradi centigradi. Mantenere la temperatura dell'oggetto a circa -20 gradi centigradi. Fissare l'oggetto nel criostato utilizzando il composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). Tagliare il muscolo fino a raggiungere la pancia muscolare, quindi tagliare le sezioni di 7,10 m.
   NOTA: la stabilizzazione della temperatura dell'oggetto richiede almeno 10 min.
2. Conservare i vetrini di vetro utilizzati per la raccolta di criosezioni a temperatura ambiente (RT). Raccogliere almeno due sezioni su ogni diapositiva. Le sezioni muscolari si attaccano e si scongelano automaticamente al contatto dello scivolo di vetro caldo. Rimuovere la diapositiva e tenerla a RT.
3. Lasciare asciugare le sezioni almeno 20 min a RT in un ambiente ventilato.
4. Conservare le criosezioni su vetrini di vetro a -80 gradi centigradi fino all'uso.

4. Immunolabelling

1. Scongelare i vetrini a RT per almeno 15 min in un ambiente ventilato.
2. Delineare l'area delle sezioni con una penna idrofobica. Lasciare asciugare la barriera idrofobica.
3. Fissare il tessuto con 2% paraformaldeide per 10 min in una camera umida.
4. Lavare le sezioni con fosfato tampone salina (PBS) 2x per 5 min ciascuno.
5. Bloccare le sezioni muscolari con il siero di capra del 10% diluito in PBS per 1 h a RT in una camera umida.
6. Incubare le sezioni per 2 h a RT (o pernottamento a 4 gradi centigradi) in una camera umida con gli anticorpi primari diluiti nel 5% del siero di capra. Per una semplice etichettatura di assorbimento IgG in miofibre, incuba solo sezioni con anticorpo di coniglio per la pan-lamininina del topo.
   NOTA: Altri antigeni della matrice extracellulare possono essere mirati purché forniscano una chiara etichettatura della matrice extracellulare circostante delle mionine. I marcatori per la rigenerazione muscolare, l'infiammazione o altri parametri possono essere combinati finché gli anticorpi non sono sollevati in un ospite di topi. Il microscopio utilizzato per l'analisi deve includere un colore di fluorescenza supplementare.
7. Lavare le sezioni con PBS 3x per 5 min ciascuna.
8. Incubare le sezioni con anticorpo secondario policlonale capra fluorescente rosso al coniglio IgG H&L e all'anticorpo secondario policlonale fluorescente verde per topo IgG H&L. Incubare a RT per 45 min in una camera umida.
9. Lavare con PBS 3x per 10 min ciascuno.
10. Montare le sezioni in un supporto di montaggio fluorescente contenente 100 ng/mL 4,6-diamidino-2-fenilondole (DAPI) e coprire ogni vetrino con un coverslip.
11. Lasciare asciugare durante la notte a 4 gradi centigradi prima dell'imaging.

Risultati

Le miofibre sono circondate da una matrice extracellulare contenente laminina. La colorazione rossa delimita la periferia delle miofibre e ne consente l'identificazione. IgG è mostrato in verde. I nuclei sono macchiati con DAPI e si trovano blu al microscopio. Tuttavia, i nuclei sono mostrati in bianco qui (Figura 1). Una debole immunoreattività IgG è prevista nel compartimento extracellulare, che può essere aumentata in caso di infiammazione. La colorazi...

Discussione

La necrosi della miofibra è una conseguenza comune dell'esercizio traumatico nei muscoli normali. È ben compensato da una potente capacità rigenerativa dei progenitori muscolari locali. Tuttavia, in diverse condizioni muscolari come nelle MD, la capacità rigenerativa delle cellule satellitari è compromessa dalla miocrosi cronica e dall'eccessiva fibrosi. Recenti scoperte mostrano che le fibre muscolari possono morire per necroptosi, una forma regolamentata di necrosi. Più specificamente, l'inibizione della necropto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C