근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

요약

여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.

초록

근육 섬유의 괴사 (myonecrosis)는 근육 이영양증을 포함한 여러 근육 조건의 발병 기전에서 중심적인 역할을합니다. 근 위축병발생의 원인을 해결하는 치료 옵션은 근육 변성을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 생검에서 세포 사멸 정도를 분석하고 정량화하는 방법이 필요하다. 종래의 방법은 장소에서 근섬유 변성을 관찰하는 것이 양적 또는 필수 염료의 주입에 의존한다. 본 문서에서, 면역형광 프로토콜은 myofibers에 의한 면역글로불린 G(IgG) 섭취량을 표적으로 하여 괴사 된 myofibers를 염색하는 것을 기술한다. IgG 섭취 방법은 1) 손상 관련 분자 패턴의 방출과 함께 혈장 막 무결성의 손실 및 2) 혈장 단백질의 섭취를 포함하여 괴사 멸망을 특징짓는 세포 특징을 기반으로 한다. 뮤린 단면에서, myofibers, 세포외 매트릭스 단백질 및 마우스 IgG의 공동 면역 표지는 괴사 운명과 myofibers의 깨끗하고 간단한 식별을 허용합니다. 이 간단한 방법은 정량 분석에 적합하고 인간 샘플을 포함한 모든 종에 적용 가능하며, 필수 염료의 주입을 필요로하지 않는다. IgG 섭취량에 의한 괴사 성 myofibers의 염색은 또한 다른 공동 면역 라벨링과 결합 될 수 있습니다.

서문

줄무늬 골격근은 주로 특징적인 자발적 수축 기능을 담당하는 근육 섬유 (myofibers)로 구성됩니다. 이 세포는 수축 도중 일어나는 기계적인 응고를 지원하는 다중 핵화, 포스트 유사분열 구조물입니다. 근섬유소막(사르콜엠마)과 세포외 매트릭스의 구조적 안정성은 조직 항상성에 매우 중요합니다. 위성 세포는 성숙한 골격 근에서 주요 근육 전구 집단을 구성하고 건강한 근육에서 정지 상태에 존재한다. myofiber 죽음 다음, 근육 재생은 궁극적으로 새로운 다핵근 화파이버를 형성하기 위해 위성 세포 활성화, 증식, 분화 및 융합을 포함하는 myogenic 프로그램을 따르는 위성 세포에 의해 지원됩니다.

Myofiber demise는 기계적 외상, 허혈 재관류 상해, 또는 근육 이영양증을 포함하는 다중 근육 조건에서 생길 수 있고, 죽은 세포의 괴사 형태와 연관된다^1,2. 괴사염은 혈장막의 급속한 투과성 및 세포외 구획내의 세포 함량의 방출을 특징으로^{한다 3.} 그것은 적절한 세포 신호 (즉, 우발적 인 괴사) 또는 오케스트레이션 된 세포 내 통로 (즉, 조절 된 괴사)를 포함하는 관계가없는 과정중 하나에서 발생할 수 있습니다. myofibers에서, 규제⁴ 및 관계가 없는⁵ 프로세스 는 괴사로 이어질 수 있습니다. 근위병의 전형적인 결과는 손상 관련 분자 패턴의 방출이며, 강력한 염증^반응을활성화6. 대식세포의 존재는 부상⁷다음 약 48 시간 및 72 시간에서 관찰된다. 괴사 파편의 정리에 있는 그들의 역할 이외에, 그(것)들은 또한 근육 재생에 중요합니다^8,9.

근 위축증 (MDs)은 종종 사르콜렘 구조의 결함으로 인한 이질적인 병리학 그룹입니다. Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 전 세계 3,500명의 남성 출생 중 대략^1에영향을 미치는 청소년 X 연결된 질병이고, sarcolemma에 dystrophin 표현의 부재에 기인합니다. DMD 소년에서 근육 조직의 만성 변성 극단적인 근육 약점 및 초기 사망에 이르게. 괴사에 의한 염증은 세포 독성을 향상시키고 근육 섬유증및 근육 기능의 상실을 촉진한다^11,12. 유전자 치료와 같은 근육 퇴행성 질환의 뿌리를 대상으로 하는 임상 시험에서 현재 치료는 근위대증을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 변성을 정확하게 정량화하는 간단한 기술이 필요합니다.

생체 내에서 근섬유 손실을 모니터링하기 위해 여러 가지 방법이 일상적으로 사용됩니다. 혈액내 크레아틴 키나아제(CK)의 효소 활성을 측정하면 근육과 심장 조직에서 지속적인 괴사의 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다. 이 시장에서 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색은 변성 재생 재생을 평가하기 위해 현재 진단에 사용되는 가장 인기 있는 방법입니다. 그러나, 죽은 세포의 H&E 라벨링의 분자 기초는 불분명남아 있습니다. 또한 H&E 염색에서 myofiber 죽음을 암시하는 색상 수정은 상대적으로 미묘하며 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량화를 용이하게하지 않습니다. DNA 단편화를 밝히는 방법, 예: 말단 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL), 불완전 라벨 괴사^3. 그(것)들은 또한 myofibers와 같은 동기화한 세포의 죽음을 감시하기 위하여 제대로 적응됩니다. Evan의 청색 염료 (EBD)와 같은 중요한 염료의 주입은 사르콜렘의 무결성을 잃은 근섬유를 평가하기위한 유용한 대안을 나타내지만 일부 실험 프로토콜에서 반드시 편리하지는 않습니다. 예를 들면, 혈액 샘플에 있는 EBD의 존재는 CK 측정, colorimetric 분석결과의 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, EBD의 세포 내 섭취는 공동 면역 라벨링을 어렵게 만듭니다. 따라서 괴사를 겪고있는 myofibers의 직접 라벨링을 허용하는 대체 방법이 흥미 로고입니다.

중요한 염료의 작용 메커니즘은 괴사 성 myofibers의 플라즈마 막 무결성의 손실과 주입 된 염료의 수동 적인 섭취에 의존합니다. 유사하게, 괴사성 근섬유는 알부민과 같은 혈액 단백질을 섭취하며, 이는 EBD가 강한 친화성을 가지는^13,14,면역글로불린 G(IgG) 및 IgM^15이다. 따라서 myofibers 내의 혈액 단백질의 이상한 존재는 구내에서 근위대근에 대한 편리한 마커를 나타냅니다. 이 단백질을 염색하는 것은 중요한 염료의 사용을 위한 대안이 될 수 있습니다.

IgG 섭취량을 중계근의 마커로 사용하여, 이 프로토콜은 mdx 디스트로핀 결핍 마우스의 경골 전방(TA)에서 근육 변성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 대체 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다: 1) 실행시 재현가능하고 간단합니다. 2) 순환하는 필수 염료의 주입과 같은 근육 수집 전에 어떠한 동물 치료도 필요하지 않으며, 3) 임의의 통상적인 면역라벨링으로서, 공동 라벨링과 호환된다.

프로토콜

실험은 프랑스 및 유럽 공동체 법규(라이센스 번호 11-00010)에 따라 수행되었습니다.

1. 트라가칸스 잇몸 준비

1. 유리 비커에 100 mL의 탈이온수에 트라가칸스 분말 6 g을 녹입니다. 호일로 덮고 적어도 3 시간 동안 방치하십시오. 혼합물이 점성이 빠르게 됨에 따라 금속 주걱으로 수동으로 저어줍니다.
2. 트라가칸스 혼합물을 수조 나 오븐에서 하룻밤 동안 60 °C에서 둡니다. 건조를 피하기 위해 비커를 조심스럽게 밀봉하십시오. 알리쿼팅하기 전에 적어도 한 번 저어주세요.
3. 알리쿼트 및 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.

2. 근육 수집

참고: 이 실험을 위해, 4주 된 남성 mdx 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 희생되었습니다. 이 절차는 마취를 필요로하지 않으며 현지 법률에 따라 인도적 살인 방법입니다.

1. 경골 전방의 해부 (TA) 근육
   1. 마우스 다리를 면도 한 후 마우스를 등에 놓고 바늘로 코르크 보드에 발을 고정하십시오. 정밀 가위 (또는 메스)와 집게를 사용하여 발에서 무릎까지 다리 피부를 제거하여 경골과 TA의 전체 길이를 노출시하십시오.
   2. 가위로 경골과 TA 를 절개하십시오. 이것은 뼈에서 TA의 분리를 용이하게하고 에피미슘에 쉽게 그립을 제공 할 것입니다. 정밀 집게를 사용하여 TA 표면에서 상피 층을 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 이 단계에서 TA는 건조에 더 취약할 수 있으며, 이를 피해야 합니다.
   3. 발목 부위에서 TA 힘줄을 집게로 다른 힘줄과 분리합니다. TA 힘줄을 부드럽게 당겨 경골과 주변 근육에서 분리하십시오.
   4. TA 배가 완전히 분리되면, TA 근육의 근위 부분만 무릎에 부착되도록 힘줄을 들어 오섭을 잡으하십시오. 무릎 뼈에 가능한 한 가까운 근위 힘줄을 부드럽게 끊습니다.
   5. 근육을 동결하기 전에 건조를 피하기 위해 식염수로 가볍게 감쇠 된 거즈에 TA를 놓습니다.
2. 플라스틱 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 비에 있는 이소펜탄의 프리 쿨링 70-100 mL은 부분적으로 액체 질소에 담그고. 비커 의 바닥에있는 이스펜타인이 흰색 고체가 될 때까지 식힙니다.
3. 코르크 (20mm x 11mm x 8mm)의 원형 조각에 ~ 0.5 mL의 트라가칸스 껌을 놓습니다. 생검이 동결 단계 후에 제대로 확인될 수 있도록 조심스럽게 코르크의 다른 쪽에 라벨을 붙입니다.
4. 집게, 원위 힘줄로 잇몸에 TA를 포함. 근육의 적절한 단면을 허용하려면 코르크 표면에 수직으로 축을 가진 근육을 잡으하십시오. 생검이 잇몸에 완전히 내장되지 않으면 저온 절의 품질이 향상됩니다. TA (힘줄 측)의 적어도 절반이 잇몸에 의해 드러나도록 하십시오.
5. 빨리 고정되지 않은, 차가운 isopentane 층에 내장 된 근육코르크를 찍어. 코르크는 액체 isopentane에 떠있을 것입니다. 근육을 이소펜타인으로 담그어야 하므로 샘플을 거꾸로 잡으하십시오. 샘플을 이소펜타인에 약 2분 간 두어 완전한 동결을 허용합니다.
   참고: 이 단계에서 TA는 냉동 된 때까지 동결 된 상태로 유지되어야합니다. -80°C 냉동고에 장기간 보관하기 전에 근육을 드라이 아이스에 보관하십시오.

3. 냉동 부속

1. 저온 온도를 -25°C로 설정합니다. 물체 온도를 -20 °C 정도유지하십시오. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물을 사용하여 저온 중지에 물체를 고정합니다. 근육 배에 도달 할 때까지 근육을 손질 한 다음 7-10 μm 섹션을 잘라.
   참고: 물체 온도의 안정화에는 최소 10분이 필요합니다.
2. 실온(RT)에서 저온 절을 수집하는 데 사용되는 유리 슬라이드를 보관하십시오. 각 슬라이드에 두 개 이상의 섹션을 수집합니다. 근육 섹션은 따뜻한 유리 슬라이드의 접촉시 자동으로 달라붙어 해동됩니다. 슬라이드를 제거하고 RT에 보관합니다.
3. 환기 가식 있는 환경에서 RT에서 섹션이 적어도 20분 동안 건조되도록 하십시오.
4. 사용 전까지 유리 슬라이드에 냉동 절을 -80°C로 보관하십시오.

4. 면역 라벨링

1. 환기 환경에서 RT에서 15분 이상 슬라이드를 해동합니다.
2. 소수성 펜으로 섹션 영역을 묘사합니다. 소수성 장벽이 건조되도록 하십시오.
3. 습한 챔버에서 10 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드로 조직을 고정하십시오.
4. 인산염 완충 식염수(PBS) 2x로 각 부분을 5분 동안 세척합니다.
5. 습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 희석 된 10 % 염소 혈청으로 근육 섹션을 차단하십시오.
6. 5% 염소 혈청에서 희석된 1차 항체를 가진 습한 챔버에서 RT(또는 4°C에서 하룻밤)에서 2시간 동안 섹션을 배양한다. myofibers에 간단한 IgG 섭취 라벨링의 경우, 토끼 항체가 있는 부분만 을 마우스 팬-라미닌에 배양합니다.
   참고: 세포외 기질의 다른 항원들은 근섬유의 주변 세포외 기질에 대한 명확한 라벨링을 제공하는 한 표적으로 삼을 수 있다. 근육 재생, 염증 또는 다른 파라미터에 대한 마커는 항체가 마우스 숙주에서 제기되지 않는 한 결합될 수 있다. 분석에 사용되는 현미경은 보충 형광 색상을 포함해야 한다.
7. 각각 5분 동안 PBS 3x로 섹션을 세척합니다.
8. 붉은 형광 염소 폴리 클론 이차 항체를 토끼 IgG H&L 및 녹색 형광 염소 폴리 클로날 이차 항체로 섹션에 배양하여 습한 챔버에서 45 분 동안 RT에서 IgG H & L. 인큐베이터를 마우스로 배양합니다.
9. 각각 10분 동안 PBS 3x로 씻으소서.
10. 100 ng/mL 4′, 6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)를 포함하는 형광 장착 매체에 섹션을 장착하고 각 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다.
11. 이미징 전에 4°C에서 밤새 건조시키십시오.

결과

묘섬유는 라미닌 함유 세포외 기질로 둘러싸여 있습니다. 붉은 얼룩은 근섬유 주변을 제한하고 식별을 허용합니다. IgG는 녹색으로 표시됩니다. 핵은 DAPI로 염색되고 현미경의 밑에 파란 찾아낸다. 그러나 핵은 여기에 흰색으로표시됩니다(그림 1). 약한 IgG 면역 반응성은 염증의 경우에 증가될 수 있는 세포외 구획에서 예상됩니다. 근섬유 내의 녹색 ?...

토론

Myofiber 괴사는 정상적인 근육에서 외상성 운동의 일반적인 결과입니다. 그것은 잘 로컬 근육 선조의 강력한 재생 능력에 의해 보상. 그러나, 여러 근육 조건에서 MDs에서, 위성 세포의 재생 용량 만성 근조와 과도 한 섬유 증에 의해 손상. 최근 연구 결과에 따르면 근육 섬유는 괴사의 규제 형태인 necroptosis에 의해 죽을 수 있습니다. 보다 구체적으로, necroptosis의 억제는 DMD 처리를 위한 새로운 치료 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C