تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف

Summary

توضح هذه المقالة طريقه للتعرف علي التعديلات النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من مريض معين. علي الرغم من ان التجارب الموصوفة هنا تركز علي نوع معين من الورم ، والنهج ينطبق علي نطاق واسع علي الأورام الصلبة الأخرى.

Abstract

يعتبر تقييم التغاير داخل الفم (ITH) أمرا بالغ الاهميه لاستباق فشل العلاجات المستهدفة وتصميم استراتيجيات فعاله لمكافحه الورم وفقا لذلك. علي الرغم من ان تثار المخاوف في كثير من الأحيان بسبب الاختلافات في معالجه العينات وعمق التغطية ، فان تسلسل الجيل التالي من الأورام الصلبة قد كشف درجه متغيرة للغاية من ITH عبر أنواع الأورام. الاستيلاء علي اليتيح ترابط الجينية بين آلافات الاوليه والمنتشرة من خلال تحديد السكان الذين لديهم كلنال وتحت الترقوة أمر حاسم لتصميم العلاجات للامراض مرحله متقدمة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي وsubclonal بين عينات مختلفه من نفس المريض. ويدمج النهج التجريبي الموصوف هنا ثلاثه نهج راسخة: التحليل النسيجي ، والتغطية العالية متعددة آلافات ، وتحليلات الإيمونوفينوتيبيك. من أجل تقليل الآثار علي الكشف عن الاحداث subclonal عن طريق معالجه عينه غير لائقه ، ونحن إخضاع الانسجه للفحص المرضي الدقيق وإثراء الخلايا الأورام. وخضع الحمض النووي المضبوط من آلافات السرطانية والانسجه الطبيعية لدرجه عاليه من التغطية ، مستهدفا مناطق الترميز من 409 جينات السرطان ذات الصلة. وفي حين انه لا ينظر الا إلى مساحة محدوده من الجينوم ، فان نهجنا يمكن من تقييم مدي التباين بين التغيرات الجسدية (طفرات أحاديه النوكليوتيد والتغيرات في عدد النسخ) في آفات متميزة من مريض معين. ومن خلال التحليل المقارن لبيانات التسلسل ، تمكنا من التمييز بين التعديلات القابلة للتغيير. غالبا ما ينسب معظم ITH إلى طفرات الركاب; لذلك ، استخدمنا أيضا مناعي للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتحولات. وفي حين ان هذا البروتوكول قد طبق علي نوع معين من الأورام ، فاننا نتوقع ان المنهجية الموصوفة هنا تنطبق علي نطاق واسع علي أنواع أخرى من الأورام الصلبة.

Introduction

وقد أحدث ظهور تسلسل الجيل القادم (خ ع) ثوره في طريقه تشخيص السرطان وعلاجه¹. وقد كشفت السلسلة المتعددة التخصصات المرتبطة بالتسلسل الإقليمي بدرجه عاليه من عدم التجانس داخل الفم (ITH) في الأورام الصلبة²، وهو ما يفسر جزئيا فشل العلاج المستهدف بسبب وجود المستنسخين مع حساسية المخدرات المختلفة² . ومن التحديات الهامه التي تطرحها دراسات التسلسل علي نطاق الجينوم ضرورة التمييز بين الركاب (اي المحايدين) وطفرات السائقين في السرطانات الفردية³. وقد أظهرت العديد من الدراسات في الواقع ان, في بعض الأورام, الطفرات الركاب حساب معظم ITH, بينما التعديلات سائق تميل إلى ان تكون محفوظه بين آفات من نفس الفرد⁴. ومن المهم أيضا ان نلاحظ ان العبء الكبير علي الخلايا الدودية (كما هو الحال في سرطانات الرئة والورم الميلاني) لا يعني بالضرورة عبئا^{كبيرا علي}الكائن الدودي الثلاثي. ولذلك ، يمكن العثور علي درجه عاليه من ITH في الأورام مع عبء منخفض الدودية.

الانبثاث هي المسؤولة عن أكثر من 90 ٪ من الوفاات المرتبطة بالسرطان في جميع انحاء العالم⁵؛ ولذلك ، فان التقاط التغاير المتعدد لجينات السائق بين آلافات الاوليه والمنتشرة أمر بالغ الاهميه لتصميم علاجات فعاله للامراض المتقدمة المرحلة. يتم اجراء التسلسل السريري بشكل عام علي الأحماض النووية من الانسجه الثابتة ، مما يجعل الاستكشاف علي نطاق الجينوم صعبا بسبب جوده الحمض النووي الرديءه. ومن ناحية أخرى ، فان الهدف من التسلسل السريري هو تحديد الطفرات القابلة للتنفيذ و/أو الطفرات التي قد تتنبا بالاستجابة/عدم الاستجابة لنظام علاجي معين. وكما هو الوضع ، يمكن ان يقتصر التسلسل علي جزء أصغر من الجينوم لاستخراج المعلومات ذات الصلة سريريا في الوقت المناسب. وقد ادي الانتقال من تنميط الحمض النووي منخفض الانتاجيه (علي سبيل المثال ، تسلسل Sanger) إلى خ ع و إلى تحليل المئات من الجينات ذات الصلة بالسرطان بدرجه عاليه من التغطية ، مما يسمح بالكشف عن الاحداث تحت الترقوة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من نفس الفرد. وتدمج الطريقة الموصوفة هنا ثلاثه نهج راسخة (تحليل نسيجي ، وتسلسل عالي التغطية متعدد آلافات ، وتحليلات إيمونوفينوتيبيك) للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتغيرات التي تم تحديدها. ويرد وصف للنهج في الشكل 1 وتم تطبيقه علي دراسة 5 حالات منتشرة من الأورام الخبيثة الكاذبة (spns) من البنكرياس. في حين اننا وصف معالجه وتحليل formalin-الثابتة البارافين-العينات النسيجية المضمنة (FFPE) ، يمكن تطبيق نفس الاجراء علي المواد الوراثية من الانسجه الطازجة المجمدة.

Protocol

وقد جمعت المواد المستخدمة في الدراسة ببموجب بروتوكول محدد وافقت عليه لجنه الأخلاقيات المحلية. وكانت الموافقة المستنيرة الخطية من جميع المرضي متاحه.

1. النسيجية والإيمونوفينوتيبيكال مراجعه عينات الانسجه

ملاحظه: الطبيب الخبير هو المسؤول عن الانشطه الموصوفة أدناه.

1. المراجعة التشخيصية للحالات المختارة وفقا لمعايير التشخيص الراسخة.
   1. استخدام ميكروتومي لقطع 4 − 5 ميكرون أقسام الانسجه السميكة من كتل الانسجه FFPE ممثل وتحميل الأقسام علي الشرائح القياسية الانسجه.
   2. قم باجراء تلطيخ الدم واليوزين لكل شريحة باستخدام الشرائحالنسيجية اليه (جدول المواد).
   3. مراجعه التشخيص التشريحي لحالات الورم المختارة وفقا لمعايير التشخيص الخاصة بمنظمه الصحة الخاصة.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، قد يتعرف الطبيب الشرعي علي مناطق متميزة من الورم داخل نفس قسم الانسجه. ومن الممكن حصاد هذه المناطق بصوره منفصلة (انظر الفرع 2). ويرد التشابه النسيجي من الورم والخلايا العادية ل SPNs في الشكل 2.
   4. أداء تلطيخ مناعي للعلامات الراسخة لتكمله التحليل النسيجي وتقدير إيمونوفينوتيبيك تغاير.
      ملاحظه: قد يحدد اختصاصي الامراض إيمونوفينوتيبيكالي مناطق متميزة من الورم داخل نفس قسم الانسجه. ومن الممكن حصاد هذه المناطق بصوره منفصلة (انظر الفرع 2).
2. تقييم الأورام الورمية الورم من قسم الانسجه السرطانية وخطه التشريح المجهري اليدوي وفقا لذلك.
   ملاحظه: هذا هو تقدير توليد الامراض السرطانية الورم.
   1. إذا كان محتوي الخلية الورم من القسم الانسجه اعلي من 70 ٪ ، والتشريح المجهري اليدوي ليس إلزاميا. الانتقال مباشره إلى الخطوة 3.1.
      ملاحظه: الهدف 70 ٪ من محتوي الخلايا النيوبلاستيك من أجل (ط) ضمان الحساسية الكافية لتقديرات تردد اليل المتحولة و (2) للتحقق من صحة الطفرات التي قد تكون اقل حساسية (مثل التسلسل الشعري).
   2. إذا كان محتوي الخلية الورم من القسم الانسجه اقل من 70 ٪ ، والتشريح المجهري ضروري والانتقال إلى الخطوة 2.
3. تقييم أقسام الانسجه من كتله FFPE حيث تم أخذ عينات من الانسجه غير النيوبلاستيك. ويستخدم هذا النسيج كمصدر للحمض النووي جرثومي.
   ملاحظه: الدم هو مصدر بديل للحمض النووي جرثومي. في هذه الحالة ، المضي قدما في استخراج الحمض النووي علي النحو الموصي به في ملاحظه الخطوة 4.1.
   1. إذا كانت الانسجه غير الأورام الغير مرئية فقط في قسم الانسجه (الشكل 2D) ، لا حاجه إلى التشريح المجهري اليدوي ؛ الانتقال مباشره إلى الخطوة 3.1.
   2. إذا كان التلوث الكبير من خلايا الأورام موجودا في قسم الانسجه ، فان التشريح المجهري اليدوي ضروري ؛ الانتقال إلى القسم 2.

2. دليل التشريح المجهري

ملاحظه: هذا الأسلوب ينطبق علي أنواع مختلفه من الأورام الصلبة ، ويهدف إلى زيادة محتوي الخلايا الأورام من العينات الانسجه. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لحصاد المناطق المتميزة والإيمونوفينوتيبيكاليه داخل نفس قسم الانسجه.

1. باستخدام ميكروتومي ، وقطع ما يصل إلى عشره 4 − 6 ميكرون سميكه FFPE الانسجه الأورام المقاطع وتركيبها علي الشرائح غير المشحونة.
   ملاحظه: إذا كان واحد فقط 1 مم² عش من خلايا السرطان مرئية في العينة ، يجب قطع 10 الشرائح الانسجه وتخضع لتشريح المجهرية اليدوي من أجل الحصول علي كميه المستهدفة من الحمض النووي (40 ng) ؛ هذا علي افتراض ان 1 مم² الكتلة يحتوي بين 700 و 1000 نوى الورم.
2. احتضان الشرائح في 60 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
3. وضع الشرائح في رف ، وتنفيذ يغسل التالية: اكسيلين لمده 20 دقيقه ، 100 ٪ الايثانول لمده 10 دقيقه ، 80 ٪ الايثانول لمده 10 دقيقه ، 70 ٪ الايثانول لمده 10 دقيقه ، الماء المقطر لمده 1 دقيقه ، الهيلوكسيلين مضاد للبقع ل 10 ثانيه ، ماء الصنبور لمده 1 دقيقه.
4. علي المجهر المقلوب القياسية ، استخدم ابره 27 G علي حقنه كاداه التشريح المجهري وجمع مجموعات تمثيليه من الخلايا السرطانية. حصاد ما لا يقل عن عشره 1 مم² مجموعات من الخلايا لضمان الكمية المطلوبة من الحمض النووي للتسلسل.
   ملاحظه: إذا كان المقصود من المناطق المتميزة شكليا ليتم تحليلها ككيانات مختلفه ، ثم استخدام أداه التشريح المجهري لحصاد تلك المناطق بشكل منفصل.
5. وضع مجموعات الحصاد في أنابيب 1.5 mL (جدول المواد) شغل سابقا مع 20 μl من البروتياز K و 180 μl من تحلل العازلة (جدول المواد، سواء المدرجة في مجموعه استخراج الحمض النووي) وتخلط من قبل vortexing.

3. معالجه الانسجه دون التشريح المجهري السابق

ملاحظه: يتم استخدام هذا الاجراء لكتل الانسجه التي تحتوي علي خلايا غير الأورام فقط (مصدر الحمض النووي جرثومي) أو تحتوي علي ما لا يقل عن 70 ٪ من الخلايا السرطانية متجانسة شكليا.

1. باستخدام ميكروتومي قطع ما يصل إلى سته 4 − 5 ميكرون أقسام الانسجه السميكة من كتل الانسجه FFPE مختاره. وضع مخطوطات الانسجه في أنابيب 1.5 mL كما هو موضح في الخطوة 2.5.

4. استخراج الحمض النووي من الخلايا الطبيعية والأورام

1. تنقيه الحمض النووي من الانسجه الطبيعية والأورام الورمية باستخدام الحمض النووي FFPE مجموعه استخراج الانسجه (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: عندما يتم استخدام الدم كمصدر للحمض النووي جرثومي ، تنقيه الحمض النووي باستخدام مجموعه استخراج الدم الحمض النووي (جدول المواد).
2. التحديد الكمي للحمض النووي وفحص الجودة
   1. للقياس الكمي لكميه التقطع بين اليدين (dsDNA) ، أضف مكونا من عينه الحمض النووي إلى محلول يحتوي علي لطخه من الحمض النووي الفلوري (جدول المواد) وقياس الفلورية المنبعثة باستخدام مقياس فلومتر (جدول المواد ).
      ملاحظه: يقيس الفحص شده الاشاره الفلورية المنبعثة من الاصباغ الفلورية المرفقة ب dsDNA ويحدد كميه الحمض النووي باستخدام منحني قياسي.
   2. استخدام مقياس الطيف الطيفي (جدول المواد) لقياس 260/280 و 260/230 نسب العينة من أجل تاهيل الحمض النووي. يجب ان يكون الحمض النووي "النقي" 260/280 من 1.8 و 260/230 في نطاق 1.8 − 2.2.
      ملاحظه: يهدف التقييم الطيفي للعينه إلى إثبات وجود الملوثات الكيميائية (مثل الفينول) التي تؤثر علي ردود الفعل المصب. في حاله التلوث الناجم عن الكواشف الكيميائية ، قم باجراء خطوه تنظيف باستخدام مجموعه مستنده إلى عمود.

5-اعداد المكتبات وتقديرها كميا

ملاحظه: يرد في الشكل 3المخطط التخطيطي لاعداد المكتبة وخطوات القياس الكمي.

1. اعداد مكتبه الحمض النووي (4 برك التمهيدي اعداد لكل عينه)
   ملاحظه: تجمعات التمهيدي 4 تنتمي إلى لوحه السرطان المبلغ عنها فيجدول المواد. كل تجمع يحتوي علي أزواج التمهيدي التي تم تصميمها لاختيار الهدف المعدد من 409 الجينات. ويرد رابط إلى قائمه الجينات التي تتالف منها اللجنة فيجدول المواد.
   1. اعداد أربعه ردود فعل التضخيم الهدف الحمض النووي لكل عينه ، واحده لكل تجمع التمهيدي. لكل تجمعالتمهيدي (جدول المواد) ، أضافه في أنبوب 0.2 ML (جدول المواد): 4 μl من مزيج سيد (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) ، و 10 μl من الدقة عاليه مزيج تجمع التمهيدي (جدول المواد، وشملت في مكتبه السرطان اللوحة) ، و 6 μL من الحمض النووي (10 نانوغرام المجموع).
   2. تضخيم المناطق المستهدفة من كل تجمع التمهيدي بشكل منفصل في أربعه أنابيب 1.5 mL تشغيل البرنامج التالي: عقد في 99 درجه مئوية لمده 2 دقيقه (تفعيل البلمره الساخنة بدء) ، 16 دورات (دياتورا في 99 درجه مئوية ل 15 ثانيه ، اننيل وتمتد في 60 درجه مئوية لمده 8 دقائق) ، امسك عند 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: نقطه التوقف. تخزين ردود فعل التضخيم الهدف في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها أو عند-20 درجه مئوية لفتره أطول.
   3. الهضم الجزئي للرموز التي تنتهي
      ملاحظه: الدليل المقدم من قبل مجموعه الشركة المصنعة خ ع و تتوقع خطوه التي يتم الجمع بين ردود الفعل التضخيم مختلفه من كل عينه قبل الهضم الجزئي. تجنب هذه الخطوة والحفاظ علي معالجه كل التضخيم الهضم بشكل منفصل.
      1. أضافه 2 μL من مزيج الهضم محدده (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) لكل تجمع تضخيم كل عينه (الحجم الإجمالي لكل أنبوب 0.2 mL هو 22 μl). دوامه جيدا والطرد المركزي كل أنبوب لجمع قطرات.
      2. تحميل الأنابيب في الدورية الحرارية وتشغيل البرنامج التالي: 50 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، 55 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، 60 درجه مئوية لمده 20 دقيقه ، 10 درجه مئوية عقد (لمده تصل إلى 1 ساعة).
         ملاحظه: نقطه التوقف. تخزين لوحه في-20 درجه مئوية لفترات أطول.
   4. محولات ligate إلى الرموز وتنقيه.
      ملاحظه: استخدام محول الباركود مختلفه لكل نموذج عند تسلسل مكتبات متعددة علي شريحة واحده. جميع ردود الفعل التضخيم الاربعه من نفس العينة يجب ان تتلقي نفس الباركود.
      1. اعدادالمحولات (جدول المواد ، مجموعه محولاتالباركود). لكل الباركود X ، اعداد مزيج من محول P1 ومحولات الباركود فريدة من نوعها (جدول المواد) في التخفيف النهائي من 1:4. مزيج 4 μL من الماء مع 2 μL من محول P1 و 2 μL من محولات الباركود فريدة من نوعها. استخدام 2 μL من هذا المزيج محول الباركود للممرات المصب.
      2. تنفيذ رد الفعل ربط عن طريق أضافه إلى كل تجمع تضخيم كل عينه في هذا الترتيب: 4 μl من الحل التبديل (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) ، 2 μl من مزيج محول الباركود و 2 μl من الحمض النووي يغاز (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) (الحجم الإجمالي = 30 μL).
      3. دوامه الطرد المركزي بدقه ولفتره وجيزة لجمع قطرات.
      4. تحميل كل أنبوب في الدورية الحرارية وتشغيل البرنامج التالي: 22 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، 68 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، 4 درجه مئوية عقد (لمده تصل إلى 24 ساعة).
         ملاحظه: نقطه التوقف. تخزين لوحه في-20 درجه مئوية لفترات أطول.
   5. تنقيه المكتبة وتضخيمها
      1. الطرد المركزي كل أنبوب ومن ثم نقل كل عينه المشفرة في أنبوب 1.5 mL. أضافه 45 μL من الخرز القائم علي تنقيه الكاشف (جدول المواد) إلى كل تجمع من كل عينه. Pipet صعودا وهبوطا 5x لخلط تعليق حبه مع الحمض النووي.
      2. احتضان الخليط لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT) ، ثم وضع كل أنبوب في رف المغناطيسي واحتضان لمده 2 دقيقه. أزاله بعناية وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه.
      3. أضافه في كل أنبوب 150 μL من الطازجة 70 ٪ الايثانول. غسل الخرز تتحرك كل أنبوب جنبا إلى جنب من الموقفين من المغناطيس. تجاهل ماده طافي والتفات إلى عدم إزعاج بيليه.
      4. كرر الإجراءات الموضحة في الخطوة 5.1.5.3 ومن ثم الحفاظ علي أنابيب في المغناطيس والهواء الجاف الخرز في RT لمده 5 دقائق.
      5. أزاله أنابيب مع المكتبات المنقية من كل تجمع التمهيدي من المغناطيس وأضافه 50 μL من عاليه الدقة PCR ميكس (جدول المواد) و 2 μl من التضخيم مكتبه مزيج التمهيدي (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) إلى الخرز بيليه من كل أنبوب.
      6. دوامه كل أنبوب 1.5 mL والطرد المركزي لفتره وجيزة لجمع قطرات.
      7. وضع أنابيب 1.5 ml في المغناطيس لمده 2 دقيقه ونقل بعناية ماده طافي (~ 50 μl) من كل أنبوب إلى أنبوب 0.2 ml جديده دون إزعاج بيليه.
      8. تضخيم المكتبات من كل تجمع التمهيدي تشغيل البرنامج التالي: عقد في 98 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لتنشيط الانزيم ، 5 دورات (ديتوري في 98 درجه مئوية ل 15 ثانيه ، اننيل وتمتد في 64 درجه مئوية 1 دقيقه) ، وعقد في 4 درجه مئوية. تخزين العينات في-20 درجه مئوية.
   6. تنقيه المكتبة المضخمة
      1. الطرد المركزي كل أنبوب لجمع محتويات في الجزء السفلي ونقل كل عينه مكتبه تضخيمها إلى أنبوب 1.5 mL.
      2. أضافه 25 μL من الخرز القائم علي تنقيه الكاشف. Pipet صعودا وهبوطا 5x لخلط تعليق حبه مع الحمض النووي.
      3. احتضان الخليط لمده 5 دقائق في RT ، ومن ثم وضع أنابيب في المغناطيس لمده 5 دقائق.
      4. نقل بعناية supernatant ، الذي يحتوي علي الرموز ، من كل أنبوب إلى أنابيب جديده دون إزعاج بيليه.
      5. أضافه 60 μl من الخرز القائم علي تنقيه كاشف إلى ماده طافي من كل أنبوب وماصه pipet-x صعودا وهبوطا من أجل مزيج التعليق حبه والحمض النووي.
      6. احتضان الخليط لمده 5 دقائق في RT ومن ثم وضع الأنابيب في المغناطيس لمده 3 دقائق.
      7. تجاهل ماده طافي من كل أنبوب والتفات إلى عدم إزعاج بيليه.
         ملاحظه: الرموز الموجودة منضمة إلى الخرز.
      8. أضافه في كل أنبوب 150 μL من الطازجة 70 ٪ الايثانول. غسل الخرز تتحرك الأنابيب جنبا إلى جنب في موقفين من المغناطيس. تجاهل ماده طافي والتفات إلى عدم إزعاج بيليه.
      9. كرر الاجراء في الخطوة 5.1.6.8 والهواء تجف الخرز في RT لمده 3 دقائق. تجنب الإفراط في تجفيف الخرز.
      10. أزاله الأنابيب من المغناطيس وأضافه 50 μL من انخفاض تريس أدتا (TE) (جدول المواد، وشملت في مجموعه المكتبة) إلى بيليه لتفريق الخرز.
      11. Pipet الخليط صعودا وهبوطا عده مرات واحتضان في RT لمده 2 دقيقه.
      12. وضع الأنابيب في المغناطيس لمده لا تقل عن 2 دقيقه ونقل بعناية supernatant ، الذي يحتوي علي الرموز ، إلى أنابيب جديده دون إزعاج الخرز.
2. التقدير الكمي للمكتبة
   1. استخدام أداه تحليل جزء (جدول المواد) لتشغيل رقاقه الحمض النووي وفقا لبروتوكول مجموعه الحمض النووي حساسية عاليه.

6. تجميع المكتبات وتسلسل التشغيل

1. تمييع كل مكتبه إلى 100 مساء مع المياه الخالية من النيوداز. الجمع بين 10 μL من كل مكتبات 100 pM لتشغيل واحد في أنبوب واحد. اخلط المكتبات المجمعة عن طريق التنضيد والانتقال إلى القولبة والتسلسل.
2. إنشاء التشغيل المخطط
   ملاحظه: تشغيل نموذجي يتضمن أربعه العينات التي يمكن تحميلها علي نوعين مختلفين من رقاقه أشباه الموصلات (أيون PI رقاقه أو أيون 540 رقاقه) استنادا إلى المنظم المتاحة في المختبر (أيون نظام بروتون أو GeneStudio S5 النظام ، جدول المواد). تنتج هذه الانظمه عاده 80,000,000 قراءه لكل تشغيل.
   1. افتح متصفح تورنت علي جهاز كمبيوتر متصل بنظام التسلسل (علي سبيل المثال ، نظام الشيف الأيوني) وخطط لتشغيل جديد باستخدام القالب العام للتطبيق المحدد.
   2. التبديل إلى علامة التبويب مجموعات من الخطة. اختر نظام البروتون الأيوني أو نظام genestudio S5 الأيوني من القائمة المنسدلة للاداه استنادا إلى نظام التسلسل المستخدم.
   3. اعتمادا علي نظام التسلسل ، حدد رقاقه المناسبة (PI رقاقه للانظمه أيون بروتون ؛ 540 رقاقه لأنظمه أيون جينديو S5) من رقاقه نوع القائمة المنسدلة.
   4. حدد مجموعه المكتبة 2.0 الخاصة ب Ion من القائمة المنسدلة مجموعه المكتبة .
   5. حدد زر الشيف أيون لمجموعه قالب ، ثم حدد مجموعه الشيف المناسبة (أيون Pi مرحبا-Q الشيف كيت لرقاقه PI أو أيون 540 كيت الشيف ل 540 رقاقه) من القائمة المنسدلة مجموعه قالب .
   6. حدد مجموعه التسلسل المناسبة (أيون PI مرحبا Q التسلسل 200 كيت لرقاقه PI أو أيون S5 التسلسل كيت ل 540 رقاقه) من القائمة المنسدلة عده التسلسل ، ثم حدد ionxpress من القائمة المنسدلة مجموعه الباركود.
   7. التبديل إلى علامة التبويب المساعد وحدد المساعد تحليل التغطية .
   8. قم بالتبديل إلى علامة التبويب خطه حدد الجينوم GRCh37/hg19 من القائمة المنسدلة مكتبه المراجع. من القائمة المنسدلة المناطق المستهدفة ، حدد اللوحة المناسبة لتكون متسلسلة.
   9. تعيين عدد الرموز الشريطية التي سيتم تسلسلها وتسميه أنابيب عينه المكتبة في الحقول المناسبة.
   10. قم بتعيين اسم الرمز الشريطي واسم النموذج لكل مكتبه.
3. مكتبات عينه التخفيف والتحميل.
   1. تمييع مكتبه الأوراق المالية مع المياه الخالية من النيوداز إلى 25 م لرقاقه PI أو 32 pM ل 540 رقاقه.
   2. Pipet 50 μL من كل مكتبه المخفف إلى الجزء السفلي من أنبوب عينه المكتبة المناسبة.
   3. قم بتشغيل نظام التسلسل واتبع التعليمات التي علي الشاشة لتحميل كافة الكواشف المطلوبة واستيراد خطه التشغيل.
   4. تحميل المكتبة نموذج أنبوب التي تحتوي علي المكتبات المجمعة وبدء برنامج التضخيم النسيلي.
      ملاحظه: نظام الشيف أيون يتطلب اثنين من رقائق ليتم اعدادها لكل تشغيل.
4. التسلسل علي أيون بروتون أو أيون جينديو S5.
   1. قم بتشغيل نظام التسلسل واتبع الإرشادات التي علي الشاشة لتهيئه التسلسل واستيراد خطه التشغيل.
   2. تحميل رقاقه التسلسل بعد ازالته من نظام التسلسل.
      ملاحظه: يجب ان ترتكز قبل التقاط رقاقه من أجل تجنب تلف رقاقه بسبب التفريغ الكهربائي. يتم الإبلاغ عن معالجه الرقاقة/تحديد المواقع مع أمثله علي التحميل الناجح/غير الناجح في الشكل 4.
   3. اغلق غطاء حجره الرقاقة وانتظر حتى يشير رمز حاله الرقاقة إلى "جاهز".
   4. إفراغ حاويه النفايات عند اكتمال الشوط الأول ، ثم تسلسل رقاقه المتبقية في أقرب وقت ممكن.

7-الطفرات وتحليل التغيرات في عدد النسخ (CNVs)

ملاحظه: يتم تنفيذ محاذاة بيانات التسلسل إلى الجينوم المرجعي البشري GRCh37/hg19 تلقائيا بمجرد تعيينها في الخطة (الخطوة 6.2.8).

1. استخدام الناتج المساعد تحليل التغطية (جدول المواد) للتحقق من عمق التغطية والتوحيد.
2. تنفيذ البديل الدعوة باستخدام البديل سيل المتصل المساعد (جدول المواد) ، وتحديد جرثومي أو سير العمل الجسدية حسب الاقتضاء.
3. تنزيل المتغيرات التي تمت تصفيتها ملفات تنسيق المكالمات المتغير (VCF). أضافه تعليقات توضيحيه باستخدام برنامج التنبؤ بتاثير المتغيرات (VEP)⁶ وقاعده بيانات Ncbi refseq.
4. تحميل البيانات التسلسل علي البرنامج مراسل أيون باستخدام المساعد القائم بالعمل الرافع واستخدام الأورام السرطانية الشاملة لوحه السرطان-العادية سير الزوج لتحليل البيانات من أجل تقدير cnvs.
5. تصفيه الطفرات يدويا و CNVs استنادا إلى الدرجات التي تم تعيينها من قبل البرنامج والتحقق منها بصريا مع عارض الجينوم التكاملي (IGV)⁷.
   1. بصريا فحص المحاذاة للقراءة غير عادية (بسبب ، علي سبيل المثال ، سوء فتيله ، تضخيم أو يقرا لينه لقطه) التي قد تولد المكالمات الحرفية.
   2. تحقق من CNVs عن طريق فحص التغطية التي تم تطبيعها لكافة الرموز المختلفة عبر جين معين مقابل التغطية التي تم تطبيعها للأساس.
      ملاحظه: هذا يساعد علي تصحيح المكالمات الكاذبة بسبب البرنامج تجزئه ، الذي يستدعي في بعض الأحيان CNV استنادا إلى تغطيه غير طبيعيه بشكل متناظر من عدد قليل من الرموز في نهاية جين واحد وفي بداية الجينات المتعاقبة.
6. فهرسه الطفرات الجسدية
   1. بالنسبة لكل حاله ، تستدعي طفرة المؤشر من تسلسل الانسجه العادية/الدم ، والورم الاولي ، والانبثاث.
   2. العلم كما جرثومي وتجاهل المكالمات التي هي أيضا واضحة من تسلسل البيانات من الحمض النووي جرثومي.
   3. العلم كما clonal/مؤسس الطفرات التي يتم تقاسمها بين جميع آلافات للمريض معين.
   4. العلم كما subclonal/التقدمي الطفرات التي يتم الكشف عنها في بعض ولكن ليس كل آلافات من مريض معين.

8. تحليل إيمونوفينوتيبيك: مناعي للتعبير عن البروتين ذات الصلة

ملاحظه: تم استخدام مناعي للتحقق من النتائج الوظيفية للتحولات التي لا تنشط في الجينات المثبطة للورم.

1. باستخدام ميكروتومي ، وقطع 3 − 4 ميكرون سميكه الانسجه FFPE المقاطع وتركيبها علي الشرائح المشحونة واحتضان الشرائح في 60 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
2. وضع الشرائح في رف ، وتنفيذ الخطوات التالية: اكسيلين لمده 10 دقيقه ، اكسيلين لمده 10 دقيقه ، 95 ٪ الايثانول ل 4 دقيقه ، 95 ٪ الايثانول ل 4 دقيقه ، 70 ٪ الايثانول لمده 4 دقائق ، 70 ٪ الايثانول لمده 4 دقائق ، الماء المقطر لمده 4 دقائق.
3. اجراء استرداد مستضد استنادا إلى اشاره من الشركات المصنعة للأجسام المضادة (جدول المواد).
   1. ضع الشرائح في رف مع حل استرداد مستضد معينه والدمج الفرعي في حمام مائي في درجات حرارة شبه الغليان.
   2. أزاله الشرائح من الحمام وتشغيل مياه الصنبور لتهدئه لمده 10 دقيقه.
4. وضع الشرائح في رف جديد مع 3 ٪ H₂O₂ في 1x تريس-مخزنه المالحة (TBS) لمده 20 دقيقه في RT من أجل عدم تنشيط بيروكسياسات الذاتية.
5. ضع الشرائح في رف جديد واغسل 3x مع TBS و 0.1 ٪ من توين 20 (TWEEN).
6. استخدام قلم PAP (جدول المواد) لرسم دائره مسعور حول الشرائح التي شنت الانسجه.
7. وضع الشرائح في غرفه الرطبة وتنفيذ حجب لمده 1 ساعة في RT باستخدام 5 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) في TBST كحل الحظر.
8. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الاوليه (جدول المواد) في غرفه رطبه بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. تمييع الأجسام المضادة الاساسيه مع حل الحجب علي النحو الموصي به.
9. ضع الشرائح في رف جديد واغسل 3x مع TBST.
10. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية المحددة (مكافحه الماوس أو المضادة للأرانب) (4 − 5 قطرات لشريحة 1) لمده 30 دقيقه في RT في غرفه الرطبة.
11. وضع الشرائح في رف جديد وغسل 3x مع TBST وبعد في الماء المقطر.
12. اعداد 3 ، 3 '-ديامينوبينزيديني (داب) حل تمييع 1 قطره في 1 مل من العازلة التخفيف (جدول المواد). احتضان الشرائح الحد الأقصى لمده 5 دقيقه التحقق تحت المجهر.
13. استخدام عنصر تحكم إيجابي لحساب وقت الحضانة باتباع تطور رد الفعل تحت المجهر.
    ملاحظه: كل الأجسام المضادة تحتاج إلى وقت حضانة محدد.
14. نقاره غير نشطه (توقف الكروجين هطول الامطار) من خلال دمج الشرائح في الماء المقطر.
15. الشرائح المضادة للبقع عن طريق دمجها في رف جديد مع الهيلوكسيلين لمده 10 ثانيه ثم يشطف بماء الصنبور.
16. وضع الشرائح في رف ، وتنفيذ الخطوات التالية: 70 ٪ الايثانول ل 4 دقيقه ، 70 ٪ الايثانول ل 4 دقيقه ، 95 ٪ الايثانول ل 4 دقائق ، 95 ٪ الايثانول لمده 4 دقائق ، اكسيلين لمده 10 دقيقه ، اكسيلين لمده 10 دقيقه.
17. ختم الشرائح وضع بضع قطرات من المتوسطة المتصاعدة (جدول المواد) علي كل شريحة الانسجه وتغطيه مع coverslip.
18. تطبيق الضغط علي كوفيرسليب من أجل تحريك الزائدة المتوسطة والهواء فقاعات بعيدا عن الانسجه والخروج من الشفتين والهواء الجاف.
19. تقييم وتسجيل نتائج تلطيخ تحت المجهر المقلوب مع خبير في علم الامراض.
    ملاحظه: سيعتمد نظام تسجيل النقاط علي المستضدات المحددة ، التي قد توجد بالفعل معلومات في الأدبيات. إذا كانت المعلومات غير متوفرة في الأدب ، اشتقاق نظام تسجيل النقاط باستخدام التعبير عن مستضد في الانسجه العادية كمرجع.

النتائج

ويوضح الشكل 1سير عمل الدراسة. آلافات المتعددة (ن = 13) التسلسل من 5 SPN الحالات التي تستهدف تسلسل الترميز من 409 الجينات المرتبطة بالسرطان حددت ما مجموعه 27 الطفرات الجسدية في 8 الجينات (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1و FGFR3). تم تعريف الطفرات كمؤسس/clon...

Discussion

طريقتنا تمكن من تحديد التعديلات الجزيئية التي تنطوي عليها تطور الأورام الصلبة من خلال دمج البيانات الراسية (اي ، المورفولوجية ، تسلسل الحمض النووي ، و مناعي) من آفات متميزة للمريض معين. أظهرنا القدرة علي طريقتنا للكشف عن الاحداث النسيلي و subclonal في نوع الورم الصامت الساكنة (اي ، SPN ، الأورام ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Library quantification
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antibody
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antibody
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antibody
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antibody
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antibody
Blocking Solution	home made	-	5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution	home made	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 or A27766	Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 or A30011	Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 or A30011	Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 or A38196	Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 or 12532-024	SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	home made	-	Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinization reagent