Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Özet

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Özet

İntra-tümöral heterojenitenin (ITH) değerlendirilmesi, hedeflenen tedavilerin başarısızlığını tahmin etmek ve buna göre etkili anti-tümör stratejileri tasarlamak için büyük önem taşımaktadır. Numune işleme ve kapsama derinliğindeki farklılıklar nedeniyle sık sık endişeler dile getirilse de, solid tümörlerin yeni nesil dizilemesi tümör tipleri arasında son derece değişken derecede ITH'yi ortaya çıkardı. Klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkinin yakalanması, ileri evre hastalıklar için tedavilerin tasarlanması nda kritik öneme sahiptir. Burada, aynı hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan deneysel yaklaşım, histolojik analiz, yüksek kapsama lı multi-lezyon dizilemesi ve immünopopnotipik analizler olmak üzere üç köklü yaklaşımı bütünleştirir. Uygun olmayan numune işleme ile subklonal olayların saptanması üzerindeki etkileri en aza indirmek için, dokuları dikkatli patolojik inceleme ve neoplastik hücre zenginleştirme tabi tetkik. Daha sonra neoplastik lezyonlar dan ve normal dokulardan kaliteli kontrollü DNA, 409 ilgili kanser geninin kodlama bölgelerini hedefleyerek yüksek kapsama alanına tabi tutuldu. Yaklaşımımız sadece sınırlı bir genomik alana bakarken, belirli bir hastanın farklı lezyonlarındaki somatik değişiklikler (tek nükleotit mutasyonları ve kopya numarası varyasyonları) arasındaki heterojenliğin derecesini değerlendirmeyi sağlar. Sıralama verilerinin karşılaştırmalı analizi sayesinde, klonal ve subklonal değişiklikleri ayırt edebildik. ITH çoğunluğu genellikle yolcu mutasyonları atfedilir; bu nedenle, mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için immünohistokimyayı da kullandık. Bu protokol belirli bir tümör tipine uygulanmış olsa da, burada açıklanan metodolojinin diğer solid tümör tipleri için genel olarak geçerli olduğunu öngörüyoruz.

Giriş

Yeni nesil sıralama gelişiyle (NGS) kanserler teşhis ve tedavi yolu devrim yarattı¹. Çok bölgesel sıralamaya bağlı NGS, solid tümörlerde yüksek derecede intra-tümöral heterojenite (ITH) maruz kalmıştır², bu da kısmen farklı ilaç duyarlılığı 2 ile subklonların varlığı nedeniyle hedeflenen tedavinin başarısızlığını açıklar² . Genom çapında sıralama çalışmalarının yarattığı önemli bir sorun, bireysel kanserlerde yolcu (yani nötr) ve sürücü mutasyonlarını birbirinden ayırma zorunluluğudur³. Çeşitli çalışmalar gerçekten göstermiştir ki, bazı tümörlerde, yolcu mutasyonları ITH çoğunluğu için hesap, sürücü değişiklikleri aynı bireysel lezyonlar arasında korunmuş olma eğilimindedir^{iken 4}. Ayrıca büyük mutasyonal yük (akciğer kanserleri ve melanom görüldüğü gibi) mutlaka büyük bir subklonal mutasyonyükü anlamına gelmez dikkat etmek önemlidir². Bu nedenle, düşük mutasyonyükü olan tümörlerde yüksek derecede ITH bulunabilir.

Metastazlar dünya çapında kansere bağlı ölümün %90'ından sorumludur^5; bu nedenle, primer ve metastatik lezyonlar arasında sürücü genlerinin mutasyonel heterojenliğini yakalamak ileri evre hastalıklar için etkili tedavilerin tasarlanması açısından kritik öneme sahiptir. Klinik sıralama genellikle sabit dokulardan gelen nükleik asitler üzerinde yapılır, bu da dna kalitesinin düşük olması nedeniyle genom çapında keşifleri zorlaştırır. Diğer taraftan, klinik sıralamanın amacı, belirli bir terapötik rejime yanıt verme/yanıt vermeme yi öngörebilecek eyleme geçirilebilir mutasyonları ve/veya mutasyonları belirlemektir. Haliyle, dizileme, klinik olarak ilgili bilgilerin zamanında çıkarılması için genomun daha küçük bir kısmıyla sınırlandırılabilir. Düşük iş türünde DNA profilleme (örneğin, Sanger Sıralama) NGS geçiş mümkün kapsama yüksek bir derinlikte kanserle ilgili genlerin yüzlerce analiz etmek için yaptı, hangi subklonal olayların tespiti için izin verir. Burada, aynı bireyden farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan yöntem, tanımlanan varyasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için üç köklü yaklaşımı (histolojik analiz, yüksek kapsamalı multi-lezyon dizilemesi ve immünopnotipik analizler) entegre eder. Yaklaşım şematik olarak Şekil 1'de tanımlanmıştır ve pankreasın 5 metastatik solid psödopapiller neoplazm olgusu (SPN) olgusu çalışmaya uygulanmıştır. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin işlenmesi ve analizini açıklarken, aynı prosedür taze dondurulmuş dokudan gelen genetik materyale de uygulanabilir.

Protokol

Çalışmada kullanılan malzeme yerel etik komitesi tarafından onaylanan özel bir protokol altında toplanmıştır. Tüm hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı mevcuttu.

1. Doku örneklerinin histolojik ve immünfenotipik revizyonu

NOT: Bundan sonra açıklanan faaliyetlerden uzman bir patolog sorumludur.

1. Seçilen olguların köklü tanı kriterlerine göre histopatolojik revizyonu.
   1. Temsili FFPE doku bloklarından 4−5 μm kalınlığında doku kesitlerini kesmek ve bölümleri standart histoloji slaytlarına monte etmek için mikrotomu kullanın.
   2. Otomatik doku slayt boyası(Tablo Malzemeler)kullanarak her slayt için hematoksilin ve eozin boyama gerçekleştirin.
   3. Seçilen tümör olgularının histopatolojik tanısını WHO tanı kriterlerine göre gözden geçirin.
      NOT: Bu aşamada, patolog aynı doku bölümü içinde tümörün morfolojik olarak farklı alanlarını belirleyebilir. Bu alanların ayrı ayrı hasat edilebilmektedir (bkz. bölüm 2). Tümör ve spn'ler için normal hücrelerin histolojik benzerliği Şekil 2'deverilmiştir.
   4. Histolojik analizi tamamlamak ve immünophenotipik heterojeniteyi tahmin etmek için kurulan belirteçler için immünohistokimyasal boyama yapın.
      NOT: Patolog aynı doku bölümü içinde tümörün immünfenotipik farklı alanlarını belirleyebilir. Bu alanların ayrı ayrı hasat edilebilmektedir (bkz. bölüm 2).
2. Tümör doku bölümünün neoplastik hücreselliğini değerlendirin ve manuel mikrodiseksiyonu buna göre planlayın.
   NOT: Bu tümör hücreselliği bir patolog tarafından oluşturulan bir tahmindir.
   1. Doku bölümünün neoplastik hücre içeriği %70'in üzerindeyse, manuel mikrodiseksiyon zorunlu değildir; doğrudan adım 3.1'e taşıyın.
      NOT: (i) mutant alel frekansı tahminleri için yeterli hassasiyeti sağlamak ve (ii) klonal mutasyonları daha az hassas metodolojilerle doğrulamak için (örn. kılcal sıralama) neoplastik hücre içeriğinin %70'ini hedefleyin.
   2. Doku bölümünün neoplastik hücre içeriği %70'in altındaysa mikrodiseksiyon gereklidir ve adım 2'ye geçilir.
3. Neoplastik olmayan dokunun örneklendiği FFPE bloğundaki doku kesitlerini değerlendirin. Bu doku germline DNA kaynağı olarak kullanılır.
   NOT: Kan, mikroplaline DNA'nın alternatif bir kaynağıdır. Bu durumda, adım 4.1 notunda tavsiye edilen DNA ekstraksiyonu ile devam edin.
   1. Doku bölümünde sadece neoplastik olmayan doku görülebiliyorsa(Şekil 2D),manuel mikrodiseksiyona gerek yoktur; doğrudan adım 3.1'e taşıyın.
   2. Doku bölümünde neoplastik hücrelerden önemli kontaminasyon varsa, manuel mikrodiseksiyon gereklidir; bölüm 2'ye geçin.

2. Manuel mikrodisseksiksiyon

NOT: Bu yöntem çeşitli solid tümör tipleri için geçerlidir ve doku örneklerinin neoplastik hücre içeriğini artırmak için tasarlanmıştır. Alternatif olarak, bu yöntem morfolojik ve / veya immünfenotipik farklı alanlarda aynı doku bölümü içinde hasat için kullanılabilir.

1. Bir mikrotom kullanarak, on 4−6 μm kalınlığında FFPE tümör doku kesitleri kesip şarjsız slaytlar üzerine monte edin.
   NOT: Örnekte sadece 1 mm² yuva kanser hücresi görülebiliyorsa, hedeflenen DNA miktarını (40 ng) elde etmek için 10 doku slaytı kesilerek manuel mikrodizisetabi tutulmalıdır; bu 1 mm² küme 700 ve 1000 tümör çekirdekleri arasında içerdiğini varsayarsak.
2. 60 °C'de 10 dk kuluçkaya yayılın.
3. Bir rafa slaytlar yerleştirin ve aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: 20 dakika için ksilen, 10 dakika için% 100 etanol, 10 dakika için% 80 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 1 dakika için distile su, 10 sin için hematoksilin karşı leke, 1 dk için musluk suyu.
4. Standart ters mikroskopta, mikrodisese aracı olarak şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve tümör hücrelerinin temsili kümelerini toplayın. Sıralama için gerekli miktarda DNA sağlamak için en az on 1 mm² hücre toplayarak hasat edin.
   NOT: Morfolojik olarak farklı alanların farklı varlıklar olarak analiz edilmesi amaçlanıyorsa, bu alanları ayrı ayrı toplamak için mikrodiseksiyon aracını kullanın.
5. Daha önce 20 μL proteaz K ve 180 μL lysis tampon(Malzeme Tablosu, dna ekstraksiyon kitinde yer alan Tablo) ile doldurulmuş 1,5 mL tüpler(Malzeme Tablosu)ve girdap ile karıştırın.

3. Önceki mikrodiszeksiyon olmadan dokuların işlenmesi

NOT: Bu işlem sadece neoplastik olmayan hücreler (germline DNA kaynağı) içeren veya morfolojik homojen kanser hücrelerinin en az %70'ini içeren doku blokları için kullanılır.

1. Seçilen FFPE doku bloklarından altı adet 4−5 μm kalınlığında doku kesiti olan bir mikrotom kullanılarak. Adım 2.5'te açıklandığı gibi doku parşömenlerini 1,5 mL tüplere yerleştirin.

4. Normal ve neoplastik hücrelerden DNA çıkarma

1. Üreticinin talimatlarına göre DNA FFPE doku çıkarma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak normal ve neoplastik dokudaki DNA'yı arındırın.
   NOT: Kan germin nükleik asit kaynağı olarak kullanıldığında, DNA kan çıkarma kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak DNA'yı arındırın.
2. DNA nicelik ve kalite kontrolü
   1. Çift iplikçikli (dsDNA) miktarını ölçmek için, floresan nükleik asit lekesi(Malzeme Tablosu)içeren bir çözeltiye DNA örneğinin bir aliquot'unu ekleyin ve bir tezgah üstü florometre (Malzeme Tablosu) kullanarak yayılan floresanölçeri ölçün ).
      NOT: Test, dsDNA'ya bağlı floresan boyalardan yayılan floresan sinyalin yoğunluğunu ölçer ve standart bir eğri kullanarak DNA miktarını belirler.
   2. DNA'yı nitelemek için numunenin 260/280 ve 260/230 oranlarını ölçmek için mikro hacimsi spektrofotometre(Malzeme Tablosu)kullanın. "Saf" DNA 1.8 260/280 ve 1.8−2.2 aralığında bir 260/230 olmalıdır.
      NOT: Numunenin spektrofotometrik değerlendirmesi, akış aşağı reaksiyonlarını etkileyen kimyasal kirleticilerin (örn. fenol) varlığını kanıtlamayı amaçlamaktadır. Kimyasal reaktiflerden kaynaklanan kontaminasyon durumunda, kolon tabanlı bir kit kullanarak bir temizleme adımı atın.

5. Kütüphane hazırlama ve niceleme

NOT: Kütüphane hazırlama ve niceleme adımlarının şematik akış şeması Şekil 3'teve da belirtilmemiştir.

1. DNA kitaplığı hazırlama (her örnek için 4 astar havuzu)
   NOT: 4 astar havuzu kanser paneline aitMalzeme Tablosu. Her havuz, 409 genden oluşan çok katlı hedef seçimi için tasarlanmış astar çiftleri içerir. NGS panelini oluşturan genler listesine bir bağlantıMalzeme Tablosu.
   1. Her örnek için dört DNA hedef amplifikasyon reaksiyonu hazırlayın, astar havuzu başına bir tane. Her astar havuzu için(Malzeme Tablosu),0,2 mL'lik bir tüp(Malzeme Tablosu):4 μL ana karışım (Kütüphane kitinde yer alanMalzeme Tablosu),10 μL yüksek sadakatli astar havuzu karışımı (Malzeme Tablosu, kanser paneli kütüphanesi) ve 6 μL DNA (toplam 10 ng).
   2. Aşağıdaki programı çalıştıran dört adet 1,5 mL tüpte her astar havuzunun hedef bölgelerini ayrı ayrı yükseltin: 99 °C'de 2 dakika (sıcak başlangıç polimerazın aktivasyonu), 16 döngü (99 °C'de 15 s, anneal ve 60 °C'de 8 dk boyunca uzatın) , 4 °C'de tutun.
      NOT: Durma noktası. Hedef amplifikasyon reaksiyonlarını gece boyunca 4 °C'de veya -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
   3. Amfikonsların kısmi sindirimi sona erer
      NOT: NGS üretici kiti tarafından sağlanan kılavuz, kısmi sindirimden önce her numuneden farklı amplifikasyon reaksiyonlarının biraraya geldiği bir adım öngörmektedir. Bu adımdan kaçının ve her amplifikasyon sindirim ayrı ayrı işleme tutun.
      1. Her numunenin güçlendirilmiş havuzuna (her 0,2 mL borunun toplam hacmi 22 μL'dir) özel sindirim karışımının 2 μL'sini(Kitaplıkkitinde yer alan Malzeme Tablosu) ekleyin. Girdap iyice ve damlacıkları toplamak için her tüp santrifüj.
      2. Tüpleri termal döngüye yükleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 10 dk için 50 °C, 10 dk için 55 °C, 20 dk için 60 °C, 10 °C (1 saate kadar) tutun.
         NOT: Durma noktası. Plakayı -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
   4. Amplicons için ligate adaptörleri ve arındırmak.
      NOT: Tek bir yonga üzerinde birden fazla kitaplık sıralarken her örnek için farklı bir barkod bağdaştırıcısı kullanın. Aynı örnekten alınan dört amplifikasyon reaksiyonu da aynı barkodu almalıdır.
      1. Adaptörleri hazırlayın(Malzeme Tablosu,barkod adaptörleri kiti). Her barkod X için, 1:4 son seyreltme de P1 adaptörü ve benzersiz barkod adaptörleri(Malzeme Tablosu)bir karışımını hazırlayın. 4 μL suyu 2 μL P1 adaptörü ve 2 μL benzersiz barkod adaptörleri ile karıştırın. Akış aşağı geçişleri için bu barkod adaptör karışımı 2 μL kullanın.
      2. Bu sırada her numunenin her yükseltilmiş havuzuna ekleyerek ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin: 4 μL anahtar çözeltisi(Kitaplıkkitinde yer alan Malzeme Tablosu), 2 μL barkod adaptör karışımı ve 2 μL DNA ligase (Malzeme Tablosu, kütüphane kiti) (toplam hacim = 30°L).
      3. Damlacıkları toplamak için iyice ve kısaca santrifüj girdap.
      4. Her tüpü termal döngüce yükleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 30 dk için 22 °C, 5 dk için 68 °C, 5 dk için 72 °C, 4 °C (24 saate kadar).
         NOT: Durma noktası. Plakayı -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
   5. Kütüphane temizliği ve amplifikasyon
      1. Her tüpü santrifüj edin ve sonra her barkodlu numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Her numunenin her havuzuna 45°L boncuk bazlı saflaştırma reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Boncuk süspansiyonu DNA ile karıştırmak için 5 kat yukarı ve aşağı boru.
      2. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın, ardından her tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve 2 dk. Peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
      3. Her tüpe 150 μL taze %70 etanol ekleyin. Mıknatısın iki pozisyonunun her tüpünü yan yana hareket ettiren boncukları yıkayın. Supernatant atın ve pelet rahatsız etmemek için dikkat edin.
      4. Adım 5.1.5.3'te açıklanan prosedürleri tekrarlayın ve tüpleri mıknatısta tutun ve boncukları 5 dakika boyunca RT'de havakurutun.
      5. Mıknatıstan her astar havuzunun saflaştırılmış kütüphaneleri ile tüpleri çıkarın ve boncuk peletine 50 μL yüksek sadakatli PCR Mix(Malzeme Tablosu)ve 2 μL kütüphane amplifikasyon astar karışımı(Malzeme Tablosu, kütüphane kitinde yer alan) ekleyin her tüp.
      6. Girdap her 1.5 mL tüp ve kısaca damlacıkları toplamak için santrifüj.
      7. Mıknatısın içine 1,5 mL tüpler yerleştirin ve her tüpten süpernatantı (~50 μL) peleti bozmadan yeni bir 0,2 mL tüpe dikkatlice aktarın.
      8. Aşağıdaki programı çalıştıran her astar havuzunun kütüphanelerini yükseltin: enzimi etkinleştirmek için 2 dk için 98 °C'de tutun, 5 döngü (15 s için 98 °C'de denatüre, anneal ve 64 °C 1 dk'da uzatın), 4 °C'de tutun. Örnekleri -20 °C'de saklayın.
   6. Güçlendirilmiş kütüphanenin arınması
      1. En alttaki içeriği toplamak ve güçlendirilmiş her kütüphane örneğini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için her tüpü santrifüj edin.
      2. Boncuk bazlı saflaştırma reaktifi 25 μL ekleyin. Boncuk süspansiyonu DNA ile karıştırmak için 5 kat yukarı ve aşağı boru.
      3. Karışımı RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve tüpleri mıknatısın içine 5 dk yerleştirin.
      4. Peleti rahatsız etmeden her tüpten yeni tüplere ampliconiçeren süpernatant'ı dikkatlice aktarın.
      5. Boncuk süspansiyonu ve DNA'yı karıştırmak için her tüpün supernatant'ına 60°L boncuk bazlı saflaştırma reaktifi ekleyin ve yukarı ve aşağı borular ekleyin.
      6. Karışımı RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve tüpleri 3 dk mıknatısa yerleştirin.
      7. Her tüpten supernatant atın ve pelet rahatsız değil dikkat edin.
         NOT: Amfikonlar boncuklara bağlıdır.
      8. Her tüpe 150 μL taze %70 etanol ekleyin. Mıknatısın iki pozisyonunda tüpleri yan yana hareket ettiren boncukları yıkayın. Supernatant atın ve pelet rahatsız etmemek için dikkat edin.
      9. Adım 5.1.6.8'de işlemi tekrarlayın ve 3 dk.
      10. Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve boncukları dağıtmak için pelete 50 μL düşük Tris EDTA (TE) (Kütüphane kitinde yer alanMalzeme Tablosu)ekleyin.
      11. Karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ve 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
      12. Tüpleri en az 2 dakika mıknatısa yerleştirin ve amfikononları içeren süpernatant'ı boncukları rahatsız etmeden yeni tüplere dikkatlice aktarın.
2. Kütüphane nicelleştirme
   1. Yüksek duyarlılıklı DNA kiti protokolüne göre bir DNA çipi çalıştırmak için bir parça analiz aleti(Malzeme Tablosu)kullanın.

6. Kütüphaneler havuzlama ve sıralama çalışması

1. Her kütüphaneyi çekirdeksiz suyla 100 pM'ye seyreltin. Tek bir tüpte tek bir çalışma için her 100 pM kitaplıktan 10 μL'yi birleştirin. Pipetleme ile kombine kitaplıkları karıştırın ve templating ve sıralama devam edin.
2. Planlı çalıştırma oluşturma
   NOT: Tipik bir çalışma, laboratuvarda bulunan sıralayıcıya (Ion Proton Sistemi veya GeneStudio S5 Sistemi, Malzeme Tablosu)dayalı iki farklı tipte yarı iletken yongaya (Iyon PI çip veya Iyon 540 çip) yüklenebilen dört numune içerir. Bu sistemler genellikle çalıştırıbaşına 80 milyon okuma üretir.
   1. Torrent Tarayıcısını sıralama sistemine bağlı bir bilgisayarda açın (örn. Iyon Şef Sistemi) ve seçili uygulama (AmpliSeqDNA) için genel şablonu kullanarak yeni bir çalışma planlayın.
   2. Planın Kitleri sekmesine geçin. Kullanılan sıralama sistemine göre enstrüman açılır listesinden Ion Proton Sistemi veya Ion GeneStudio S5 Sistemini seçin.
   3. Sıralama sistemine bağlı olarak, Chip Type açılır listesinden uygun çipi (Ion Proton Sistemleri için PI çipi; Ion GeneStudio S5 Systems için 540 yonga) seçin.
   4. Kitaplık Kiti açılır listesinden Ion AmpliSeq 2.0 Kitaplık Kiti'ni seçin.
   5. Şablon Kiti için Ion Chef düğmesini seçin ve ardından Şablon Kiti açılır listesinden uygun Şef Kiti'ni (PI çipi için Ion PI Hi-Q Chef Kit veya 540 çip için Ion 540 Kit-Chef) seçin.
   6. Sıralama Kiti açılır listesinden uygun sıralama kitini (PI çipi için Ion PI Hi-Q Sıralama 200 Kiti veya 540 çip için Ion S5 Sıralama Kiti) seçin ve ardından Barkod Seti açılır listesinden IonXpress'i seçin.
   7. Eklenti sekmesine geçin ve Kapsam Analizi eklentisini seçin.
   8. Plan sekmesine geçin. Referans Kitaplığı açılır listesinden GRCh37/hg19 genomunu seçin. Hedef Bölgeler açılır listesinden sıralanacak uygun paneli seçin.
   9. Sıralanacak barkod sayısını ve kitaplık örnek tüplerinin etiketini uygun alanlara ayarlayın.
   10. Her kitaplığın barkod adını ve örnek adını ayarlayın.
3. Örnek kitaplıklar seyreltme ve yükleme.
   1. Stok kitaplığını pi çip için 25 pM'ye veya 540 çip için 32 pM'ye kadar nükleaziçermeyen su yla seyreltin.
   2. Her seyreltilmiş kitaplığın 50°L'lik kısmını uygun kitaplık örnek tüpünün altına kadar pipet.
   3. Sıralama sistemini açın ve gerekli tüm reaktifleri yüklemek ve çalışma planını almak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
   4. Havuzlu kitaplıkları içeren kitaplık örnek tüpünü yükleyin ve klonal amplifikasyon programını başlatın.
      NOT: Ion Chef Sistemi her koşuda iki fiş hazırlanmasını gerektirir.
4. Ion Proton veya Ion GeneStudio S5'te sıralama.
   1. Sıralama sistemini açın ve sıralamayı başlatma ve çalışma planını almak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
   2. Sıralama yongasını sıralama sisteminden çıkardıktan sonra yükleyin.
      NOT: Elektrostatik deşarj nedeniyle talaş hasarından kaçınmak için bir çipi almadan önce topraklanmalıdır. Fiş işleme/konumlandırma ve başarılı/başarısız yükleme örnekleri Şekil 4'tebildirilmiştir.
   3. Yonga bölmesinin kapağını kapatın ve Chip Durumu simgesi "Hazır" gösterene kadar bekleyin.
   4. İlk çalıştırma tamamlandığında atık kabıboşaltın, ardından kalan fişi mümkün olan en kısa sürede sıralayın.

7. Mutasyonlar ve kopya-sayı varyasyonları (CNVs) analizi

NOT: Sıralama verilerinin GRCh37/hg19 insan referans genomuna hizalanması planda (adım 6.2.8) ayarlandıktan sonra otomatik olarak gerçekleştirilir.

1. Kapsama derinliğini ve tekdüzeliği doğrulamak için Kapsam Analizi eklentisini(Malzeme Tablosu)çıktısını kullanın.
2. Torrent varyant arayan eklentisini(Malzeme Tablosu)kullanarak, germline veya somatik iş akışını uygun şekilde seçerek varyant aramasını gerçekleştirin.
3. Filtre uygulanmış varyantları Varyant Arama Biçimi (VCF) dosyalarını indirin. Variant Effect Predictor (VEP) yazılımı⁶ ve NCBI RefSeq veritabanını kullanarak açıklama lı varyantları açıklama.
4. Ion Reporter yükleyici eklentisini kullanarak Ion Reporter Yazılımındaki sıralama verilerini yükleyin ve CNVs'leri tahmin etmek için verileri analiz etmek için Kapsamlı Kanser Paneli tümör normal çifti iş akışını kullanın.
5. Yazılım tarafından atanan puanlara göre mutasyonları ve CNV'leri el ile filtreleyin ve bunları Entegre Genomik Görüntüleyici (IGV)⁷ile görsel olarak doğrulayın.
   1. Dizilişi görsel olarak, artefakt çağrıları oluşturabilecek olağandışı okumalar (örneğin, yanlış telaffuz, aşırı amplifikasyon veya yumuşak kırpma okumaları nedeniyle) için hizalamayı denetleyin.
   2. Temel innormalleştirilmiş kapsama karşı belirli bir gen genelinde tüm amplicons için normalleştirilmiş kapsama inceleyerek CNVs doğrulayın.
      NOT: Bu, bazen bir genin sonunda ve ardışık genin başında birkaç amfikonssimetrik anormal kapsama dayalı bir CNV çağıran segmentasyon yazılımı nedeniyle yanlış çağrıların düzeltilmesine yardımcı olur.
6. Somatik mutasyonların indekslemi
   1. Her olguda indeks mutasyonu normal doku/kan, primer tümör ve metastaz dizilimi nden kaynaklanır.
   2. Germline olarak işaretle ve germline DNA'sının veri sıralamaverileri de belirgindir aramaları atın.
   3. Belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşılan mutasyonları klonal/kurucu olarak işaretle.
   4. Subklonal/ilerleme veya belirli bir hastanın tüm lezyonlarında değil de bazılarında saptanan mutasyonlar olarak bayrak.

8. İmmünopnotisik analiz: ilgili protein ekspresyonu için immünohistokimya

NOT: İmmünohistokimya, tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonların aktive edici sonuçları doğrulamak için kullanıldı.

1. Bir mikrotom kullanarak, 3−4 μm kalınlığında FFPE doku kesitleri kesip yüklü slaytlara monte edin ve 60 °C'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
2. Slaytları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki adımları yapın: 10 dk için ksilen, 10 dakika için ksilen, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için distile su.
3. Antikor üreticilerinin endikasyonuna göre antijen alımı gerçekleştirin(Malzeme Tablosu).
   1. Belirli antijen alma çözeltisi ile bir rafa slaytlar yerleştirin ve sub-kaynama sıcaklıklarda bir su banyosu batırın.
   2. Banyodan slaytlar çıkarın ve 10 dakika soğuması için musluk suyu çalıştırın.
4. Endojen peroksidazları inaktive etmek için slaytları RT'de 20 dakika boyunca 1x Tris tamponlu salinde (TBS) %3 H₂O₂ ile yeni bir rafa yerleştirin.
5. Slaytları yeni bir rafa yerleştirin ve TBS ile 3 kat yıkayın ve Tween 20'nin %0,1'ini (TBST) yıkayın.
6. Slayta monte edilmiş dokunun etrafına hidrofobik bir daire çizmek için PAP kalemi(Malzeme Tablosu)kullanın.
7. Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve tbst'de %5 büyükbaş serum albumin (BSA) kullanarak 1 saat boyunca rt'de engelleme yi engelleyin.
8. Bir gecede 4 °C'de nemli bir odada birincil antikorlarla(Malzeme Tablosu)kuluçka yada slaytlar. Tavsiye edilen blokaj çözeltisi ile birincil antikor seyreltin.
9. Slaytları yeni bir rafa yerleştirin ve TBST ile 3x yıkayın.
10. Nemli bir odada RT'de 30 dakika boyunca spesifik ikincil antikorlarla (anti-fare veya anti-tavşan) (1 slayt için 4−5 damla) ile inküböz slaytlar.
11. Yeni bir rafa slaytlar yerleştirin ve TBST ile 3x yıkayın ve distile suda sonra.
12. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi seyreltme 1 mL seyreltme tampon (Malzeme Tablosu). Mikroskop altında 5 dakika kontrol için en fazla 5 dakika inküböz slaytlar.
13. Mikroskop altında reaksiyon gelişimini izleyerek kuluçka süresini hesaplamak için pozitif bir kontrol kullanın.
    NOT: Her antikor belirli bir kuluçka süresine ihtiyaç duyar.
14. Distile suya slaytlar batırarak inaktif DAB (kromojen yağış durdurun).
15. 10 s hematoksilin ile yeni bir rafa daldırma ve daha sonra musluk suyu ile durulayın tarafından Counterstain slaytlar.
16. Slaytları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki adımları yapın: 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %95 etanol, 10 dakika ksilen, 10 dakika ksilen.
17. Her doku slaytına birkaç damla montaj ortamı(Malzeme Tablosu)koyarak ve kapak lı kapaklı slaytları kapatın.
18. Aşırı orta ve hava kabarcıklarını dokudan uzaklaştırıp kapak ve hava kurusundan uzaklaştırmak için kapak kaymasına basınç uygulayın.
19. Ters mikroskop altında yapılan boyama sonuçlarını uzman bir patolog ile değerlendirin ve skorlandırın.
    NOT: Puanlama sistemi, literatürdeki bilgilerin zaten mevcut olabileceği belirli antijenlere bağlıdır. Literatürde bilgi yoksa, referans olarak normal dokudaki antijenifadesini kullanarak bir puanlama sistemi türetin.

Sonuçlar

Çalışma iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. 409 kanserle ilişkili genin kodlama dizilerini hedefleyen 5 SPN olgunun çoklu lezyonlar (n = 13) dizilimi 8 gende toplam 27 somatik mutasyon tespit edilir(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, ve FGFR3). Mutasyonlar, belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşıldığında kurucu/klonal, belirli bir hastanın tüm lezyonlarında değil de tüm le...

Tartışmalar

Yöntemimiz, katı tümörlerin ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin, belirli bir hastanın farklı lezyonlarından dikey verilerin (yani morfoloji, DNA dizilemesi ve immünohistokimya) entegrasyonu yoluyla belirlenmesini sağlar. 409 kanserle ilgili genin kodlama dizilerini sorgulayarak mutasyonel sessiz tümör tipinde (yani, SPN, pankreasın solid-psödopapiller neoplazmı) klonal ve subklonal olayları tespit etme yöntemimizin yeteneğini gösterdik⁸. Burada kullanılan ampl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Library quantification
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antibody
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antibody
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antibody
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antibody
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antibody
Blocking Solution	home made	-	5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution	home made	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 or A27766	Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 or A30011	Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 or A30011	Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 or A38196	Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 or 12532-024	SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	home made	-	Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinization reagent