Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.

Abstract

Valutare l'eterogeneità intra-tumorale (ITH) è di fondamentale importanza per anticipare il fallimento delle terapie mirate e progettare strategie antitumorali di conseguenza efficaci. Anche se le preoccupazioni sono spesso sollevate a causa delle differenze nell'elaborazione del campione e nella profondità della copertura, il sequenziamento di prossima generazione dei tumori solidi ha svelato un grado altamente variabile di ITH in tutti i tipi di tumore. Catturare la correlazione genetica tra le lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali è fondamentale per la progettazione di terapie per le malattie in fase avanzata. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dello stesso paziente. L'approccio sperimentale qui descritto integra tre approcci consolidati: analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche. Al fine di ridurre al minimo gli effetti sulla rilevazione di eventi subclonali mediante un'elaborazione inappropriata dei campioni, abbiamo sottoposto i tessuti a un attento esame patologico e all'arricchimento delle cellule neoplastiche. Il DNA controllato dalla qualità delle lesioni neoplastiche e dei tessuti normali è stato poi sottoposto a sequenziamento ad alta copertura, mirando alle regioni di codifica di 409 geni tumorali rilevanti. Sebbene solo guardando uno spazio genomico limitato, il nostro approccio consente di valutare l'entità dell'eterogeneità tra alterazioni somatiche (mutazioni a singolo nucleotide e variazioni del numero di copie) in lesioni distinte da un determinato paziente. Attraverso un'analisi comparativa dei dati di sequenziamento, siamo stati in grado di distinguere le alterazioni clonale e subclonali. La maggior parte dell'ITH è spesso attribuita alle mutazioni dei passeggeri; pertanto, abbiamo anche usato l'immunoistochimica per prevedere le conseguenze funzionali delle mutazioni. Mentre questo protocollo è stato applicato a un tipo di tumore specifico, prevediamo che la metodologia qui descritta è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido.

Introduzione

L'avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il modo in cui i tumori vengono diagnosticati e trattati¹. NGS accoppiato al sequenziamento multiregionale hanno esposto un alto grado di eterogeneità intra-tumorale (ITH) in tumori solidi², che spiega in parte il fallimento della terapia mirata a causa della presenza di subcloni con diversa sensibilità farmacologica² . Una sfida importante posta dagli studi di sequenziamento a livello di genoma è la necessità di distinguere tra mutazioni passeggeri (cioè neutre) e del conducente nei singoli tumori³. Diversi studi hanno infatti dimostrato che, in alcuni tumori, le mutazioni dei passeggeri rappresentano la maggior parte dello ITH, mentre le alterazioni del conducente tendono ad essere conservate tra le lesioni dello stesso individuo⁴. È anche importante notare che un grande onere mutazionale (come si è visto nei tumori polmonari e nel melanoma) non implica necessariamente un grande onere mutazionale subclonale². Pertanto, un alto grado di ITH può essere trovato in tumori con basso carico mutazionale.

Le metastasi sono responsabili di oltre il 90% della morte per cancro in tutto il mondo⁵; pertanto, catturare l'eterogeneità mutazionale dei geni del conducente tra lesioni primarie e metastatiche è fondamentale per la progettazione di terapie efficaci per le malattie in fase avanzata. Il sequenziamento clinico viene generalmente eseguito su acidi nucleici provenienti da tessuti fissi, il che rende difficile l'esplorazione in tutta il genoma a causa della scarsa qualità del DNA. D'altra parte, l'intento del sequenziamento clinico è quello di identificare mutazioni e/o mutazioni utilizzabili che potrebbero prevedere la reattività/non risposta a un determinato regime terapeutico. Così com'è, il sequenziamento può essere limitato a una frazione minore del genoma per l'estrazione tempestiva di informazioni clinicamente rilevanti. La transizione dalla profilazione del DNA a bassa velocità (ad esempio, Sanger Sequencing) a NGS ha reso possibile analizzare centinaia di geni rilevanti per il cancro ad un'elevata profondità di copertura, il che consente il rilevamento di eventi subclonali. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dallo stesso individuo. Il metodo qui descritto integra tre approcci consolidati (analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche) per prevedere le conseguenze funzionali delle variazioni identificate. L'approccio è schematicomente descritto nella Figura 1 ed è stato applicato allo studio di 5 casi metastatici di neoplasmi pseudoppillari (STEN) solidi del pancreas. Mentre descriviamo l'elaborazione e l'analisi di campioni di tessuto incorporato in paraffina fissata a formalina (FFPE), la stessa procedura può essere applicata al materiale genetico proveniente da tessuto fresco congelato.

Protocollo

Il materiale utilizzato nello studio è stato raccolto nell'ambito di un protocollo specifico, che è stato approvato dal comitato etico locale. Era disponibile il consenso informato scritto da parte di tutti i pazienti.

1. Revisione istologica e immunofenotipica dei campioni di tessuto

NOTA: Un patologo esperto è responsabile delle attività descritte di seguito.

1. Revisione istopatologica dei casi selezionati secondo criteri diagnostici ben consolidati.
   1. Utilizzare il microtoma per tagliare sezioni di tessuto spesso 4x5 m da blocchi di tessuto FFPE rappresentativi e montare le sezioni su vetrini di istologia standard.
   2. Eseguire la colorazione ematossilina ed eosina per ogni diapositiva utilizzando una scala di scorrimento di tessuto automatizzato (Tabella dei materiali).
   3. Rivedere la diagnosi istopatologica dei casi tumorali selezionati in base ai criteri diagnostici dell'OMS.
      NOTA: In questa fase, il patologo potrebbe identificare aree morfologicamente distinte del tumore all'interno della stessa sezione di tessuto. È possibile raccogliere tali aree separatamente (cfr. sezione 2). La somiglianza istologica del tumore e delle cellule normali per gli SPN è riportata nella figura 2.
   4. Eseguire la colorazione immunoistochimica per marcatori stabiliti per integrare l'analisi istologica e stimare l'eterogeneità immunofenotipica.
      NOTA: Il patologo potrebbe identificare aree immunofenotipicamente distinte del tumore all'interno della stessa sezione tissutale. È possibile raccogliere tali aree separatamente (cfr. sezione 2).
2. Valutare l'cellularità neoplastica della sezione del tessuto tumorale e pianificare di conseguenza la microdissezione manuale.
   NOTA: Questa è una stima generata dal patologo della cellularità tumorale.
   1. Se il contenuto di cellule neoplastiche della sezione tissutale è superiore al 70%, la microdissezione manuale non è obbligatoria; passare direttamente al punto 3.1.
      NOTA: target il 70% del contenuto di cellule neoplastiche al fine di (i) garantire un'adeguata sensibilità per le stime di frequenza allele mutanti e (ii) per convalidare eventualmente le mutazioni clonali con metodologie meno sensibili (ad esempio, sequenziamento capillare).
   2. Se il contenuto di cellule neoplastiche della sezione tissutale è inferiore al 70%, la microdissezione è necessaria e passare al passaggio 2.
3. Valutare le sezioni tissutali del blocco FFPE in cui è stato campionato il tessuto non neoplastico. Questo tessuto è usato come fonte di DNA germinale.
   NOTA: Il sangue è una fonte alternativa di DNA germinale. In questo caso, procedere con l'estrazione del DNA come consigliato nella nota del passo 4.1.
   1. Se solo il tessuto non neoplastico è visibile nella sezione dei tessuti (Figura 2D), la microdissezione manuale non è necessaria; passare direttamente al punto 3.1.
   2. Se nella sezione dei tessuti è presente una sostanziale contaminazione da cellule neoplastiche, è necessaria una microdissezione manuale; passare alla sezione 2.

2. Microdisezione manuale

NOTA: Questo metodo è applicabile a vari tipi di tumore solido, ed è destinato ad aumentare il contenuto di cellule neoplastiche di campioni di tessuto. In alternativa, questo metodo può essere utilizzato per raccogliere aree morfologicamente e/o immunofenotipicamente distinte all'interno della stessa sezione tissutale.

1. Utilizzando un microtoma, tagliare fino a dieci sezioni di tessuto tumorale FFPE di spessore 4,6 m e montarle su vetrini non caricati.
   NOTA: Se nel campione è visibile solo un nido di 1 mm^2, 10 vetrini devono essere tagliati e sottoposti a microdissezione manuale per ottenere la quantità mirata di DNA (40 ng); questo supponendo che 1 mm² cluster contiene tra 700 e 1000 nuclei tumorali.
2. Incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 10 min.
3. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti oli: xilene per 20 min, 100% etanolo per 10 min, 80% etanolo per 10 min, 70% etanolo per 10 min, acqua distillata per 1 min, acqua distillata per 1 min, ematoxilina per 10 s, acqua del rubinetto per 1 min.
4. Su un microscopio invertito standard, utilizzare un ago da 27 G su una siringa come strumento di microdissezione e raccogliere cluster rappresentativi di cellule tumorali. Raccogliere un minimo di dieci 1 mm² cluster di cellule per garantire la quantità necessaria di DNA per il sequenziamento.
   NOTA: Se le aree morfologicamente distinte sono destinate ad essere analizzate come entità diverse, utilizzare lo strumento microdissezione per raccogliere tali aree separatamente.
5. Collocare i cluster raccolti in tubi da 1,5 mL (Tabella dei Materiali) precedentemente riempiti con 20 gradi di proteasi K e 180 l di tampone di lisi ( Tabella deimateriali, entrambi inclusi nel kit di estrazione del DNA) e mescolare mediante vortice.

3. Elaborazione di tessuti senza microdissezione precedente

NOTA: Questa procedura viene utilizzata per i blocchi di tessuto che contengono solo cellule non neoplastiche (fonte di DNA germinale) o contengono almeno il 70% delle cellule tumorali morfologicamente omogenee.

1. Utilizzando un microtoma tagliato fino a sei sezioni di tessuto spesso 4x5 m da blocchi di tessuto FFPE selezionati. Posizionare le pergamene dei tessuti in tubi da 1,5 mL come descritto al punto 2.5.

4. Estrazione del DNA da cellule normali e neoplastiche

1. Purificare il DNA dal tessuto normale e neoplastico utilizzando il kit di estrazione dei tessuti DNA FFPE (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Quando il sangue viene utilizzato come fonte di acido nucleico germinale, purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del sangue del DNA (Tabella dei materiali).
2. Quantificazione del DNA e controllo di qualità
   1. Per quantificare la quantità di doppia filamento (dsDNA), aggiungere un'aliquota del campione di DNA a una soluzione contenente una macchia di acido nucleico fluorescente (Tabella dei materiali) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella dei materiali ) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella deimateriali ).
      NOTA: Il test misura l'intensità del segnale fluorescente emesso da coloranti fluorescenti attaccati a dsDNA e determina la quantità di DNA utilizzando una curva standard.
   2. Utilizzare uno spettrofotometro a microvolume (Tabella dei materiali) per misurare i rapporti 260/280 e 260/230 del campione per qualificare il DNA. Il DNA "puro" dovrebbe avere un 260/280 di 1,8 e un 260/230 compreso tra 1,8 e 2,2.
      NOTA: La valutazione spettrofotometrica del campione ha lo scopo di dimostrare la presenza di contaminanti chimici (ad esempio, fenolo) che influiscono sulle reazioni a valle. In caso di contaminazione dovuta a reagenti chimici, eseguire una fase di pulizia utilizzando un kit basato su colonne.

5. Preparazione e quantificazione della biblioteca

NOTA: il diagramma di flusso schematico delle fasi di preparazione e quantificazione della libreria è riportato nella figura 3.

1. Preparazione della libreria del DNA (4 pool di primer allestiti per ogni campione)
   NOTA: Le 4 piscine di primer appartengono al pannello del cancro riportatoTabella dei materiali. Ogni piscina contiene coppie di primer che sono progettati per una selezione bersaglio multiplexed di 409 geni. Un link all'elenco dei geni che compongono il pannello NGS è fornito inTabella dei materiali.
   1. Preparare quattro reazioni di amplificazione del bersaglio del DNA per ogni campione, uno per pool di primer. Per ogni pooldiprimer ( Table of Materials ), aggiungere in un tubo da 0,2 mL (Tabella dei materiali): 4 -L di master mix (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria), 10 -L di miscela di piscine primer ad alta fedeltà ( Tabella deimateriali, incluso nel libreria del pannello contro il cancro) e 6 ldi di DNA (10 ng in totale).
   2. Amplifica le regioni di destinazione di ciascuna piscina di primer separatamente in quattro tubi da 1,5 mL che eseguono il seguente programma: tenere a 99 gradi per 2 min (attivazione della polimerasi di avvio caldo), 16 cicli (denaturare a 99 gradi centigradi per 15 s, anneal ed estendere a 60 s per 8 min) , tenere premuto a 4 gradi centigradi.
      NOTA: punto di arresto. Conservare le reazioni di amplificazione bersaglio a 4 gradi centigradi o a -20 gradi centigradi per un tempo più lungo.
   3. La digestione parziale delle estremità degli amplificatori
      NOTA: Il manuale fornito dal kit produttore NGS prevede un passo in cui le diverse reazioni di amplificazione da ogni campione vengono combinate prima della digestione parziale. Evitare questo passaggio e continuare a elaborare ogni digestione dell'amplificazione separatamente.
      1. Aggiungere 2 -L di miscela di digestione specifica (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria) ad ogni pool amplificato di ogni campione (il volume totale di ogni tubo da 0,2 mL è 22). Vorticare accuratamente e centrifugare ogni tubo per raccogliere goccioline.
      2. Caricare i tubi nel ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 50 S per 10 min, 55 Gradi centigradi per 10 min, 60 gradi centigradi per 20 min, 10 gradi centigradi (fino a 1 h).
         NOTA: punto di arresto. Conservare la piastra a -20 gradi centigradi per periodi più lunghi.
   4. Ligate adattatori per amplificare e purificare.
      NOTA: utilizzare un adattatore di codice a barre diverso per ogni campione quando si sequenziano più librerie su un singolo chip. Tutte e quattro le reazioni di amplificazione dello stesso campione devono ricevere lo stesso codice a barre.
      1. Preparare adattatori (Tabella dei materiali, kit di adattatori per codici a barre). Per ogni codice a barre X, preparare una combinazione di adattatori P1 e adattatori di codice a barre unici (Tabella dei materiali) con una diluizione finale di 1:4. Mescolare 4 l'acqua con 2 l'audio dell'adattatore P1 e 2 l. di adattatori di codici a barre unici. Utilizzare 2 l di questa combinazione di adattatori di codici a barre per i passaggi a valle.
      2. Eseguire la reazione di legatura aggiungendo ad ogni pool amplificato di ogni campione in questo ordine: 4 l. di soluzione switch (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria), 2 l of bar adapter mix e 2 l di DNA ligase(Tabella dei materiali, incluso in il kit della biblioteca) (volume totale : 30 l).
      3. Vorticare accuratamente e brevemente centrifugare per raccogliere goccioline.
      4. Caricare ogni tubo nel ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 22 s per 30 min, 68 S per 5 min, 72 S per 5 min, 4 gradi centigradi (fino a 24 h).
         NOTA: punto di arresto. Conservare la piastra a -20 gradi centigradi per periodi più lunghi.
   5. Purificazione e amplificazione della biblioteca
      1. Centrifugare ogni tubo e quindi trasferire ogni campione con codice a barre in un tubo da 1,5 mL. Aggiungete 45 l di reagente di purificazione a base di perline (Tabella dei materiali) ad ogni pool di ogni campione. Pipet su e giù 5x per mescolare la sospensione del tallone con il DNA.
      2. Incubare il composto per 5 min a temperatura ambiente (RT), quindi posizionare ogni tubo in un rack magnetico e incubare per 2 min. Rimuovere e scartare con attenzione supernatante senza disturbare il pellet.
      3. Aggiungere in ogni tubo 150 l di fresco 70% etanolo. Lavare le perline muovendo ogni tubo da un lato all'altro delle due posizioni del magnete. Scartare il supernatante e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
      4. Ripetere le procedure descritte nel passaggio 5.1.5.3, quindi mantenere i tubi nel magnete e asciugare all'aria le perline a RT per 5 min.
      5. Rimuovere i tubi con librerie purificate di ogni piscina di primer dal magnete e aggiungere 50 -L di miscela PCR ad alta fedeltà (Tabella dei materiali) e 2 l of library amplificazione primer mix ( Tabella deimateriali, incluso nel kit di libreria) per il pellet di perline di per ogni tubo.
      6. Vorticare ogni tubo da 1,5 ml e centrifugare brevemente per raccogliere goccioline.
      7. Mettere 1,5 mL di tubi nel magnete per 2 min e trasferire con attenzione il supernatanto (50 dollari l) da ogni tubo a un nuovo tubo da 0,2 mL senza disturbare il pellet.
      8. Amplificare le librerie di ogni pool di primer che eseguono il seguente programma: tenere a 98 gradi centigradi per 2 minuti per attivare l'enzima, 5 cicli (denaturaa a 98 gradi centigradi per 15 s, anneal ed estendere a 64 gradi centigradi), tenere a 4 gradi centigradi. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi.
   6. Purificazione della biblioteca amplificata
      1. Centrifugare ogni tubo per raccogliere il contenuto nella parte inferiore e trasferire ogni campione di libreria amplificata in un tubo da 1,5 mL.
      2. Aggiungere 25 -L di purificatione a base di perline. Pipet su e giù 5x per mescolare la sospensione del tallone con il DNA.
      3. Incubare il composto per 5 min a RT, quindi mettere i tubi nel magnete per 5 min.
      4. Trasferire con attenzione il supernatante, che contiene gli amplicons, da ogni tubo a nuovi tubi senza disturbare il pellet.
      5. Aggiungere 60 l di reagente di purificazione a base di perline al supernatore di ogni tubo e pipet su e giù al fine di mescolare sospensione del tallone e DNA.
      6. Incubare il composto per 5 min a RT e quindi mettere i tubi nel magnete per 3 min.
      7. Scartare il supernatante da ogni tubo e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
         NOTA: gli amplificatori sono legati alle perline.
      8. Aggiungere in ogni tubo 150 l di fresco 70% etanolo. Lavare le perline muovendo i tubi da un lato all'altro nelle due posizioni del magnete. Scartare il supernatante e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
      9. Ripetere la procedura nel passaggio 5.1.6.8 e asciugare all'aria le perline a RT per 3 min. Evitare un'eccessiva essiccazione delle perline.
      10. Togliere i tubi dal magnete e aggiungere 50 - L di basso Tris EDTA (TE) (Tavolo dei materiali, incluso nel kit di libreria) al pellet per disperdere le perline.
      11. Pipet la miscela su e giù più volte e incubare a RT per 2 min.
      12. Posizionare i tubi nel magnete per almeno 2 min e trasferire con attenzione il supernatante, che contiene gli amplificatori, a nuovi tubi senza disturbare le perline.
2. Quantificazione biblioteca
   1. Utilizzare uno strumentodianalisi dei frammenti ( Tabella dei materiali ) per eseguire un chip di DNA secondo il protocollo del kit DNA ad alta sensibilità.

6. Esecuzione di pooling e sequenziamento delle librerie

1. Diluire ogni biblioteca a 100 pM con acqua priva di nuclenon. Unire 10 librerie da 100 pM per una singola conduzione in un unico tubo. Mescolare le librerie combinate con il pipeting e procedere alla creazione di modelli e sequenzia.
2. Creazione pianificata di esecuzione
   NOTA: una tipica esecuzione comprende quattro campioni che possono essere caricati su due diversi tipi di chip semiconduttore (chip Ion PI o chip Ion 540) in base al sequencer disponibile in laboratorio (Ion Proton System o GeneStudio S5 System, Table of Materials). Questi sistemi producono in genere 80 milioni di letture per esecuzione.
   1. Aprire il Browser Torrent su un computer collegato al sistema di sequenziamento (ad esempio, Ion Chef System) e pianificare una nuova esecuzione utilizzando il modello generico per l'applicazione selezionata (AmpliSeqDNA).
   2. Passare alla scheda Kit del piano. Selezionare Ion Proton System o Ion GeneStudio S5 System dall'elenco a discesa degli strumenti in base al sistema di sequenziamento in uso.
   3. A seconda del sistema di sequenziamento, selezionare il chip appropriato (chip PI per Ion Proton Systems; chip 540 per Ion GeneStudio S5 Systems) dall'elenco a discesa Chip Type .
   4. Selezionare Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit dall'elenco a discesa Library Kit.
   5. Selezionare il pulsante Ion Chef per Template Kit, quindi selezionare il kit Chef appropriato (Ion PI Hi-Q Chef Kit per chip PI o Ion 540 Kit-Chef per 540 chip) dall'elenco a discesa Template Kit.
   6. Selezionare il kit di sequenziamento appropriato (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit per chip PI o Ion S5 Sequencing Kit per 540 chip) dall'elenco a discesa Kit di sequenziamento, quindi selezionare IonXpress dall'elenco a discesa Set di codici a barre.
   7. Passare alla scheda Plugin e selezionare il plug-in Analisi copertura.
   8. Passare alla scheda Piano, selezionare il genoma GRCh37/hg19 dall'elenco a discesa Libreria riferimenti. Dall'elenco a discesa Aree di destinazione, selezionare il pannello appropriato da sequenziare.
   9. Impostare il numero di codici a barre da sequenziare e l'etichetta dei tubi campione della libreria nei campi appropriati.
   10. Impostare il nome del codice a barre e il nome di esempio per ogni libreria.
3. Librerie di esempio di luito e caricamento.
   1. Diluire la libreria di stock con acqua priva di nuclenonazione a 25 pM per chip PI o 32 pM per chip 540.
   2. Pipet 50 - L di ogni libreria diluita sul fondo del tubo campione di libreria appropriata.
   3. Attivare il sistema di sequenziamento e seguire le istruzioni visualizzate per caricare tutti i reagenti necessari e importare il piano di esecuzione.
   4. Caricare il tubo di esempio della libreria contenente le librerie in pool e avviare il programma di amplificazione clonale.
      NOTA: il sistema Ion Chef richiede due chip da preparare per ogni corsa.
4. Sequenziamento su Ion Proton o Ion GeneStudio S5.
   1. Attivare il sistema di sequenziamento e seguire le istruzioni visualizzate per inizializzare la sequenza e importare il piano di esecuzione.
   2. Caricare il chip di sequenziamento dopo averlo rimosso dal sistema di sequenziamento .
      NOTA: Essere a terra prima di raccogliere un chip per evitare danni al truciolo dovuti a scarica elettrostatica. La gestione/posizionamento dei trucioli insieme agli esempi di caricamento riuscito/non riuscito sono riportati nella Figura 4.
   3. Chiudere il coperchio del vano chip e attendere che l'icona Stato chip indichi "Pronto".
   4. Svuotare il contenitore dei rifiuti al termine della prima esecuzione, quindi sequenziare il chip rimanente il prima possibile.

7. Analisi delle mutazioni e delle variazioni dei numeri di copia (CNV)

NOTA: l'allineamento dei dati di sequenziamento al genoma di riferimento umano GRCh37/hg19 viene eseguito automaticamente una volta impostato nel piano (passaggio 6.2.8).

1. Utilizzare l'output del plug-in Analisi di copertura (Tabella dei materiali) per verificare la profondità di copertura e uniformità.
2. Eseguire la chiamata variante utilizzando il plug-in chiamante variante Torrent (Tabella dei materiali), selezionando il flusso di lavoro germinale o somatico in base alle esigenze.
3. Scaricare i file variante filtrati Variant Call Format (VCF). Annotare le varianti utilizzando il software VEP (Variant Effect Predictor)⁶ e il database NCBI RefSeq.
4. Caricare i dati di sequenziamento sul software Ion Reporter utilizzando il plug-in di caricamento di Ion Reporter e utilizzare il flusso di lavoro di coppia tumora-normale Comprehensive Cancer Panel per analizzare i dati al fine di stimare CNV.
5. Filtra manualmente le mutazioni e i CNV in base ai punteggi assegnati dal software e verificali visivamente con integrative Genomics Viewer (IGV)⁷.
   1. Controllare visivamente l'allineamento per letture insolite (a causa, ad esempio, di disdurante, sovraamplificazione o letture soft-clipping) che possono generare chiamate artefatti.
   2. Verificare i CNV ispezionando la copertura normalizzata per tutti gli ampi di un determinato gene rispetto alla copertura normalizzata della linea di base.
      NOTA: Questo aiuta a correggere le false chiamate a causa del software di segmentazione, che a volte chiama una CNV basata su una copertura simmetricamente anormale di pochi amplificatori alla fine di un gene e all'inizio del gene successivo.
6. Indicizzazione delle mutazioni somatiche
   1. Per ogni caso, chiamate di mutazione dell'indice dal sequenziamento del tessuto normale/ sangue, tumore primario e metastasi.
   2. Bandiera come germinale e scartare le chiamate che sono evidenti anche dai dati di sequenziamento del DNA germinale.
   3. Bandiera come clonale/fondatore le mutazioni che sono condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente.
   4. Bandiera come subclonale/progresso o le mutazioni che vengono rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente.

8. Analisi immunofenotipica: immunohistochimica per l'espressione proteica rilevante

NOTA: L'immunoistochimica è stata utilizzata per convalidare le conseguenze funzionali dell'inattivazione delle mutazioni nei geni soppressori tumorali.

1. Utilizzando un microtome, tagliare le sezioni di tessuto FFPE di spessore 3,4 m e montarle su vetrini caricati e incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 10 min.
2. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi: xilene per 10 min, xilene per 10 min, 95% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, acqua distillata per 4 min.
3. Eseguire il recupero dell'antigene in base all'indicazione dei produttori di anticorpi (Tabella dei materiali).
   1. Mettere i vetrini in un rack con la soluzione specifica di recupero dell'antigene e immergersi in un bagno d'acqua a temperature sotto-ebolliche.
   2. Rimuovere i vetrini dal bagno e far funzionare l'acqua del rubinetto per raffreddare per 10 min.
4. Posizionare i vetrini in un nuovo rack con 3% H₂O₂ in 1x salina tampo nel buffer Tris (TBS) per 20 min a RT al fine di inattivare perossidi endogene.
5. Collocare i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBS e lo 0,1% di Tween 20 (TBST).
6. Utilizzare una penna PAP (Tabella dei materiali) per disegnare un cerchio idrofobico intorno al tessuto montato su slitta.
7. Posizionare i vetrini in una camera umida ed eseguire il blocco per 1 h a RT utilizzando 5% albumin a siero bovino (BSA) in TBST come soluzione di blocco.
8. Incubare i vetrini con anticorpi primari (Tabella dei materiali) in una camera umida durante la notte a 4 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo primario con la soluzione di blocco come raccomandato.
9. Mettere i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBST.
10. Incuba vetrini con anticorpi secondari specifici (anti-topo o anti-coniglio) (4o5 gocce per 1 scivolo) per 30 min a RT in una camera umida.
11. Mettere i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBST e dopo in acqua distillata.
12. Preparare la soluzione 3,3'-diaminobenzidine (DAB) diluindo 1 goccia in 1 mL di tampone di diluizione (Tabella dei materiali). Incubare i vetrini al massimo per 5 min di controllo al microscopio.
13. Utilizzare un controllo positivo per calcolare il tempo di incubazione seguendo lo sviluppo della reazione al microscopio.
    NOTA: ogni anticorpo ha bisogno di un tempo di incubazione specifico.
14. DAB inattivo (temperatura cromogena stop) sommergendo i vetrini nell'acqua distillata.
15. Controstain scivoli immergendoli in un nuovo rack con ematossitale per 10 s e poi risciacquare con acqua del rubinetto.
16. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi: 70% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, xilene per 10 min, xilene per 10 min.
17. Sigillare le vetrine mettendo un paio di gocce di supporto di montaggio (Tabella dei materiali) su ogni vetrine del tessuto e coprire con coperchio.
18. Applicare la pressione sul coperchio per spostare il mezzo in eccesso e le bolle d'aria lontano dal tessuto e fuori dal coperchio e l'aria secca.
19. Valutare e valutare i risultati della colorazione al microscopio invertito con un patologo esperto.
    NOTA: Il sistema di punteggio dipenderà dagli antigeni specifici, per i quali le informazioni nella letteratura potrebbero già esistere. Se le informazioni non sono disponibili in letteratura, derivare un sistema di punteggio utilizzando l'espressione dell'antigene nel tessuto normale come riferimento.

Risultati

Il flusso di lavoro di studio è illustrato nella Figura 1. Il sequenziamento di 5 casi SPN mirati alle sequenze di codifica di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in 8 geni (CTNNB1, KDM6A, BA1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1e FGFR3). Le mutazioni sono state definite come fondatore/clonale quando condivise tra tutte le lesioni di un determinato paziente e progressor/subclonali quando...

Discussione

Il nostro metodo consente l'identificazione delle alterazioni molecolari coinvolte nella progressione dei tumori solidi attraverso l'integrazione di dati verticali (ad esempio, morfologia, sequenziamento del DNA e immunosofologia) da lesioni distinte di un determinato paziente. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro metodo di rilevare eventi clonali e subclonali in un tipo di tumore silenzioso mutazionale (cioè SPN, neopolismo pseudoppillare del pancreas) interrogando le sequenze di codifica di 409 geni rilevanti pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Library quantification
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antibody
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antibody
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antibody
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antibody
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antibody
Blocking Solution	home made	-	5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution	home made	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 or A27766	Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 or A30011	Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 or A30011	Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 or A38196	Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 or 12532-024	SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	home made	-	Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinization reagent