JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تشكيل Presynapse هو عملية ديناميكية بما في ذلك تراكم البروتينات متشابك في الترتيب السليم. في هذه الطريقة، يتم تشغيل تشكيل presynapse بواسطة الخرز المترافق مع بروتين منظم presynapse على أوراق axonal من ثقافة "الكرة العصبية"، بحيث تراكم البروتينات متشابك من السهل تحليلها خلال تشكيل presynapse.

Abstract

خلال تطوير الخلايا العصبية، تشكيل المشبك هو خطوة هامة لإنشاء الدوائر العصبية. لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي، يجب توفير البروتينات متشابك في الترتيب المناسب عن طريق النقل من الهيئات الخلية و / أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة. ومع ذلك، فإنه ليس من المفهوم تماما كيف تتراكم البروتينات متشابك في نقاط الاشتباك العصبي في الترتيب السليم. هنا، نقدم طريقة جديدة لتحليل تشكيل presynaptic باستخدام مزيج من ثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse. كرات الخلايا العصبية التي هي المجاميع الخلايا العصبية توفر أوراق axonal بعيدا عن أجسام الخلايا وdendrites، بحيث يمكن الكشف عن إشارات الفلورسنت ضعيفة من presynapses عن طريق تجنب إشارات ساحقة من أجسام الخلايا. كما الخرز لتحريك تشكيل presynapse، ونحن نستخدم الخرز المترافق مع اللوين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2)، وهو منظم presynaptic مثير. باستخدام هذه الطريقة، أظهرنا أن الغلوتامات الحويصلي الناقل 1 (vGlut1)، وهو بروتين الحويصلة متشابك، المتراكمة في presynapses أسرع من Munc18-1، وهو بروتين منطقة نشطة. Munc18-1 المتراكمة الترجمة تعتمد في presynapse حتى بعد إزالة الهيئات الخلية. وتشير هذه النتيجة إلى تراكم Munc18-1 عن طريق الترجمة المحلية في المحاور، وليس النقل من أجسام الخلايا. في الختام، هذه الطريقة مناسبة لتحليل تراكم البروتينات متشابك في presynapses ومصدر البروتينات متشابك. كما ثقافة الكرة العصبية بسيطة وليس من الضروري استخدام جهاز خاص، يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على منصات تجريبية أخرى.

Introduction

تشكيل متشابك هو واحد من الخطوات الحاسمة أثناء تطوير الدوائر العصبية1،2،3. تشكيل نقاط الاشتباك العصبي التي هي مقصورات متخصصة تتكون من ما قبل وبعد نقاط الاشتباك العصبي هو عملية معقدة ومتعددة الخطوات تنطوي على الاعتراف المناسب للمحاور وdendrites، وتشكيل المنطقة النشطة وكثافة postynaptic، والمحاذاة المناسبة لل قنوات أيون ومستقبلات الناقل العصبي1,2. في كل عملية، تتراكم أنواع كثيرة من البروتينات متشابك إلى هذه المقصورات المتخصصة في توقيت مناسب عن طريق نقل البروتينات متشابك من أجسام الخلايا و / أو عن طريق الترجمة المحلية في المقصورات. وتعتبر هذه البروتينات متشابك ليتم ترتيبها بطريقة منظمة لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. خلل في بعض البروتينات متشابك التي تنطوي على تكوين متشابك يؤدي إلى الأمراض العصبية4,5. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف تتراكم البروتينات متشابك في التوقيت المناسب.

للتحقيق في كيفية تراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة، فمن الضروري لدراسة تراكم البروتينات متشابك في الترتيب الزمني. وأظهرت بعض التقارير التصوير الحي لمراقبة تشكيل متشابك في ثقافة منفصلة من الخلايا العصبية6،7. ومع ذلك، فإنه من يستغرق وقتا طويلا للعثور على الخلايا العصبية التي تبدأ للتو تشكيل متشابك تحت الفحص المجهري. لمراقبة تراكم البروتينات متشابك بكفاءة، يجب أن يبدأ تشكيل متشابك في الوقت الذي يريد الباحثون للحث على تشكيل. والتحدي الثاني هو التمييز بين تراكم البروتينات المتشابكة بسبب النقل من أجسام الخلايا أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي. ولهذا الغرض، من الضروري قياس مستوى الترجمة في ظل شرط لا يسمح بنقل البروتينات المتشابكة من أجسام الخلايا.

قمنا بتطوير رواية presynapse تشكيل التبيّن باستخدام مزيج منثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse 8. تم تطوير ثقافة الكرة العصبية لفحص النمط الظاهري المحاور، وذلك بسبب تشكيل أوراق axonal المحيطة الهيئات الخلية9،10. استخدمنا الخرز المغناطيسي المترافق مع اللوشأنهين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2) وهذا هو منظم presynaptic للحث على presynapses الإثارة (الشكل1A)11،12،13. باستخدام الخرز LRRTM2، يبدأ تشكيل presynapse في الوقت الذي يتم فيه تطبيق الخرز. وهذا يعني أن تشكيل presynapse يبدأ في الآلاف من محاور الكرة العصبية في نفس الوقت، وبالتالي فإنه يسمح لدراسة مسار زمني دقيق من تراكم البروتينات متشابك بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الكرة العصبية من السهل منع نقل البروتينات متشابك من سوما عن طريق إزالة الهيئات الخلية (الشكل1B)8. وقد أكدنا بالفعل أن المحاور التي لا تحتوي على أجسام خلوية يمكن أن تبقى على قيد الحياة وأنها صحية على الأقل 4 ساعة بعد إزالة أجسام الخلايا. وهكذا، فإن هذا البروتوكول مناسب للتحقيق من حيث يتم اشتقاق البروتينات متشابك (جسم الخلية أو محور عصبي)، وكيف تتراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة.

Protocol

أجريت التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة وفقاً للمبادئ التوجيهية المبينة في اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة مدينة يوكوهاما.

1. إعداد كرات الخلايا العصبية كما شنقا انخفاض الثقافة (أيام في المختبر (DIV) 0-3)

ملاحظة: تستند الإجراءات الموضحة هنا لإعداد ثقافة الكرة العصبية على الطريقة التي سبق أن أبلغت عنها مجموعة ساساكي مع بعض التعديلات9و10. كما اعتمدنا عدة إجراءات من طريقة المصرفي للثقافة المنفصلة14.

  1. تأكيد ما يلي قبل بدء تشريح
    1. إعداد جميع الحلول المطلوبة وتعقيمها عن طريق الأوتوكلاف / الترشيح مقدما.
    2. الحفاظ على استعداد جميع الأدوات والمواد لاستخدامها في كل خطوة من هذه الثقافة الخلايا العصبية القشرية.
    3. رش ومسح مجلس الوزراء تدفق الهواء laminar، طاولة تشريح، لوحة مرحلة من مجهر مجسم، مقص، وملقط مع الإيثانول 70٪.
  2. قتل الفأر عند تطبيق CO2 وتشريح البطن للحصول على الأجنة E16.
  3. إزالة العقول من الأجنة بعناية مع مساعدة من نصائح غرامة من الملقط ونقلها إلى 60 ملم أطباق زراعة الخلايا التي تحتوي على 4 مل من محلول الملح المخزنة HEPES (HBSS).
    ملاحظة: يحتوي التشريح الأوسط HBSS على 10 مليون متر من حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، و140 مليون مترمن كل+، و5.4مليون متر مربع، و1.09 مليون متر مربع، و1.09 مليون متر مربع، و1.1 مليون متر مربع، و1.1 مليون متر مربع، و1.6 مليون متر من السكر في الدم، و5.64 مليون متر من اللون الفينول الأحمر.
  4. إزالة فروة الرأس، وقطع لمبة الشم، والقشرية منفصلة من كل نصف الكرة الدماغي باستخدام نصائح غرامة من ملقط تحت مجهر ستيريو، ونقل إلى أطباق أخرى 60 ملم تحتوي على HBSS الطازجة. استخدام ما لا يقل عن 3-5 الأجنة لكل ثقافة الكرة العصبية منفصلة.
  5. قطع القشرية إلى قطع صغيرة مع مقص الربيع microdissecting في غطاء غطاء ثقافة الخلية تدفق laminar.
  6. نقل القشريات المفرومة إلى أنبوب 15 مل وtrypsinize القشرية المفرومة في 4 مل من 0.125٪ تريبسين في HBSS لمدة 4.5 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذا الوقت trypsinization أمر بالغ الأهمية لثقافة الخلايا العصبية الفعالة كما الوقت المتزايد (> 4.5 دقيقة) يؤدي إلى الخلايا العصبية أكثر من ذلك بكثير ميتة.
  7. نقل المجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 مل تحتوي على 10 مل من HBSS بواسطة ماصة نقل معقمة، وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. نقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 مل يحتوي على 2 مل من وسائل الإعلام العصبية التي تحتوي على GlutaMax، الملحق B27 (NGB المتوسطة)، 0.01٪ DNase الأول و 10٪ مصل الحصان.
  9. Triturate القشرية trypsinized عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا لهم صعودا وهبوطا (3-5 مرات) باستخدام النار مصقول الزجاج غرامة باستور ماصة.
    ملاحظة: قطر الزجاج غرامة مصقول النار باستور ماصة مهم جدا كما هو موضح في ورقة طريقة المصرفي14. إذا كانت الماصة ضيقة جدا ً بحيث لا يمكن تمريرها من القشرية، قم بإعداد الماصات التي تمتلك 2-3 أحجام مختلفة، وحاول من ماصة أكبر.
  10. لإعداد كرات الخلايا العصبية، واتخاذ تعليق الخلية أعلاه وضبط كثافة الخلية إلى 1 × 106 خلايا / مل باستخدام NGB المتوسطة.
  11. ثقافة الخلايا العصبية القشرية كما قطرات معلقة تحتوي على 10،000 خلية / قطرة (1 قطرة هو 10 درجة مئوية) داخل الأغطية العليا من 10 سم أطباق الثقافة.
  12. إضافة 7 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) إلى الجزء السفلي من أطباق الثقافة، ثم تبقى في حاضنة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 تحت حالة ترطيب للسماح لتشكيل الكرة العصبية.

2. وضع كرات الخلايا العصبية على الأغطية الزجاجية المغلفة PLL وصيانة الثقافة (DIV 3-11)

ملاحظة: قبل طلاء الأغطية الزجاجية مع بولي-L-يسين (PLL)، وغسل الأغطية باستخدام المنظفات أمر مهم. الأغطية الزجاجية في بعض الأحيان ليست نظيفة جدا للثقافة العصبية وطلاء موحد مع PLL. طلاء PLL غير موحدة قد يؤدي إلى تمديد axonal متفاوتة من كرات الخلايا العصبية.

  1. نقع الأغطية في 1/20 المخففة محايدة غير الفوسفور المنظفات في رفوف السيراميك لمدة 1-3 ليلة.
  2. اغسل الأغطية 8 مرات في الماء النقي، ثم قم بالتعقيم في فرن عند 200 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    ملاحظة: يجب أن يتم جميع الخطوات من هنا في غطاء محرك السيارة ثقافة تدفق الهواء laminar.
  3. نقل الأغطية المخبوزة إلى أطباق من عيار 100 ملم. بعد ختم الطبق بواسطة parafilm بين غطاء وطبق أسفل، يمكن الاحتفاظ الأغطية المخبوزة للتخزين على المدى الطويل.
  4. (اختياري) تطبيق النقاط البارافين على الأغطية. النقاط تجعل مساحة لمنع كرات الخلايا العصبية فصل من الأغطية أثناء تلطيخ المناعة عن طريق الاتصال المباشر من كرات الخلايا العصبية إلى الأطباق البلاستيكية. تذوب البارافين في زجاجة مناسبة في حمام الماء الساخن في حوالي 90 درجة مئوية. تراجع ماصة باستور في البارافين، ثم لمسها بسرعة لجعل ثلاثة بقع بالقرب من حافة غطاء.
  5. معطف PLL (MW > 300,000) على الأغطية الزجاجية مطرز بالبارافين في أطباق 60 ملم باستخدام محلول PLL (15 ميكروغرام /مل في المخزن المؤقت)، والاحتفاظ بها لمدة ساعة واحدة على الأقل في حاضنة CO 2.
  6. بعد غسل 4 مرات مع PBS، نقل الأغطية المغلفة PLL إلى لوحة 4-جيدا تحتوي على 350 ميكرولتر من وسائل NGB في كل بئر والسيتوسين β-D-أرابينوفيورنوسيد هيدروكلوريد (AraC، 3 μM) إلى وسائل الإعلام لقتل الخلايا الفاصلة.
  7. الحفاظ على هذه اللوحة 4 جيدا تحتوي على الأغطية المغلفة PLL في حاضنة CO2 على الأقل لمدة 20 دقيقة لضمان درجة حرارة متوسطة تصل إلى 37 درجة مئوية قبل نقل كرات الخلايا العصبية.
  8. في DIV 3 عندما يتم تشكيل "كرات الخلايا العصبية" بشكل جيد جدا، نقلها على الأغطية المغلفة PLL داخل لوحة 4 جيدا (5 كرات الخلايا العصبية / جيدا) أبقى في حاضنة CO 2.
  9. بعد 48 ح، استبدال وسط ثقافة الكرة العصبية مع الطازجة AraC خالية من NGB المتوسطة. استخدام لوحة ساخنة في غطاء غطاء ثقافة تدفق الهواء laminar الذي يتم الاحتفاظ درجة الحرارة جاهزة في 37 درجة مئوية مباشرة قبل هذا الإجراء.
    ملاحظة: من الضروري أداء المتوسط المتغير في أسرع وقت ممكن على لوحة ساخنة لتقليل الوقت الذي تكون فيه الثقافات في الخارج من حاضنة CO 2.
  10. الحفاظ على هذه الثقافة الكرة العصبية في حاضنة CO2 لمدة تصل إلى DIV 11.
    ملاحظة: في DIV 11-12، يتم استخدام كرات الخلايا العصبية تمديد النيورايتات تصل إلى 1-2 ملم للتجارب.

3. تطبيق الخرز LRRTM2 على ثقافة الكرة العصبية مع أو بدون الهيئات الخلية (DIV 11-12)

ملاحظة: قبل تطبيق الخرز LRRTM2 على ثقافة الكرة العصبية، فمن المستحسن لإزالة الهيئات الخلية. لذلك، إعداد الخرز LRRTM2 في البداية، ثم إزالة الهيئات الخلية وتطبيق في وقت لاحق الخرز LRRTM2 للثقافة في أقرب وقت ممكن. يتم توفير LRRTM2 Biotinylated من قبل مجموعة نوجي (جامعة مدينة يوكوهاما) كوسيلة مكيفة. أنها تستخدم ناقلات التعبير بما في ذلك تسلسل قبول البيوتين والرباط ية البيوتين من E. كولاي (بيرا) هل من أحد 15 , 16 لإرفاق البيوتين LRRTM2، ويتم نقل متجه التعبير إلى خلايا Expi293F المضمنة في نظام التعبير Expi293. وتتوافر معلومات المتجهات في الشكل التكميلي1. Biotinylated LRRTM2-مترافق الخرز streptavidin يقلل من خلفية من تلطيخ المناعة إلى حد كبير بالمقارنة مع LRRTM2-Fc - البروتين المترافق الخرز A التي تستخدم لنموذج LRRTM2 نظام8.

  1. إعداد حبات LRRTM2 biotinylated
    1. لإزالة البيوتين الزائد من المتوسطة المكيفة من خلايا Expi293F التي تعبر عن LRRTM2 biotinylated، وتطبيق 1.7 مل من المتوسطة مكيفة مختلطة مع 0.8 مل من PBS (المجموع 2.5 مل) إلى PD-10 عمود الترشيح هلام. يتم تقويم عمود PD-10 مسبقًا مع 25 مل من المياه النقية و25 مل من PBS.
    2. Elute مع 3.5 مل من PBS وجمع تدفق من خلال كمخزون LRRTM2.
      ملاحظة: يمكن الاستغناء عن هذا المخزون LRRTM2 إلى aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية على المدى الطويل. مستويات التعبير من LRRTM2 biotinylated تختلف في بعض الأحيان من الكثير إلى الكثير. وهكذا، ينبغي تحديد حجم مناسب من الأسهم LRRTM2 لالتواء إلى الخرز لتشكيل presynapses بما فيه الكفاية على كرات الخلايا العصبية، عندما يتم استخدام الكثير جديد من الأسهم LRRTM2 في المرة الأولى.
    3. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الجسيمات المغناطيسية المغلفة بstreptavidin (القطر: 4-5 ميكرومتر) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تعطيل الخرز إلى جهاز مصنوع يدويا تعلق مع مغناطيس دائم النيوديميوم وغسل ثلاث مرات مع 100 درجة مئوية من PBS-MCBC في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل.
      ملاحظة: PBS-MCBC يحتوي على PBSبما في ذلك 5 مليون متر MgCl 2، 3 مليون متر CaCl2،0.1٪ BSA، و 0.1٪ كاملة EDTA خالية.
    4. بعد إزالة تماما PBS-MCBC من الخرز، إضافة حجم محدد مسبقا من الأسهم LRRTM2 (عادة 500-1000 درجة مئوية، انظر الملاحظة 3.1.2) إلى الخرز غسلها. تحضن الخليط باستخدام الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    5. غسل الخرز مرتين مع 100 درجة مئوية من PBS-MCBC، وفي وقت لاحق مع 100 درجة مئوية من NGB المتوسطة.
    6. إعادة تعليق الخرز LRRTM2 في 50 درجة مئوية من وسائل NGB لتطبيقها على ثقافة الكرة العصبية.
    7. استخدام نفس الإجراءات لإعداد حبات التحكم (التحكم السلبي) في أنبوب آخر للطرد المركزي الصغير باستثناء إضافة بروتينات biotinylated-LRRTM2.
  2. إزالة أجسام الخلايا من كرات الخلايا العصبية في DIV 11-12 وتطبيق الخرز LRRTM2
    1. تسمية الآبار من لوحة 4-جيدا باسم "جسم الخلية (+)" و "جسم الخلية (-)".
    2. قطع نهاية طرف أصفر في زاوية 45 درجة مع شفرة الحلاقة رش سابقا مع الإيثانول 70٪ تحت مجهر ستيريو (الشكل1B).
    3. وضع نهاية طرف أصفر على منطقة جسم الخلية من الكرة العصبية وإزالة الهيئات الخلية عن طريق شفط (الشكل1B).
    4. لتحديد كل حالة محددة من التجربة، تسمية الآبار مرة أخرى باسم "الخرز LRRTM2" و "الخرز التحكم".
    5. تطبيق LRRTM2 والخرز السيطرة على ثقافة الكرة العصبية، وغمر إلى الجزء السفلي من لوحات لمدة 1 دقيقة باستخدام المغناطيس الفريت لبدء تشكيل presynapse. هذا الإجراء يضمن لهبوط جميع الخرز في نفس الوقت. خاصة، فإنه سيكون فعالا لفترة قصيرة الحضانة (على سبيل المثال، 30 دقيقة و 1 ساعة) مع الخرز LRRTM2 بشكل متزامن.
    6. لإجراء تجارب الدورة الزمنية، قم بتسمية كل فصل بالإضافة إلى 0 دقيقة و30 دقيقة و1 ساعة و2 ساعة و4 ح و18 ساعة وتطبيق حبات LRRTM2 في الفترات الزمنية المشار إليها.
    7. بعد إضافة حبات LRRTM2، احتضان ثقافة الكرة العصبية مع الخرز لفترة محددة (0 دقيقة إلى 18 ساعة) لتشكيل presynapses.

4. تلطيخ المناعة والفحص المجهري

ملاحظة: إصلاح الخلايا لمدة 4 ساعة عن طريق الحضانة مع الخرز LRRTM2 في الظروف التجريبية مع وبدون أجسام الخلية، كما محاور تميل تدريجيا إلى الموت في غياب الهيئات الخلية بعد 4 ح. في حالة الوقت بالطبع مع الخرز LRRTM2، إصلاح الخلايا في الوقت المحدد المشار إليه.

  1. إصلاح وتلطيخ الخلايا العصبية في ثقافة الكرة العصبية بعد تشكيل presynapse مع الخرز LRRTM2
    1. إزالة NGB المتوسطة وإصلاح كرات الخلايا العصبية مع 4٪ PFA في PBS (250 درجة مئوية / جيدا) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم يغسل مع 500 ميكرولتر من PBS 4 مرات كل 5 دقائق.
    2. اغسل الخلايا الثابتة بـ TBS (ملحي مُسَنَع َتريس: 50 مم تريس-هكل (درجة الحموضة 7.3) و150 مم حمض الهيدروكلوريك) لأكثر من 5 دقائق.
    3. Permeabilize الخلايا / محاور من ثقافة الكرة العصبية مع TBS تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق.
    4. الحفاظ على الخلايا 1 ساعة لحجب مع حظر العازلة (0.1٪ تريتون X-100 و 5٪ NGS (مصل الماعز العادي) في TBS).
    5. حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية. المضادة للأرنب-vGlut1 (اللوتامات الحويصلي الناقل 1 (1:4000)) ومكافحة الماوس Munc18-1 (1:300) المخففة مع تخفيف الأجسام المضادة ليلا في 4 درجة مئوية.
    6. غسل الأغطية 4 مرات مع الفلورة المناعية (IF) العازلة (0.1٪ تريتون X-100 و 2٪ BSA في TBS) وحضانة لمدة 30 دقيقة مع فلوروفور (صبغ اليكسا) -مترافق الأجسام المضادة 2؛ مكافحة الماوس-IgG-اليكسا 555 (1:500)، ومكافحة الأرنب-IgG-اليكسا 488 (1:1000).
    7. وصمة عار نوى من الهيئات الخلية من الخلايا العصبية لمدة 5 دقائق مع 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI, 1 ميكروغرام / مل) في PBS.
    8. غسل الأغطية ثلاث مرات مع PBS ومن ثم جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي على 167 ملغ / مل بولي (الفينيل) الكحول و 6 ملغ / مل N-بروبيل جالات.
    9. تخزين الشرائح الزجاجية في الثلاجة في -20 درجة مئوية حتى الفحص المجهري. يمكن الكشف عن إشارات الفلورسنت للشرائح الزجاجية لمدة سنة واحدة على الأقل عندما يتم تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.
  2. التقاط الصور تحت المجهر الفلوري
    1. التقط تباين التداخل التفاضلي وصور IF تحت مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا CCD مبردة باستخدام عدسة غمر الزيت 60X. للحصول على برنامج الحصول على الصور، استخدم نظام المجهر المثبت على البرامج. استخدم Image J كبرنامج لتحليل الصور.
    2. قياس كثافة IF في presynapses في axon باستخدام الصيغة التالية؛ إذا كثافة منطقة الاهتمام على الخرز (ROI) - قبالة كثافة منطقة الخرز / كثافة Axonal على طول 20 ميكرومتر من الخرز – كثافة الخلفية. توفر هذه الكثافة نسبة مؤشر تراكم البروتين (الشكل4A). إنجاز القياسات على الصور الأصلية 16 بت باستخدام برنامج صورة J.
    3. لتحديد مستوى تراكم بروتين معين في presynapse الناجمة عن حبات LRRTM2، حدد دائما المنطقة بعيدا عن 2-مجال الرؤية أو أكثر وبصرف النظر عن جسم الخلية مع المجهر (60X).
      ملاحظة: اختيار المنطقة في الكرة العصبية للتصوير أمر بالغ الأهمية كما محاور كثيفة بالقرب من جسم الخلية ومحيط الكرة العصبية يمكن أن توفر محور واحد.
    4. لقياس دقيق، اختر 5-حقل axonal مختلفة (مسافة مماثلة من أجسام الخلية) / coverslip.
    5. الحفاظ على ظروف التصوير متطابقة في يوم مختلف وفي ما بين التجارب

النتائج

هنا، نعرض النتائج التمثيلية لتراكم البروتينات presynaptic في presynapses التي يسببها LRRTM2 من أوراق axonal من ثقافة الكرة العصبية. كبروتينات presynaptic، قمنا بتحليل البروتين الحويصلة المتشابكة المحفزة vGlut1 وبروتين المنطقة النشطة Munc18-1. كما درسنا مسار الوقت من تراكم vGlut1 و Munc18-1 في presynapses، والحصول على نتائج تشير...

Discussion

قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة تشكيل presynapse حفز مع LRRTM2-الخرز باستخدام ثقافة الكرة العصبية. حاليا، معظم اختبار تشكيل presynapse يشمل بولي-D-يسين (PDL) الخرز المغلفة والثقافة المنفصلة / غرفة microfluidic20،21،22. واحدة من مزايا هذه الطريقة هو LRRTM2 الخرز. في ح?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل جزئيا ً منحة المساعدة المقدمة للبحوث العلمية (KaKENHI) (C) (رقم 22500336، 25430068، 16K07061) (Y. Sasaki). نشكر الدكتور تيروكوزو نوجي والسيدة ماكيكو نيازاكي (جامعة مدينة يوكوهاما) على تقديم بروتين LRRTM2 البيوتيني. ونشكر أيضا هونامي أوتشي وري إيشي على المساعدة التقنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentDAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
mouse anti-Munc18-1BD Biosciences610336
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA)Nacalai Tesque01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)Nunc176740
Complete EDTA-freeRoche11873580001
cooled CCD cameraAndor TechnologyiXON3
CoverslipMatsunamiC015001Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC)Sigma-AldrichC1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I)Wako pure chemicals047-26771
Expi293 Expression SystemThermo Fisher ScientificA14635
Horse serumSigma-AldrichH1270
image acquisition softwareNikonNIS-element AR
Image analysis softwareNIHImage Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscopeNikonEclipse Ti-E
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Neurobasal mediaThermo Fisher Scientific#21103-049
Normal Goat Serum (NGS)Thermo Fisher Scientific#143-06561
N-propyl gallateNacalai Tesque29303-92
Paraformaldehyde (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000)Nacalai Tesque28359-54
poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
Prepacked Disposable PD-10 ColumnsGE healthcare17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1Synaptic Systems135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)Nacalai Tesque41506-04
Streptavidin-coated magnetic particlesSpherotech IncSVM-40-10diameter: 4-5 µm
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
TrypsinNacalai Tesque18172-94

References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 presynapse LRRTM2 X FMRP Munc18 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved