使用预突子形成测定使用预突子组织者珠和"神经元球"文化

摘要

预突生形成是一个动态过程,包括以适当的顺序积累突触蛋白。在这种方法中,前突子形成由与"神经元球"培养的正交片上与前突子组织者蛋白结合的珠子触发,因此在先发形成期间很容易分析突触蛋白的积累。

摘要

在神经元发育过程中,突触形成是建立神经回路的重要一步。要形成突触,突触蛋白必须通过从细胞体的传输和/或未成熟的突触中的局部翻译以适当的顺序提供。然而,它不完全了解突触蛋白如何积累在突触以适当的顺序。本文提出了一种利用神经元球培养与珠子结合来诱导前突触形成的新方法。神经元细胞聚集的神经元球提供远离细胞体和树突的斧状片,因此可以通过避免细胞体的压倒性信号来检测前突子的弱荧光信号。作为珠子来触发前突动的形成,我们使用珠子与富含亮氨酸的重复跨膜神经元2(LRRTM2)结合,这是一个兴奋的先发前的组织者。使用这种方法,我们证明了囊性谷氨酸输送剂1(vGlut1),一种突触性囊泡蛋白,在预突触中积累得比Munc18-1(一种活性区蛋白)快。Munc18-1 在切除细胞体后,在先行中积累翻译依赖性。这一发现表明Munc18-1通过局部平移在斧子中积累,而不是从细胞体传输。总之,该方法适用于分析突触前蛋白的积累和突触蛋白的来源。由于神经元球培养简单,无需使用特殊仪器,该方法可适用于其他实验平台。

引言

突触形成是神经回路1、2、3开发过程中的关键步骤之一。由突触前和突触后组成的专门隔间的形成是一个复杂和多步骤的过程,涉及适当识别斧子和树突,形成活动区和后突密度,以及正确对齐电位通道和神经递质受体1,2。在每个过程中,许多种类的突触蛋白通过从细胞体中运输突触蛋白和/或通过隔间中的局部翻译,在适当的时间积累到这些专用隔间。这些突触蛋白被认为是以有组织的方式排列,以形成功能性突触。一些突触蛋白的机能导致神经疾病4,5。然而,目前还不清楚突触蛋白是如何在适当的时间积累。

为了研究突触蛋白如何以有组织的方式积累,有必要按时间顺序检查突触蛋白的积累。一些报告演示了实时成像,以观察神经元^分离培养的突触形成6,7。然而,它是费时的神经元,刚刚开始在显微镜下突触形成。为了有效地观察突触蛋白的积累,突触的形成必须在研究人员想要诱导形成的时候开始。第二个挑战是区分突触蛋白的积累,由于从细胞体或突触中的局部翻译。为此,翻译水平是必要的,在不允许从细胞体运输突触蛋白的条件下进行测量。

我们利用神经元球培养物与珠子的结合,开发出了新型的先发性形成测定,以诱导前突子形成8。神经元球培养是开发来检查斧状表型,由于形成围绕细胞体的斧板9,10。我们使用磁珠与富含亮氨酸的重复跨膜神经元2(LRRTM2)结合,这是一个前突触组织者诱导兴奋前突触(图1A)11,12,13。通过使用 LRRTM2 磁珠,在应用磁珠时开始预突子形成。这意味着,前突子的形成开始于神经元球的千个斧子在同一时间,因此它允许有效地检查突触蛋白积累的精确时间过程。此外,神经元球培养很容易通过去除细胞体来阻止从体中传递突触蛋白(图1B)8。我们已经证实,没有细胞体的斧子可以存活,并在去除细胞体后至少4小时健康。因此,此方案适用于研究突触蛋白的衍生位置(细胞体或斧子),以及突触蛋白如何以有组织的方式积累。

研究方案

本手稿中描述的实验是根据横滨城市大学机构动物护理和使用委员会概述的准则进行的。

1. 神经元球作为悬垂培养物的准备(天体外(DIV) 0-3)

注:此处描述的神经元球培养制备过程基于Sasaki组先前报告的方法,并作了一些修改9,10。我们还从Banker方法中采用了几种程序来分离^文化14。

1. 在开始解剖之前确认以下内容
   1. 准备所有必需的解决方案,并提前通过高压灭菌器/过滤进行消毒。
   2. 准备好所有仪器和材料,用于这个皮质神经元培养的每个步骤。
   3. 用70%乙醇喷洒和擦拭层气流柜、解剖台、立体显微镜、剪刀和钳子的阶段板。
2. 在应用CO2时对小鼠实施安乐死,并解剖腹部以获得E16胚胎。
3. 在钳子细尖的帮助下,小心地从胚胎中取出大脑,并将其转移到含有4 mPS缓冲盐溶液(HBSS)的60毫米细胞培养皿中。
   注: 解剖介质 HBSS 包含 10 mM HEPES (pH 7.4)、 140 mM NaCl、 5.4 mM KCl、1.09 mM Na₂HPO₄、 1.1 mM KH 2 PO₄、 5.6 mM D-葡萄糖和 5.64 μM 苯酚红色。
4. 取出头皮,切断嗅球,使用立体显微镜下钳子的细尖从每个大脑半球分离皮质,并转移到另一个含有新鲜HBSS的60毫米菜肴。为每个单独的神经元球培养使用至少 3-5 个胚胎。
5. 在层状流动细胞培养罩中用微解剖弹簧剪刀将皮质切成小块。
6. 将切碎的皮质转移到15 mL管中,在HBSS中的4mL 0.125%胰蛋白酶中胰蛋白酶中胰小皮草,在37°C的水浴中4.5分钟。
   注:此胰蛋白酶化时间对于有效的神经元培养至关重要,因为增加的时间(> 4.5 分钟)会导致更多的死神经元。
7. 通过无菌转移移液器将细胞聚集体转移到含有10 mSS的15 mL新管中,并在37°C下孵育5分钟。
8. 将细胞聚集体转移到一个新的15 mL管,含有2 mL的神经巴管,含有GlutaMax,B27补充剂(NGB介质),0.01%DNase I和10%马血清。
9. 使用火抛光的细玻璃巴斯德移液器反复上下移液(3-5次),对胰蛋白酶化皮质进行三聚化。
   注:如Banker方法^第14号文件所述,火抛光细玻璃巴斯德移液器的直径非常重要。如果移液器太窄,无法通过皮质,请准备具有 2-3 个不同尺寸的移液器,并尝试从较大的移液器。
10. 为了准备神经元球,采取上述细胞悬浮液,并使用NGB培养基将细胞密度调整到1 x 10⁶细胞/mL。
11. 在10厘米培养皿的上盖内,将皮质神经元培养为含有10,000个细胞/滴(1滴为10μL)的挂滴。
12. 在培养皿的底部加入7 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS),然后在37°C下在培养箱中保存3天,在加湿条件下将5%的CO2保持,以允许神经元球的形成。

2. 将神经元球放置在 PLL 涂层玻璃盖上,并维护培养物 (DIV 3-11)

注:在用聚-L-莱辛 (PLL) 涂覆玻璃盖玻片之前,使用洗涤剂清洗盖玻片非常重要。玻璃盖玻片有时不太干净,用于神经元培养和PLL均匀涂层。不均匀的PLL涂层可能导致神经元球的不平衡的等向延伸。

1. 将盖玻片浸泡在陶瓷架中1⁄20稀释中性非磷洗涤剂中,1-3过夜。
2. 在超纯水中清洗盖玻片8次,然后在200°C的烤箱中消毒12小时。
   注:此处的所有步骤都必须在层压空气流细胞培养罩中完成。
3. 将烤盖片转移到 100 毫米的盘子中。在盖和底盘之间用底膜密封盘子后,可保存烘焙盖玻片,以便长期存放。
4. (可选)将石蜡点涂到盖玻片上。这些点使空间,以防止神经元球从覆盖物分离免疫染色期间,通过神经元球直接接触到塑料盘子。将石蜡融化在适当的瓶子中,在热水浴中,温度约为90°C。将巴斯德移液器浸入石蜡中,然后快速触摸,使其在盖玻片边缘附近产生三个斑点。
5. 使用 PLL 溶液(硼酸盐缓冲液中为 15 μg/mL)将 PLL (MW& gt; 300,000) 涂在 60 mm 的餐具中,并将其保存在 CO₂培养箱中至少 1 小时。
6. 使用PBS洗涤4次后,将PLL涂层盖片转移到含有350μLNGB介质的4孔板中,每个孔中含有350μL的NGB介质,并将细胞氨酸β-D-阿拉伯盐酸(AraC,3μM)转移到介质上,以杀死分裂细胞。
7. 在 CO2 培养箱中至少保持含有 PLL 涂层盖玻片的 4 孔板至少 20 分钟,以确保介质的温度在转移神经元球之前达到 37°C。
8. 在DIV 3,当"神经元球"形成良好时,将它们转移到保存在CO2培养箱中的4孔板(5个神经元球/孔)内的PLL涂层盖玻片上。
9. 48小时后,用新鲜的无AraC NGB介质替换神经元球培养基。在手术后,在层气细胞培养罩中使用热板,其温度保持在37°C。
   注:有必要在热板上尽可能快地进行介质变化,以减少培养物在CO2培养箱外部的时间。
10. 将这种神经元球培养在 CO₂培养箱中,最多为 DIV 11。
    注:在DIV 11-12,神经元球将中性光酸盐延长到1-2毫米用于实验。

3. 在有或没有细胞体的神经元球培养上应用LRRTM2珠(DIV 11-12)

注:在将LRRTM2珠子应用于神经元球培养之前,建议去除细胞体。因此,首先制备LRRTM2珠子,然后取出细胞体,然后尽早将LRRTM2珠子应用到培养中。生物仿当LRRTM2由Nogi集团(横滨城市大学)作为有条件的介质提供。他们使用表达载体,包括生物锡接受器序列和来自E的生物锡连带。大肠杆菌(比拉)^15,16将生物子锡附于 LRRTM2,并将表达载体转染为 Expi293 表达系统中的 Expi293F 细胞。矢量信息可在补充图 1中提供。与用于原型LRRTM2^系统8的LRRTM2原型蛋白A珠相比,生物浸化的LRRTM2-结合链球蛋白珠子的免疫染色背景大大降低。

1. 生物酸酯LRRTM2珠子的制备
   1. 为了去除Expi293F细胞中表达生物浸化LRRTM2的多余生物锡,将1.7 mL的调节介质与0.8 mL的PBS(共2.5 mL)混合在PD-10凝胶过滤柱上。PD-10 柱与 25 mL 的超纯水和 25 mL 的 PBS 预平衡。
   2. 具有 3.5 mL 的 PBS,并收集作为 LRRTM2 库存的流通。
      注:此 LRRTM2 库存可分配至等分,并长期储存在 -80°C。生物酸酯LRRTM2的表达水平有时因批次而异。因此,当第一次使用新的LRRTM2库存时,应确定适当体积的LRRTM2库存与珠子结合,以形成足够的神经元球前突子。
   3. 从链球菌涂层磁性颗粒(直径:4-5 μm)的悬浮液到微离心管中取20μL。将珠子固定到手工仪器上,用钛永磁体连接,在1.5 mL微离心管中用100μL的PBS-MCBC清洗三次。
      注: PBS-MCBC 包含 PBS,包括 5mM MgCl 2、 3 mM CaCl₂、 0.1% BSA 和 0.1% 完全 EDTA 无。
   4. 从珠子中完全去除PBS-MCBC后,将预定体积的LRRTM2库存(通常为500-1,000μL,见注3.1.2)添加到洗涤的珠子中。在4°C下使用旋转器孵育混合物1-2小时。
   5. 用100μL的PBS-MCBC清洗珠子两次,然后用100μL的NGB介质清洗。
   6. 在NGB培养基的50μL中重新悬浮LRRTM2珠子,以应用于神经元球培养。
   7. 使用相同的程序在另一个微离心管中制备控制珠(阴性控制),但添加生物异位-LRRTM2蛋白除外。
2. 在 DIV 11-12 处从神经元球中去除细胞体并应用 LRRTM2 珠子
   1. 将 4 孔板的孔标为"细胞体 (+)"和"细胞体 (-)"。
   2. 用剃刀刀片在立体显微镜下用70%乙醇喷洒的剃刀,以45°角切割黄色尖端的尾声(图1B)。
   3. 将黄色尖端端放在神经元球的细胞体区域上,然后通过吸力去除细胞体(图1B)。
   4. 要识别实验的每个指定条件,请再次将井标为"LRRTM2 珠子"和"控制珠子"。
   5. 在神经元球培养上应用LRRTM2和控制珠子,使用铁氧体磁铁在板底浸入1分钟,开始前突触形成。此过程可确保同时触摸所有珠子。特别是,它对于与LRRTM2珠同步进行短时间孵育(例如30分钟和1小时)是有效的。
   6. 要执行时间过程实验,请分别标记每个单独和 0 分钟、30 分钟、1 小时、2 小时、4 小时和 18 小时,并在指定的时间间隔应用 LRRTM2 磁珠。
   7. 添加LRRTM2珠子后,用珠子孵育神经元球培养物,在指定时间内(0分钟至18小时)形成前突子。

4. 免疫染色和显微镜

注:在有细胞体和无细胞体的实验条件下,通过LRRTM2珠子通过孵育将细胞修复4小时,因为斧头在4小时后没有细胞体的情况下会逐渐死亡。在时间过程与LRRTM2珠,修复细胞在指定的指定时间。

1. 使用LRRTM2珠子形成前突子后,修复和染色神经元球培养
   1. 在室温下,取出NGB介质,用4%PFA固定神经元球(250μL/井),20分钟,然后用500μL的PBS洗涤4次,每5分钟。
   2. 使用 TBS(三分缓冲盐水:50 mM Tris-HCl (pH 7.3) 和 150 mM NaCl)清洗固定电池超过 5 分钟。
   3. 用TBS渗透神经元球培养的细胞/斧子,在5分钟内含有0.3%Triton X-100。
   4. 保持细胞1小时,以阻止与阻塞缓冲液(0.1%Triton X-100和5%NGS(正常山羊血清)在TBS中。
   5. 用原抗体孵育细胞;抗兔-vGlut1(谷氨酸转运剂1(1:4000))和抗小鼠-Munc-18-1(1:300)用抗体稀释剂在4°C过夜。
   6. 用免疫荧光 (IF) 缓冲液(TBS 中 0.1% Triton X-100 和 2% BSA)清洗覆盖唇 4 次,用荧光素(Alexa 染料)结合的第二抗体孵育 30 分钟;抗小鼠-IgG-Alexa 555 (1:500),抗兔子-IgG-Alexa 488 (1:1000)。
   7. 在PBS中用4°,6-二酰胺-2-苯林多(DAPI,1微克/mL)染色神经元细胞体核5分钟。
   8. 用 PBS 清洗盖玻片三次,然后使用含有 167 mg/mL 聚酯(乙烯基)酒精和 6 mg/mL N-丙基电酸盐的安装介质安装在玻璃玻片上。
   9. 将玻璃玻片储存在-20°C的冰箱中,直到显微镜。当玻璃玻片储存在-20°C时,玻璃玻片的荧光信号可检测到至少1年。
2. 在荧光显微镜下拍摄图像
   1. 使用 60X 油浸透镜在倒置荧光显微镜下使用冷却 CCD 相机捕获差分干扰对比度和 IF 图像。对于图像采集软件,请使用软件安装的显微镜系统。使用图像 J 作为图像分析软件。
   2. 使用以下公式测量斧突中前突子中的 IF 强度;珠子上感兴趣区域的IF强度 = 离珠区域强度/从珠子20 μm的离心区域强度+背景强度。此比例强度提供蛋白质积累指数 (图 4A)。使用 Image J 软件完成原始 16 位图像的测量。
   3. 要量化使用LRRTM2珠诱导的先增酶中特定蛋白质的积累水平,始终使用显微镜(60X)选择远离2个视场的区域或以上区域。
      注:选择神经元球中的成像区域至关重要,因为密集的斧子靠近细胞体,神经元球的外围可以提供单个斧子。
   4. 要进行精确测量,请选择 5 个不同的等子场(与细胞体的距离相似)/盖玻片。
   5. 在实验的不同天和两者之间保持相同的成像条件

结果

在这里,我们展示了在神经元球培养的斧板的LRRTM2诱导前突触中预突触蛋白的积累代表性的结果。作为前突触蛋白,我们分析了兴奋性突触性囊泡蛋白vGlut1和活性区蛋白Munc18-1。我们还研究了前突子中vGlut1和Munc18-1积累的时间过程,并利用去突子去除细胞体和蛋白质合成抑制剂的突厥前Munc18-1来源得到结果。最近,我们研究了脆弱X智力迟钝蛋白(FMRP)在预突^子8中Munc18-1的积累作用。FMRP是?...

讨论

我们开发了利用神经元球培养法检测用LRRTM2-珠刺激的先增前形成的方法。目前,大多数前突生形成测定包括多-D-流源(PDL)涂层珠和分离培养/微流体室20,21,22。该方法的优点之一是LRRTM2珠子。当LRRTM2与神经素相互作用,形成兴奋的先阴突子,特别是11,12,13,PDL-珠诱导兴奋和抑制预突生非^<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
mouse anti-Munc18-1	BD Biosciences	610336
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA)	Nacalai Tesque	01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)	Nunc	176740
Complete EDTA-free	Roche	11873580001
cooled CCD camera	Andor Technology	iXON3
Coverslip	Matsunami	C015001	Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)	Nacalai Tesque	11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I)	Wako pure chemicals	047-26771
Expi293 Expression System	Thermo Fisher Scientific	A14635
Horse serum	Sigma-Aldrich	H1270
image acquisition software	Nikon	NIS-element AR
Image analysis software	NIH	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Neurobasal media	Thermo Fisher Scientific	#21103-049
Normal Goat Serum (NGS)	Thermo Fisher Scientific	#143-06561
N-propyl gallate	Nacalai Tesque	29303-92
Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai Tesque	26126-25
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000)	Nacalai Tesque	28359-54
poly (vinyl alcohol)	Sigma	P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns	GE healthcare	17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1	Synaptic Systems	135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)	Nacalai Tesque	41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles	Spherotech Inc	SVM-40-10	diameter: 4-5 µm
TritonX-100	Nacalai Tesque	35501-15
Trypsin	Nacalai Tesque	18172-94