Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"

Resumen

La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de "bola de neurona", por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.

Resumen

Durante el desarrollo neuronal, la formación de sinapsis es un paso importante para establecer circuitos neuronales. Para formar sinapsis, las proteínas sinápticas deben suministrarse en el orden adecuado mediante el transporte desde cuerpos celulares y/o la traducción local en sinapsis inmaduras. Sin embargo, no se entiende completamente cómo las proteínas sinápticas se acumulan en las sinapsis en el orden correcto. Aquí, presentamos un método novedoso para analizar la formación presináptica mediante el uso de la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis. Las bolas neuronales que son agregados de células neuronales proporcionan hojas axonales lejos de los cuerpos celulares y dendritas, de modo que las señales fluorescentes débiles de las presinapciones pueden detectarse evitando señales abrumadoras de cuerpos celulares. Como perlas para desencadenar la formación de presinapsis, utilizamos cuentas conjugadas con la repetición de leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), un organizador presináptico excitatorio. Usando este método, demostramos que el transportador de glutamato vesicular 1 (vGlut1), una proteína de vesícula sináptica, acumulada en presinapciones más rápido que Munc18-1, una proteína de zona activa. Munc18-1 acumuló la traducción dependiente en la presinapsis incluso después de eliminar los cuerpos celulares. Este hallazgo indica la acumulación munc18-1 por traducción local en axónes, no el transporte desde cuerpos celulares. En conclusión, este método es adecuado para analizar la acumulación de proteínas sinápticas en presinapis y fuente de proteínas sinápticas. Como el cultivo de bolas de neuronas es simple y no es necesario utilizar aparatos especiales, este método podría ser aplicable a otras plataformas experimentales.

Introducción

La formación de sinapsis es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de los circuitos neuronales^1,2,3. La formación de sinapsis especializadas compuestas por pre y post-sinapsis es un proceso complejo y multipaso que implica el reconocimiento adecuado de los axónes y dendritas, la formación de la zona activa y la densidad postsináptica, y la alineación adecuada de canales ióniónicos y receptores de neurotransmisores^1,2. En cada proceso, muchos tipos de proteínas sinápticas se acumulan en estos compartimentos especializados en el momento adecuado mediante el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares y / o por traducción local en los compartimentos. Estas proteínas sinápticas se consideran dispuestas de manera organizada para formar sinapsis funcionales. La disfunción de algunas proteínas sinápticas que implican la formación de sinapsis da como resultado enfermedades neurológicas^4,5. Sin embargo, sigue sin estar claro cómo se acumulan las proteínas sinápticas en el momento adecuado.

Para investigar cómo se acumulan las proteínas sinápticas de forma organizada, es necesario examinar la acumulación de proteínas sinápticas en orden cronológico. Algunos informes demostraron imágenes en vivo para observar la formación de sinapsis en el cultivo disociado de las neuronas^6,7. Sin embargo, es lento encontrar neuronas que simplemente comienzan la formación de sinapsis bajo microscopía. Para observar la acumulación de proteínas sinápticas eficientemente, la formación de sinapsis debe comenzar en el momento en que los investigadores quieren inducir la formación. El segundo desafío es distinguir la acumulación de proteínas sinápticas debido al transporte de los cuerpos celulares o la traducción local en sinapsis. Para ello, es necesario medir el nivel de traducción bajo la condición que no permite el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares.

Desarrollamos un nuevo ensayo de formación de presinapsis utilizando la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis⁸. El cultivo de la bola de neuronas se desarrolla para examinar el fenotipoaxonal, debido a la formación de láminas axonales que rodean los cuerpos celulares 9,^10. Utilizamos cuentas magnéticas conjugadas con la reacción transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) rica en leucina que es un organizador presináptico para inducir presinapciones excitatorias (Figura1A)^11,12,13. Mediante el uso de las perlas LRRTM2, la formación de presinapsivas comienza en el momento en que se aplican las perlas. Esto significa que la formación de presinapsis comienza en miles de axónes de una bola de neurona al mismo tiempo, por lo que permite examinar el curso preciso del tiempo de acumulación de proteínas sinápticas de manera eficiente. Además, el cultivo de bolas de neuronas es fácil de bloquear las proteínas sinápticas de transporte del soma mediante la eliminación de cuerpos celulares (Figura 1B)⁸. Ya hemos confirmado que los axons sin cuerpos celulares pueden sobrevivir y están sanos al menos 4 h después de la eliminación de los cuerpos celulares. Por lo tanto, este protocolo es adecuado para investigar de dónde se derivan las proteínas sinápticas (cuerpo celular o axón), y cómo se acumulan las proteínas sinápticas de manera organizada.

Protocolo

Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices descritas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso De Animales de la Universidad de la Ciudad de Yokohama.

1. Preparación de bolas de neuronas como cultivo de gota colgante (Días in vitro (DIV) 0-3)

NOTA: Los procedimientos descritos aquí para la preparación del cultivo de bolas de neuronas se basan en el método previamente reportado por el grupo Sasaki con algunas modificaciones^9,10. También adoptamos varios procedimientos del método banquero para la cultura disociada¹⁴.

1. Confirmación de lo siguiente antes de iniciar la disección
   1. Preparar todas las soluciones necesarias y esterilizarlas por autoclave/filtración de antemano.
   2. Mantener listo todos los instrumentos y materiales para ser utilizado en cada paso de este cultivo de neurona cortical.
   3. Rocíe y limpie el gabinete de flujo de aire laminar, la mesa de disección, la placa de escenario del estereomicroscopio, las tijeras y los fórceps con 70% de etanol.
2. Euthanizar el ratón tras la aplicación de CO₂ y diseccionar el abdomen para obtener embriones E16.
3. Retire los cerebros de los embriones cuidadosamente con la ayuda de puntas finas de fórceps y transfieralos a platos de cultivo celular de 60 mm que contengan 4 ml de solución de sal tamponada HEPES (HBSS).
   NOTA: El medio de disección HBSS contiene 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.09 mM Na₂HPO₄, 1.1 mM KH₂PO₄, 5.6 mM D-glucosa, y 5.64 mFenol rojo.
4. Retire el cuero cabelludo, corte la bombilla olfativa, separe los cortices de cada hemisferio cerebral usando las puntas finas de fórceps bajo estereomicroscopio, y transfiera a otros platos de 60 mm que contengan HBSS fresco. Utilice al menos 3-5 embriones para cada cultivo de bola de neurona separada.
5. Cortar los cortices en trozos pequeños con tijeras de resorte microdisselantes en una capucha de cultivo de celda de flujo laminar.
6. Transfiera los cortices picados a un tubo de 15 ml y intente trippsinizar los cortices picados en 4 ml de trippsina al 0,125% en HBSS durante 4,5 min en un baño de agua a 37 oC.
   NOTA: Este tiempo de trippsinización es crítico para el cultivo eficiente de neuronas ya que el tiempo creciente (> 4.5 min) conduce a neuronas mucho más muertas.
7. Transfiera los agregados de celda a un nuevo tubo de 15 ml que contenga 10 ml de HBSS mediante una pipeta de transferencia estéril e incubar a 37 oC durante 5 min. Repita este paso una vez más.
8. Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 ml que contenga 2 ml de medios neurobasales que contengan GlutaMax, suplemento B27 (medio NGB), 0,01% DNase I y 10% de suero de caballo.
9. Tritura rcíticos trippsinizados pipetándolos repetidamente hacia arriba y hacia abajo (3-5 veces) usando pipeta Pasteur de vidrio fino pulida al fuego.
   NOTA: El diámetro de la pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego es muy importante como se describe en el documento del método banquero¹⁴. Si la pipeta es demasiado estrecha para pasar cortices, prepare pipetas que posean 2-3 tamaños diferentes e intente con pipetas más grandes.
10. Para preparar las bolas de neuronas, tome la suspensión celular anterior y ajuste la densidad celular a 1 x 10⁶ células/ml usando un medio NGB.
11. Cultivo de las neuronas corticales como gotas colgantes que contienen 10.000 células / gota (1 gota es 10 l) dentro de los párpados superiores de los platos de cultivo de 10 cm.
12. Añadir 7 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) a la parte inferior de los platos de cultivo, luego mantener en una incubadora durante 3 días a 37 oC con 5% co₂ en condiciones humidificadas para permitir la formación de bolas de neuronas.

2. Colocación de bolas de neuronas en cubiertas de vidrio recubiertas de PLL y mantenimiento de cultivo (DIV 3-11)

NOTA: Antes de la recubrimiento de los revestimientos de vidrio con poli-L-lisina (PLL), es importante lavar los cubresítos con detergente. Los cubreobjetos de vidrio a veces no son tan limpios para el cultivo neuronal y un recubrimiento uniforme con PLL. Recubrimiento PLL no uniforme puede resultar en una extensión axonal desigual de las bolas de neuronas.

1. Remoje los cubreobjetos en 1/20 detergente neutro no fosforo diluido en estantes cerámicos durante 1-3 noches.
2. Lavar los labios de las cubiertas 8 veces en agua ultrapura, y luego esterilizar en un horno a 200 oC durante 12 h.
   NOTA: Todos los pasos desde aquí deben realizarse en una campana de cultivo de celda de flujo de aire laminar.
3. Transfiera los cubreobjetos horneados a platos de 100 mm. Después de sellar el plato por parafilm entre una tapa y un plato inferior, los cubreobjetos horneados se pueden mantener para su almacenamiento a largo plazo.
4. (Opcional) Aplicar puntos de parafina en las cubiertas. Los puntos hacen espacio para evitar que las bolas de neuronas se desprenden de las cubiertas durante la inmunomancha ción mediante el contacto directo de las bolas de neuronas a los platos de plástico. Derretir la parafina en una botella adecuada en un baño de agua caliente a unos 90 oC. Sumerja una pipeta Pasteur en la parafina, luego tóquela rápidamente para hacer tres puntos cerca del borde de una cubierta.
5. Recubrir PLL (MW > 300.000) sobre las cubiertas de vidrio con cuentas de parafina en platos de 60 mm utilizando la solución PLL (15 g/ml en tampón de borato) y guardarlos durante al menos 1 h en una incubadora de CO 2.
6. Después de lavar 4 veces con PBS, transfiera los cubrejos recubiertos de PLL a una placa de 4 pocillos que contenga 350 ol de medio NGB en cada pocil y la citosina-D-arabinofuranoside clorhidrato (AraC, 3 m) a los medios para matar las células divisorias.
7. Conservar esta placa de 4 pocillos que contiene los cubreobjetos recubiertos con PLL en la incubadora de CO₂ al menos durante 20 minutos para garantizar la temperatura del medio de alcanzar los 37 oC antes de transferir las bolas de neuronas.
8. En DIV 3 cuando las "bolas de neuronas" se forman muy bien, transferirlas a los cubredes recubiertos con PLL dentro de la placa de 4 pocillos (5 bolas de neuronas / bien) mantenido en la incubadora de CO 2.
9. Después de 48 h, reemplace el medio de cultivo de la bola de neurona con un medio NGB fresco libre de AraC. Utilice una placa caliente en una campana de cultivo de células de flujo de aire laminar cuya temperatura se mantenga lista a 37 oC inmediatamente antes de este procedimiento.
   NOTA: Es necesario realizar el cambio medio lo más rápido posible en una placa caliente para reducir el tiempo que los cultivos están en el exterior de la incubadora de CO 2.
10. Mantenga este cultivo de bolas de neuronas en la incubadora de CO₂ para hasta DIV 11.
    NOTA: En DIV 11-12, las bolas de neuronas que extienden neurites de hasta 1-2 mm se utilizan para experimentos.

3. Aplicación de perlas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neuronas con o sin cuerpos celulares (DIV 11-12)

NOTA: Antes de la aplicación de perlas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neuronas, se recomienda eliminar los cuerpos celulares. Por lo tanto, prepare las perlas LRRTM2 al principio, luego retire los cuerpos celulares y luego aplique cuentas LRRTM2 al cultivo tan pronto como sea posible. Biotinylated LRRTM2 es proporcionado por el grupo de Nogi (Universidad de la Ciudad de Yokohama) como medio acondicionado. Utilizan un vector de expresión que incluye la secuencia del aceptador de biotina y la ligasa de biotina de E. coli (BirA) ^{15 , 16} para unir biotina a LRRTM2, y el vector de expresión se transinfecta a las células Expi293F incluidas en el Sistema de Expresión Expi293. La información vectorial está disponible en la Figura Suplementaria 1. Las perlas de estriptavidina biodilatadas lRRTM2 reducen en gran medida el fondo de inmunomancha en comparación con las perlas de proteína A conjugadas lRRTM2-Fc que se utilizan para el prototipo del sistema LRRTM2⁸.

1. Preparación de perlas biotiniadas LRRTM2
   1. Para eliminar el exceso de biotina del medio acondicionado de las células Expi293F que expresan LRRTM2 biotiniladas, aplique 1,7 ml del medio acondicionado mezclado con 0,8 ml de PBS (total 2,5 ml) a la columna de filtración de gel PD-10. La columna PD-10 está preequilibrada con 25 ml de agua ultrapura y 25 ml de PBS.
   2. Eluir con 3,5 mL de PBS y recoger el flujo a través como un stock LRRTM2.
      NOTA: Esta acción LRRTM2 se puede dispensar en alícuotas y almacenarse a -80 oC a largo plazo. Los niveles de expresión de LRRTM2 biotinilado a veces varían de un lote a uno. Por lo tanto, el volumen adecuado de lRRTM2 stock para conjugar con las cuentas debe determinarse para formar presinapciones suficientes en bolas de neuronas, cuando se utiliza un nuevo lote de lRRTM2 stock en la primera vez.
   3. Tomar 20 l desde la suspensión de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina (diámetro: 4-5 m) a un tubo de microcentrífuga. Inmovilizar las perlas a un aparato hecho a mano unido con imanes permanentes de neodimio y lavar tres veces con 100 s de PBS-MCBC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: PBS-MCBC contiene PBS incluyendo 5 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 0.1% BSA, y 0.1% libre de EDTA completo.
   4. Después de retirar completamente PBS-MCBC de las perlas, agregue el volumen predeterminado de lRRTM2 (normalmente 500-1.000 l, véase la Nota 3.1.2) a las cuentas lavadas. Incubar la mezcla utilizando un rotador a 4oC durante 1-2 h.
   5. Lave las perlas dos veces con 100 ml de PBS-MCBC, y más tarde con 100 oL de medio NGB.
   6. Resuspenda las perlas LRRTM2 en un medio de 50 oL para su aplicación en el cultivo de la bola de neuronas.
   7. Utilice los mismos procedimientos para preparar las perlas de control (control negativo) en otro tubo de microcentrífuga, excepto añadir proteínas biotinicadas-LRRTM2.
2. Extracción de cuerpos celulares de las bolas de neuronas en DIV 11-12 y aplicación de cuentas LRRTM2
   1. Etiquetar los pocillos de una placa de 4 pocillos como "Cuerpo celular (+)" y "Cuerpo celular (-)".
   2. Corte el extremo de una punta amarilla en ángulo de 45o con una cuchilla de afeitar previamente rociada con 70% de etanol bajo estereomicroscopio (Figura1B).
   3. Coloque el extremo amarillo de la punta en el área del cuerpo celular de una bola de neurona y retire los cuerpos celulares por succión (Figura 1B).
   4. Para identificar cada condición especificada del experimento, etiquete los pozos de nuevo como "Perlas LRRTM2" y "Controlar perlas".
   5. Aplique el LRRTM2 y controle las perlas en el cultivo de la bola de neurona, y sumerja en la parte inferior de las placas durante 1 min usando imanes de ferrita para iniciar la formación de presinaptusis. Este procedimiento garantiza el touchdown de todas las cuentas al mismo tiempo. Especialmente, sería eficaz para la incubación de poco tiempo (por ejemplo, 30 min y 1 h) con perlas LRRTM2 sincrónicamente.
   6. Para realizar experimentos de curso de tiempo, etiquete cada uno de los valores separados de 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h y 18 h y aplique perlas LRRTM2 en los intervalos de tiempo indicados.
   7. Después de la adición de perlas LRRTM2, incubar el cultivo de la bola de neuronacon las cuentas durante un tiempo especificado (0 min a 18 h) para formar presinapciones.

4. Inmunomanchay y microscopía

NOTA: Fijar las células durante 4 h a través de la incubación con perlas LRRTM2 en las condiciones experimentales con y sin cuerpos celulares, ya que los axones tienden a morir gradualmente en ausencia de cuerpos celulares después de 4 h. En caso de curso de tiempo con perlas LRRTM2, fije las celdas en el tiempo especificado indicado.

1. Fijación y tinción de neuronas en el cultivo de bolas de neuronas después de la formación de presinapsivas con perlas LRRTM2
   1. Retire el medio NGB y fije las bolas de neuronas con 4% de PFA en PBS (250 l/bien) durante 20 minutos a temperatura ambiente, y luego lave con 500 ol de PBS 4 veces cada 5 min.
   2. Lave las células fijas con TBS (salina tris tamponada: 50 mM Tris-HCl (pH 7.3) y 150 mM NaCl) durante más de 5 min.
   3. Permeabilizar las células / axónes del cultivo de bolas de neuronas con TBS que contiene 0.3% Triton X-100 durante 5 min.
   4. Conservar las células 1 h para bloquearlas con tampón de bloqueo (0,1% Triton X-100 y 5% NGS (suero normal de cabra) en TBS).
   5. Incubar las células con anticuerpos primarios; anticonejo-vGlut1 (transportador de glutamato vesicular 1 (1:4000)) y antiratón-Munc18-1 (1:300) diluido con diluyente de anticuerpos durante la noche a 4oC.
   6. Lavar los cubreobjetos 4 veces con tampón de inmunofluorescencia (IF) (0,1% Triton X-100 y 2% BSA en TBS) e incubar durante 30 minutos con fluoroforo (Alexa dye)-conjugado2 anticuerpos; anti-ratón-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-conejo-IgG-Alexa 488 (1:1000).
   7. Manchar los núcleos de los cuerpos celulares de las neuronas durante 5 min con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1 g/ml) en PBS.
   8. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS y luego monte en diapositivas de vidrio utilizando medios de montaje que contengan 167 mg/ml de poli (vinilo) de alcohol y 6 mg/ml de n-propilo de gallato.
   9. Almacene los portaobjetos de vidrio en un refrigerador a -20 oC hasta que se microscopa. Las señales fluorescentes de las diapositivas de vidrio son detectables durante al menos 1 año cuando las diapositivas se almacenan a -20 oC.
2. Toma de imágenes bajo microscopio de fluorescencia
   1. Capture el contraste de interferencia diferencial y las imágenes IF bajo un microscopio fluorescente invertido con una cámara CCD enfriada utilizando una lente de inmersión en aceite 60X. Para el software de adquisición de imágenes, utilice un sistema de microscopio instalado por software. Utilice la imagen J como software de análisis de imágenes.
   2. Mida la intensidad IF en presinapciones en axón usando la siguiente fórmula; IF intensidades de la Región de Interés en perlas (ROI) – Apagado de la intensidad de la región de perlas/Intensidad axonal a lo largo de 20 m de perlas – intensidad de fondo. Esta intensidad de la relación proporciona un índice de acumulación de proteínas (Figura4A). Realice las mediciones de las imágenes originales de 16 bits utilizando el software Image J.
   3. Para cuantificar el nivel de acumulación de proteína particular en presináptesis inducida con perlas LRRTM2, seleccione siempre el área lejos de 2 campos de visión o más aparte del cuerpo celular con microscopio (60X).
      NOTA: La selección del área en la bola de neuronas para la toma de imágenes es crucial, ya que los axons densos están cerca del cuerpo celular y la periferia de la bola de neurona puede proporcionar un solo axón.
   4. Para una medición precisa, elija un campo axonal de 5 diferentes (distancia similar a los cuerpos de celda)/coverslip.
   5. Mantenga condiciones de imagen idénticas en diferentes días y entre experimentos

Resultados

Aquí, mostramos resultados representativos de acumulación de proteínas presinápticas en presinapciones inducidas por LRRTM2 de hojas axonales del cultivo de bolas de neuronas. Como proteínas presinápticas, analizamos la proteína de vesícula sináptica excitatoria vGlut1 y la proteína de zona activa Munc18-1. También examinamos el curso de tiempo de acumulación de vGlut1 y Munc18-1 en presinapciones, y obtuvimos resultados que indican la fuente de Munc18-1 en presinapciones utilizando axones eliminando cuerpos ...

Discusión

Desarrollamos un método novedoso para examinar la formación de presinapnasa estimulada con LRRTM2-perlas utilizando el cultivo de bolas de neuronas. Actualmente, la mayor parte del ensayo de formación de presinapestos incluye cuentas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y cultivo disociado/cámara microfluídica^20,21,22. Una de las ventajas de este método es LRRTM2-beads. Mientras que LRRTM2 interactúa con la neurexina para f...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
mouse anti-Munc18-1	BD Biosciences	610336
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA)	Nacalai Tesque	01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)	Nunc	176740
Complete EDTA-free	Roche	11873580001
cooled CCD camera	Andor Technology	iXON3
Coverslip	Matsunami	C015001	Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)	Nacalai Tesque	11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I)	Wako pure chemicals	047-26771
Expi293 Expression System	Thermo Fisher Scientific	A14635
Horse serum	Sigma-Aldrich	H1270
image acquisition software	Nikon	NIS-element AR
Image analysis software	NIH	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Neurobasal media	Thermo Fisher Scientific	#21103-049
Normal Goat Serum (NGS)	Thermo Fisher Scientific	#143-06561
N-propyl gallate	Nacalai Tesque	29303-92
Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai Tesque	26126-25
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000)	Nacalai Tesque	28359-54
poly (vinyl alcohol)	Sigma	P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns	GE healthcare	17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1	Synaptic Systems	135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)	Nacalai Tesque	41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles	Spherotech Inc	SVM-40-10	diameter: 4-5 µm
TritonX-100	Nacalai Tesque	35501-15
Trypsin	Nacalai Tesque	18172-94