Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا علي أساس الميكانيكا لعرقله الفجوة تقاطع بمناسبه 43 وقياس الأثر اللاحق هذا له علي الميكانيكا الحيوية البطانية عن طريق مراقبه القصبات والإجهادات البينية.

Abstract

وقد أنشئت الخلايا البطانية لتوليد الضغوط بين الخلايا والقصبات ، ولكن الدور تقاطعات الفجوة تلعب في الإجهاد بين الخلايا البطانية وتوليد الجر غير معروف حاليا. ولذلك ، فاننا نقدم هنا بروتوكول الميكانيكا القائم علي التحقيق في تاثير الفجوة تقاطع بال43 (Cx43) لديه علي الميكانيكا الحيوية البطانية من خلال تعريض متموج البطانات البطانية إلى المثبط Cx43 المعروفة 2 ، 5-ديهيدروكسيتشالكون (الكلداني) و قياس تاثير هذا المثبط علي القصبات والضغوط البينية. نقدم نتائج تمثيليه ، والتي تظهر انخفاضا في كل من القصبات والإجهادات البينية تحت جرعه عاليه المخروط (2 ميكروغرام/مل) بالمقارنة مع السيطرة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول ليس فقط Cx43 ، ولكن أيضا تقاطعات الفجوة الأخرى كذلك ، علي افتراض استخدام المثبط المناسب. ونحن نعتقد ان هذا البروتوكول سيكون مفيدا في مجالات القلب والاوعيه الدموية وبحوث البيولوجيا الميكانيكية.

Introduction

ويعرف الحقل الذي يشير إلى دراسة اثار القوات البدنية والخواص الميكانيكية علي فسيولوجيا الخلايا والانسجه وعلم الامراض باسم البيولوجيا اليه1. وهناك عدد قليل من التقنيات المفيدة التي تم استخدامها في البيولوجيا الميكانيكية هي أحاديه الطبقة المجهر الإجهاد والمجهر قوه الجر. الجر قوه المجهر يسمح لحساب العمليات التي تم إنشاؤها في واجهه الخلية الركيزة ، في حين ان المجهر أحاديه الطبقة الإجهاد يسمح لحساب الضغوط بين الخلوية المتولدة بين الخلايا المجاورة داخل أحادي الطبقة2 ،3،4،5،6. وقد اقترحت النتائج التي أسفرت عنها الأساليب السابقة ان الإجهاد الميكانيكية المستمدة من الخلايا تلعب دورا حاسما في تحديد مصير مجموعه من العمليات الخلوية3,4,5. فعلي سبيل المثال ، عند التعرض لقوه ميكانيكيه خارجيه ، يمكن لمجموعه من الخلايا المهاجرة كجماعه ان تغير شكلها وتقوم باستقطاب اشكالها لمحاذاتها وترحيلها علي طول اتجاه القوه التطبيقية ، وذلك جزئيا بتوليد القصبات7، 8-الآن وتوفر عمليات التعقب مقياسا يمكن استخدامه لتقييم انقباض الخلية وتحسب باستخدام مجهر قوه الجر (TFM). يبدا المجهر قوه الجر (TFM) مع تحديد الخلايا التي يسببها تشوات الركيزة تليها حساب حقل الجر باستخدام صارمة رياضيا ، والميكانيكا المستندة إلى نهج الحسابية. منذ القدرة علي حساب التعقب وقد حول لبعض الوقت ، وقد استخدمت الباحثين TFM للكشف عن اثر القصبات لديها علي مجموعه من العمليات ، بما في ذلك السرطان9، التئام الجروح10 وتقييم القلب المهندسة الانسجه11.

يمكن تقسيم تنفيذ TFM و MSM معا إلى ثلاث خطوات أساسيه يجب تنفيذها بالترتيب التالي: أولا ، يتم تحديد التشوات هيدروجيل التي تنتجها الخلايا. الثانية ، يتم استرداد القصبات من التشوات هيدروجيل. وثالثا ، يتم استخدام نهج العنصر المحدود لحساب الإجهادات البينية العادية والقص داخل الطبقة الاحاديه بأكملها. لحساب الإزاحات هلام ، تم مقارنه الصور حبه مضان مع الخلايا مع صوره حبه المرجع (بدون خلايا) باستخدام قياس سرعه صوره الجسيمات المكتوبة حسب العرف (PIV) الروتينية. تم اختيار حجم اطار الارتباط التبادلي والتداخل لتحليل PIV ليكون 32 × 32 بكسل و 0.5 ، علي التوالي. في هذا الوقت ، تم تحويل بكسل التحولات إلى ميكرون عن طريق ضرب مع عامل تحويل بكسل إلى ميكرون (لمجهر لدينا ، وهذا عامل التحويل هو 0.65) للحصول علي النزوح في الطائرة. الأخطاء المرتبطة بتجاهل عمليات النزوح خارج الطائرة لا تذكر12,13. بعد حساب النزوح هلام ، وهناك نوعان من قياسات الجر التي يمكن استخدامها ، والانزلاقات المقيدة والمتعقبات غير مقيده8،14. توفر عمليات التعقب غير المقيدة حقل الجر لحقل العرض بأكمله (بما في ذلك المناطق التي بها خلايا وبدونها) ، بينما توفر عمليات التعقب المقيدة حقل الجر فقط للمناطق التي تتضمن الخلايا14. ثم يتم احتساب الضغوط البينية باستخدام مجهر الإجهاد أحادي الطبقة (MSM) ، وهو امتداد لمجهر قوه الجر. ويستند تنفيذ MSM قباله افتراض ان القصبات المحلية التي تمارسها أحاديه الطبقة من الخلايا في واجهه الخلية-الركيزة يجب ان تكون متوازنة من قبل القوات الميكانيكية المنقولة بين الخلايا في واجهه خليه خليه كما هو مطلوب من قبل قوانين نيوتن7 و12و13. ومن الافتراضات الرئيسية هنا ان الخلية أحاديه الطبقة يمكن ان تعامل علي انها ورقه مرنه رقيقه لان توزيع الجر في الطبقة الاحاديه معروف وان توازن القوه لا يعتمد علي خصائص المواد الخلوية. ومن الافتراضات الرئيسية الأخرى ان قوي الجر متوازنة بالضغوط المحلية البينية داخل المجال البصري للراي (داخل الطبقة الاحاديه) وان تاثير توازن القوه هذا هو الحد الأدنى في المنطقة البعيدة (خارج الطبقة الاحاديه)13. ولذلك ، فان الظروف الحدودية التي تحددها الضغوطات البينية ، أو الإزاحات ، أو الجمع بين كل من الحدود الاحاديه الطبقة ، هي شروط حاسمه لأداء MSM13. مع الأخذ بعين الاعتبار المعلومات المذكورة أعلاه ، ونحن نستخدم MSM لاجراء تحليل عنصر محدود (فيم) لاستعاده الحد الأقصى الإجهاد الرئيسي (σmax) والحد الأدنى من الإجهاد الرئيسي (σmin) عن طريق تدوير الطائرة الإجهاد في كل نقطه داخل أحادي. وتستخدم هذه الضغوط الرئيسية في وقت لاحق لحساب 2d متوسط الإجهاد البيني العادي [(σmax + σmin)/2] و 2d الحد الأقصى الإجهاد خلاياه [(σmax -σmin)/2] داخل الطبقة الاحاديه بأكملها 12,13. ويرد وصف هذا الاجراء بمزيد من التفصيل من قبل tambe وآخرون12،13

المجهر الإجهاد أحاديه الطبقة (MSM) يسمح لحساب الخلايا خليه الضغوط الخلوية المتولدة داخل أحاديه الطبقات6،7،8،12،13. وقد اقترحت هذه الضغوط البينية لتكون مهمة لنمو الانسجه وإصلاح, التئام الجروح, والسرطان الانبثاث12,15,16,17. الاضافه إلى ذلك ، اقترحت الضغوط البينية لتكون أيضا مهمة في هجره الخلايا البطانية والحاجز البطانية وظيفة17،18. في حين ان تقاطعات الخلايا الخلوية مثل التقاطعات الضيقة والتقاطعات الملتصقة قد اقترحت للعب دورا حاسما في توليد الإجهاد الغشائي المتشابك وانتقال العدوى ، فان دور تقاطعات الفجوة لا يزال بعيد المنال. تقاطعات جاب تربط الخلايا المجاورة ماديا وتوفر مسارا لتيار كهربائي وجزيئات (< 1 كده) للمرور بين الخلايا المجاورة19،20،21. علي الرغم من ان الخلايا البطانية التعبير عن Cx37, Cx40, وتقاطعات الفجوة Cx4319,22, Cx43 ويمكن القول ان الأكثر اهميه من حيث تطور المرض23. ويمكن العثور علي أدله علي اهميه Cx43's في حقيقة ان الحذف الجيني من Cx43 في الفئران يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم24 ولها اثار ضاره علي تولد الاوعيه25. الاضافه إلى ذلك ، تم توثيق Cx43 لتكون مهمة لهجره الخلايا وانتشار وفي تطور تصلب الشرايين18،22،23،24،25 .

في هذا البروتوكول ، استخدمنا TFM و MSM للتحقيق في ما إذا كان الجر وتوليد الإجهاد بين الخلايا داخل المتموج ، سيتاثر أحادي البطانة البطانية من خلال تعطيل مفرق الفجوة البطانية Cx43. قمنا بتعطيل Cx43 مع 2 ، 5-ديهيدروكسيكلالكون (الطباشير) ، وهو جزيء موثقه لمنع Cx43 التعبير26. استعملت [شلكون] كان ان يعطل Cx43 [اينستد وف] [سرنا] بما ان [شسكون] يتلقى يكون يفاد سابقا ب [لي] [آت ال]. ان يعطل Cx43 تعبير26. الاضافه إلى ذلك ، كنا مهتمين بشكل خاص في تاثير chalcone علي بطانة كما قيل أيضا ان يكون مركب مضاد للالتهابات والصفائح الدموية التي يمكن استخدامها للوقاية والعلاج من مختلف الاوعيه الدموية الامراض26. وقد أجريت العلاجات الكلدانية بعد ساعة من بداية التجربة ، وكانت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية لمده ست ساعات ، وتم اجراء معالجه الصور مع رمز MATLAB مكتوبه حسب العرف لتحديد التعقب وفيما بعد البينية تؤكد. أظهرت نتائجنا انخفاضا إجماليا في عمليات التعقب والإجهادات البينية ، مما يوحي بان Cx43 يلعب دورا رئيسيا في الميكانيكا الحيوية البطانية.

Protocol

1. صنع بولياكريلاميد (PA) الهلام

  1. اعداد طبق بيتري
    1. اعداد ربط سيلان الحل عن طريق خلط 200 mL نقاء المياه مع 80 μl حمض الخليك و 50 μl من 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت. ربط سيلان هو الحل المستخدمة لإضفاء الطابع الوظيفي علي سطح طبق بيتري الزجاج السفلي للمرفق هيدروجيل.
    2. يحرك محلول سيلان الربط علي لوحه يحركها لمده 1 ساعة علي الأقل.
    3. علاج مركز جيدا من طبق بيتري مع الحل سيلان ربط ل 45 دقيقه.
    4. أزاله ربط الحل سيلان وشطف طبق بتري مع الماء فائقه نقيه 2x-3x.
    5. تجفيف سطح طبق بتري وتخزينها في درجه حرارة الغرفة للاستخدام في المستقبل.
  2. اعداد محلول هيدروجيل
    1. تخلط المياه النقية جدا ، 40 ٪ اكريلاميد ، و 2 ٪ مكررا-الاكرياميد في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وفقا للجدول 1.
    2. أضافه 80 μL من حبات الفلورسنت إلى محلول هيدروجيل.
    3. هز الأنبوب برفق لمزج الخرز مع محلول الجل.
    4. تشديد بخفه علي غطاء أنبوب علي أنبوب الطرد المركزي ومكان في غرفه فراغ.
    5. Degas الحل هلام لمده لا تقل عن 45 دقيقه في غرفه فراغ.
  3. البلمره هيدروجيل
    1. أولا ، أضافه 75 μL من 10 ٪ بيركبريتات الأمونيوم (المذاب في المياه النقية جدا) ومن ثم أضافه 8 μL من TEMED (N ، N ، N ' ، N'-tetramethleثين-1 ، 2-diamine) إلى محلول هيدروجيل.
    2. ضع 24 μL من محلول هيدروجيل في مركز طبق بيتري (انظر الجدول 2).
    3. استخدم المشبك عيار 18 ملم لتسطيح هيدروجيل. وهذا سوف يعطي ارتفاعا ~ 100 μm.
    4. الانتظار علي الأقل 30-40 دقيقه للالبلمره هلام.
    5. غمر هيدروجيل بلمره في الماء النقي جدا لمنع جفاف الجل.
    6. تغطيه طبق بيتري مع رقائق ألومنيوم لمنع التسرب الضوئي من حبات الفلورسنت وتخزين في 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن تخزين الهلام المائي فتره تصل إلى 3 أشهر ، ولكن يقترح ان تستخدم هذه الهلام لم يعد من 1 أسبوع بعد تلفيق للحصول علي أفضل النتائج.

2-ثقافة الخلية

  1. ثقافة الإنسان الوريد الحبل السري الخلايا (HUVECs) في ثقافة الخلية المتوسطة 200 (انظر جدول المواد) تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين علي 0.1 ٪ الجيلاتين المغلفة قوارير في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.

3. اعداد الاستنسل ميكرونمط

  1. علاج طبقه رقيقه من polydimethylsiloxane (PDMS) في صحن بيتري مم 100 من خلال خلط قاعده السيليكون مع وكيل علاج السيليكون بنسبه 20:1 (قاعده: وكيل علاج).
    ملاحظه: من الممكن استخدام قاعده أخرى لمعالجه نسب عامل (10:1 أو 30:1 السابقة). ومع ذلك ، فان انخفاض قاعده لعلاج نسبه عامل سوف تسفر عن نمط أكثر صلابة ، في حين ان قاعده اعلي لعلاج عامل نسبه سوف تنتج نمط ليونة.
  2. اعداد 20:1 (قاعده: عامل علاج) PDMS حل وتخلط بعناية في أنبوب الطرد المركزي 50 mL. عكس الأنبوب راسا علي عقب ويهز بقوة عده مرات لضمان الخلط السليم للحل PDMS ، والاختلاط غير موحده سيؤدي إلى البلمره غير مكتملة.
  3. أزاله الفقاعات التي تم تقديمها من الخطوة المذكورة أعلاه عن طريق يطرد حل PDMS لمده 1 دقيقه في 190 x g.
  4. صب 5-6 مل من محلول PDMS في مركز الطبق بيتري 100 مم ويهيج الطبق حتى الحل PDMS يغطي كامل سطح طبق بيتري.
  5. علاج PDMS الحل بين عشيه وضحيها في 50-60 درجه مئوية. ويمكن أيضا علاج PDMS في درجه حرارة الغرفة.
  6. قم بازاله استنسل PDMS الدائري القطر 16 ملم مع فتحه الثقب.
  7. استخدام لكمه خزعة لإنشاء ثقوب صغيره في الاستنسل PDMS. يستخدم هذا البروتوكول لكمه خزعة قطرها 1.25 مم.
  8. تعقيم الاستنسل PDMS بواسطة الدمج الأول لهم في 70 ٪ الايثانول لمده 2-3 دقيقه ، والشفط من الايثانول الزائد ثم وضع تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 5 دقائق.

4. الكولاجين-I طلاء هيدروجيل

  1. أزاله الشفة من هيدروجيل ويستنشق اي السائل الزائد.
  2. ضع الاستنسل PDMS علي سطح هيدروجيل.
    ملاحظه: يمكن استخدام ملاقط لتطبيق ضغط الضوء علي الاستنسل PDMS لضمان ختم المياه محكم بين الاستنسل PDMS وسطح هيدروجيل. الاستنسل لدينا PDMS هي المياه ضيقه التالي منع الوصول إلى المياه بين السطح العلوي هلام و PDMS سطح أسفل الاستنسل. أيضا ، وصلابة هيدروجيل لا تحتاج إلى تعديل فيما يتعلق صلابة PDMS.
  3. تغطيه سطح هيدروجيل مع سولفوسكايميديل-6-(4-ازيدو-2-نيتروفينيلاميني) هيكسانواتي (سولفو-سانبا) المذاب في 0.1 M HEPES (4-(2-هيدروكسي ايثيل) -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك) حل العازلة في تركيز 1:1000 ومكان تحت الاشعه فوق البنفسجية مصباح (السلطة 36 W) لمده 8 دقائق.
  4. يستنشق الفائض سولفو-سانبا والحل HEPES وشطف هيدروجيل مرتين مع 0.1 M HEPES تليها اثنين من يشطف اضافيه مع المياه فائقه النقاء.
  5. يستنشق الزائدة المياه النقية جدا ومعطف الهيدروجيل مع 0.1 ملغ/مل الكولاجين-انا بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  6. غطي الاطباق واحمي حبات الفلورسنت من الرشح الضوئي.
    ملاحظه: يتم استخدام الاستنسل PDMS لإنشاء أحادي الطبقات أحاديه النقش. وتستخدم الطبقات الاحاديه المنقوشة المجهرية لأنها تسمح للعديد من الطبقات الاحاديه من نفس الهندسة والابعاد التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد اثناء كل تجربه. ومع ذلك ، في حاله عدم الرغبة في الأنماط المجهرية يمكن اتباع الخطوات المذكورة أعلاه باستثناء الخطوة 4.2.

5. إنشاء أحادي الطبقات HUVEC علي الهلام المائي

  1. استخدام 1x التريبسين لفصل الخلايا من قوارير ثقافة الانسجه لمده 3-5 دقيقه في الحاضنة.
  2. بعد الترسينه ، أضافه وسائل الاعلام الثقافة الخلية إلى حل التريبسين وأضافه إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  3. الطرد المركزي حل الخلية لمده 3 دقائق في 1710 x g. وينبغي ان تكون صغيره ، بيليه بيضاء من الخلايا مرئية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
  4. يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في وسائل الاعلام إلى تركيز 50 x 104 خلايا/مل.
  5. أزاله الكولاجين-I من هيدروجيل وشطف 1x مع تلفزيوني.
  6. أضافه 75 x 103 خلايا إلى الأعلى من الاستنسل pdms والسماح للخلايا لنعلق علي سطح هيدروجيل لمده 1 ساعة علي الأقل في الحاضنة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  7. أزاله الاستنسل PDMS وأضافه ما لا يقل عن 2 مل من وسائل الاعلام إلى طبق بيتري. دمج الاستنسل PDMS في 10x التريبسين لأزاله اي الخلايا المرفقة وتعقيم عن طريق الرش مع 70 ٪ الايثانول ومن ثم وضع تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 5 دقائق.
  8. وضع طبق بيتري في الحاضنة والانتظار علي الأقل 36 h أو حتى يتم ملاحظه أحاديه الطبقة متموج.

6.2 ، 5 العلاج ديهيدروكسيكالكوكون لاضطراب Cx43

  1. حل 2 ، 5 ثنائي هيدروكسيكلالكوكون (الطباشير) في ثنائي ميثيل سولفوكيد (DMSO) لجعل 0.1875 mg/mL حل الأسهم.
  2. تمييع حل الأسهم مع وسائل الاعلام الثقافة الخلية لجعل تركيز السبورة منخفضه (0.2 ميكروغرام/مل) قسامه وتركيز السبورة عاليه (2 ميكروغرام/مل) قسامه.

7-الحصول علي البيانات

  1. تحديد موقع جزر الخلية مع المجهر.
  2. الحصول علي النقيض من المرحلة والصور حبه لصوره الخلية المورفولوجية والنزوح هيدروجيل ، علي التوالي.
    ملاحظه: استخدم هذا البروتوكول هدف 10x للحصول علي البيانات.
  3. في نهاية التجربة ، فصل الخلايا مع 10x التريبسين والحصول علي صوره للسطح هلام دون خلايا (صوره مرجعيه).

8. المناعة

  1. إصلاح أحادي الطبقات مع 4 ٪ الفورمالديهايد واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
  2. أزاله الفورمالديهايد 4 ٪ وأضافه 0.2 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية إلى تتخلل الخلايا.
  3. أزاله 0.2 ٪ تريتون X-100 وشطف أحادي الطبقات مع تلفزيوني 2x-3x.
  4. تغطيه أحاديه الطبقة مع 2 ٪ المصل البقري الزلال (جيش صرب البوسنيين) حل ل 45 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  5. أزاله الحل 2 ٪ بوسنيا وشطف الطبقات الاحاديه مع تلفزيوني 2x-3x.
  6. أضافه الأجسام المضادة Cx43 الاساسيه في تركيز 1:400 إلى العينة واحتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  7. أزاله الأجسام المضادة الاساسيه وشطف عينه مع تلفزيوني 2x-3x.
  8. أضافه الأجسام المضادة الثانوية في تركيز 3:200 واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
    ملاحظه: يجب ان تكون العينات مغطاه لمنع الرشح الضوئي.
  9. أزاله الأجسام المضادة الثانوية وشطف مع تلفزيوني 2x-3x.
  10. تغطيه العينة مع المتوسطة المتصاعدة (فلومومونت-G DAPI) وختم مع زلة غطاء 18 ملم.

9. تنفيذ المجهر قوه الجر (TFM) والمجهر أحاديه الطبقة الإجهاد (MSM)

  1. حساب تشوه هيدروجيل
    ملاحظه: يتم إعطاء اجراء حساب الازاحه خطوه بخطوه باستخدام MATLAB أدناه.
    1. فتح الملف الرئيسي الجر. m في matlab (لجميع الروتين matlab انظر المواد التكميلية).
      ملاحظه: اتبع الإرشادات المتوفرة في التعليمات البرمجية لتعيين الدليل MATLAB.
    2. تحديد المتغيرات التالية: تنسيق الصورة ، وتحويل بكسل إلى ميكرون ، ومعامل يونغ ، ونسبه Poisson ، وهدف المجهر.
    3. حدد موقع الصورة الخرزة ، التريبسين ، وصوره المرحلة باستخدام روتين Openfiles .
      ملاحظه: بالنسبة لمجموعات البيانات الكبيرة ، من الأفضل تسميه الملفات بترتيب تسلسلي. علي سبيل المثال ، يجب تسميه الملفات "filename1" ، "filename2" ، الخ.
    4. تعريف ROI مربع (منطقه الاهتمام) حول أحاديه الخلية وتنفيذ روتين cell_cropper لاقتصاص الصورة الاصليه.
    5. تنفيذ روتين displacement_finder لحساب عمليات الترحيل.
    6. تنفيذ روتين Dedrift لأزاله اي تشريد اضافيه غير الخلوية التي قد تكون بسبب الانجراف مرحله المجهر.
  2. حساب عمليات التعقب
    ملاحظه: هنا ، يتم احتساب عمليات التعقب غير المقيدة باستخدام روتين MATLAB المكتوب حسب العرف. خطوه بخطوه حساب الجر باستخدام روتين MATLAB المذكورة سابقا ويرد أدناه.
    1. تعريف المتغيرات التالية داخل الجر. m الروتينية: حاله الحدود ، سمك هلام ، ارتفاع هلام ، والانحراف.
    2. تنفيذ روتين traction_finder لحساب عمليات التعقب وتنفيذ plot_traction روتين فرعي لرسم التعقب. يمكن العثور علي كافة عمليات التعقب في الاتجاه السيني (Tx) و y-الاتجاه (Ty) جنبا مع المواقع بكسل المقابلة الخاصة بهم في ملف الجر dat التي سيتم إنشاؤها بواسطة التعليمات البرمجية.
  3. حساب من إجهادات [اينترخلوي]
    ملاحظه: التعليمات خطوه بخطوه لحساب الإجهاد بين الخلايا باستخدام روتين MATLAB المذكورة سابقا وترد أدناه.
    1. تنفيذ روتين mark_circular_domain لتحديد حدود أحاديه الطبقة. سيقوم هذا الروتين بمطالبه جميع الصور المرحلة الاقتصاص بشكل تسلسلي للمستخدم لرسم حدود حول أحاديه الطبقة يدويا. الاحتفاظ ملاحظه من nXPts التي تم إنشاؤها في اطار الأوامر واستخدامها فيما بعد كمعلمات الشبكة في كل من محور X ومحور ص لتحليل فيم (انظر الخطوة).
    2. تنفيذ Run_StressCode لحساب الضغوط بين الخلايا. يقرا هذا الروتين الفرعي مباشره المعلمات من ملف "model.in" وينفذ "الجزيرة .exe" لاجراء تحليل فيم. قبل تشغيل هذا الروتين ، تاكد من ان جميع المعلمات في ملف model.in ، اي معلمات الشبكة في X و Y ، بكسل لتحويل ميكرون ، ومعامل يونغ للهلام ، ونسبه poisson ، وارتفاع أحاديه الطبقة ، ونمط أحاديه الطبقة (الشريط أو الثقب) ، يتم تحريرها صحيح.
    3. ارسم كل نتائج فيم باستخدام الروتين الفرعي plot_FEM_results .
      ملاحظه: سيتم تلقائيا تخزين كافة النتائج التي تم إنشاؤها في مجلد النتائج في الدليل matlab.

النتائج

صور التباين المرحلة من السيطرة ، 0.2 ميكروغرام/مل ، و 2 ميكروغرام/مل وقد اتخذت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية 30 دقيقه قبل العلاج الطباشير (الشكل 1ا-ج) وبعد ساعتين من المعالجة الكلدانية (الشكل 1مد-F). ولوحظ ان حالات التشرد ب?...

Discussion

مجموعتنا ، فضلا عن غيرها ، وقد تم بنجاح استخدام tfm و MSM لتحقيق تاثير تقاطعات خليه الخلية في مختلف العمليات الخلوية المرضية والفسيولوجية في المختبر7،15،18،27 . علي سبيل المثال ، Hardin وآخرون قدمت دراسة ثاقبه للغاية التي تشير إ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل جامعه فلوريدا المركزية بدء الأموال ومعهد القلب الوطني, الرئة, والدم من المعهد الوطني للصحة تحت جائزه K25HL132098.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
18 mm coverslipThermoFisher18CIR-1Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamideBIO-RAD1610143Component of polyacrylamide gel
2′,5′-DihydroxychalconeSIGMAIDF00046To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSIGMA2530-85-0Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% AcrylamideBIO-RAD1610140Component of polyacrylamide gel
Acetic acidFisher-Sceintific64-19-7Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;ThermoFisherCatalog # A-11001Secondary antibody
Ammonium persulfateBIO-RAD1610700Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)SIGMA9048-46-8To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mLAdvance Biomatrix5005-100MLUse as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)Fisher-Sceintific21040CVBuffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagentsFisher-Sceintific67-68-5To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPIThermoFisher00-4959-52Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beadsThermoFisherF88120.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 MSIGMA7365-45-9Essential to
LVESThermoFisherA1460801Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200ThermoFisherM200500Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)ThermoFisherCatalog #13-8300Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)CellVisD35-20-1.5H35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mgProteochem102568-43-4Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW corning2646340Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMEDBIO-RAD1610801Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100SIGMA9002-93-1To permeabilize cells
Trypsin -EDTAThermoFisher25300054Used to detach cells

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 Cx43

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved