코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

요약

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

초록

내피 세포는 세포 간 응력과 견인력을 생성하기 위해 설립되었지만, 내피 간 스트레스와 견인 생성에서 역할 갭 접합이 작용한다는 것은 현재 알려져 없습니다. 따라서, 우리는 여기에 갭 접합 코넥신 (Cx43)의 영향을 조사하는 역학 기반 프로토콜을 제시 (Cx43) 알려진 Cx43 억제제 2,5 디하이드록시 찰콘 (chalcone)에 동천 내피 단층을 노출시킴으로써 내피 생체 역학에 있다 이 억제제가 견인력과 세포간 응력에 미치는 영향을 측정합니다. 우리는 대조군과 비교할 때 높은 chalcone 복용량 (2 μg/mL)에서 견인력과 세포 간 응력 모두의 감소를 보여주는 대표적인 결과를 제시합니다. 이 프로토콜은 적절한 억제제가 사용된다는 가정하에 Cx43뿐만 아니라 다른 갭 접합에도 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 및 메카생물학 연구 분야에서 유용할 것이라고 믿습니다.

서문

물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학^1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다^{2 ,3},^4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을^{건의했습니다 3,4,5.} 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하여 부분적으로견인7을 생성할 수 있습니다. ⁸. 견인은 세포 수축성을 평가하는 데 사용할 수 있는 메트릭을 제공하며 견인력 현미경 검사법(TFM)을 사용하여 계산됩니다. 견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포 유도 기질 변형의 결정으로 시작하여 수학적으로 엄격한 역학 기반 계산 접근법을 사용하여 견인장을 계산합니다. 견인력을 계산하는 능력이 꽤 오랜 시간 동안 주변에 있기 때문에, 연구원은 TFM을 활용하여 암^9,상처 치유¹⁰ 및 엔지니어링 심장 평가를 포함한 다양한 프로세스에 대한 견인력이 미치는 영향을 밝혔습니다. 조직¹¹.

TFM 및 MSM의 구현은 다음과 같은 순서로 실행되어야하는 세 가지 필수 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 세포에 의해 생성 된 하이드로 겔 변형이 결정됩니다; 둘째, 견인은 하이드로 겔 변형에서 회수됩니다. 셋째, 유한 요소 접근법은 전체 단층 내에서 정상 및 전단 세포 간 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 겔 변위를 계산하기 위해, 세포와 형광 비드 이미지를 맞춤형 입자 이미지 속도계(PIV) 루틴을 사용하여 참조 비드 이미지(셀 제외)와 비교하였다. PIV 분석을 위한 상호 상관 윈도우 크기와 겹치는 것은 각각 32 x 32 픽셀 및 0.5로 선택되었다. 이때, 픽셀 시프트는 평면 변위를 얻기 위해 픽셀 대 미크론 변환 인자(우리의 현미경의 경우, 이 변환 인자는 0.65)와 곱하여 미크론으로 변환되었다. 평면 외 변위를 무시하는 것과 관련된 오류는 무시할 수^{있는 12,13입니다.} 겔 변위를 계산한 후, 활용될 수 있는 두 가지 유형의 견인 측정, 제한된 견인력 및 구속되지 않은 견인력^8,14가있다. 구속되지 않은 트랙션은 전체 시야(셀이 있는 영역 및 셀이 없는 영역 포함)에 대한 트랙션 필드를 제공하며, 제한된 트랙션은 셀^14를포함하는 영역에 대해서만 트랙션 필드를 제공합니다. 그런 다음, 세포간 응력은 견인력 현미경 검사법의 연장인 단층 응력 현미경 검사법(MSM)을 사용하여 계산됩니다. MSM의 구현은 셀 기판 인터페이스에서 세포의 단층이 가하는 국부적 견인력이 뉴턴의 법칙 7에서 요구하는 대로 셀-셀 인터페이스에서 세포 간에 전달되는 기계적 힘에 의해 균형을 이루어야 한다는 가정을 기반으로 합니다^{7. ,12,13}. 여기서 중요한 가정은 단층내의 견인 분포가 알려져 있고 힘 균형이 셀 재료 특성에 의존하지 않기 때문에 셀 단층이 얇은 탄성 시트로 처리 될 수 있다는 것입니다. 또 다른 주요 가정은 견인력이 광학 시야 내의 국소 세포 간 응력(단층 내)에 의해 균형을 이루고 이러한 힘 균형의 영향은 원위 영역(단층 외부)에서 최소화된다는^{것입니다 13.} 따라서 단층 경계에서 세포간 응력, 변위 또는 둘 다의 조합으로 정의된 경계 조건은 MSM^13을수행하는 데 매우 중요합니다. 위의 정보를 고려하여 MSM을 사용하여 유한 요소 분석(FEM)을 수행하여 최대 주 응력(σ_max)및 최소 주 응력(σ_min)을복구하여 단층. 이러한 주 응력은 이후에 전체 단층 내에서 2D 평균 정상 세포간 응력 [(σ_max + σ_min)/2] 및 2D 최대 전단 간 응력 [(σ_max - σ_min)/2]를 계산하는 데 사용됩니다. ^12,13. 이 절차는 Tambe 등^12,13에 의해 더 자세히 설명되어 있습니다.

단층 응력 현미경 검사법 (MSM)은 단층^6,7,8,12,13내에서 생성된 세포 간 응력의 계산을 허용합니다. 이러한 세포간 스트레스는 조직 성장 및 수리, 상처 치유 및 암 전이^{12,15,16,17에}중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 스트레스는 내피 세포 이동 및 내피 장벽 기능^{17,18에서도}중요할 것으로 제안되었다. 단단한 접합부 및 접착접선 접합부와 같은 세포 세포 접합부는 둘 다 내피 세포 간 응력 생성 및 전송에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의되는 동안, 간격 접합의 역할은 애매하게 남아 있습니다. 갭 접합부는 인접 한 세포를 물리적으로 연결하고 인접 세포^19,20,21사이를 통과하는 전류 및 분자 (&1 KDa)에 대한 경로를 제공합니다. 내피 세포는 Cx37, Cx40 및 Cx43 갭 접합부^19,22,Cx43을 발현하지만, Cx43은 틀림없이 질병 진행성^23의측면에서 가장 중요하다. Cx43의 중요성의 증거는 마우스에서 Cx43의 유전 적 결실이 저혈압^24의 결과이며 혈관 신생^25에부작용이 있다는 사실에서 발견 될 수 있습니다. 또한, Cx43은 세포 이동 및 증식및 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 것으로 문서화되어^{있다 18,22,23,24,25} .

이 프로토콜에서, 우리는 TFM 및 MSM을 사용하여 내피, 내피 단층 내의 견인 및 세포 간 스트레스 생성이 내피 갭 접합 Cx43의 붕괴에 의해 영향을 받을 지 여부를 조사했습니다. 우리는 Cx43 발현^26을억제하기 위해 문서화된 분자인 2,5-디하이드록시찰콘(chalcone)으로 Cx43을 중단시켰습니다. Chalcone은 Cx43 발현^26을중단시키기 위해 이전에 리 외에 의해 보고된 바와 같이 siRNA 대신 Cx43을 중단시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 또한 잠재적으로 다양한 혈관의 예방 및 치료에 사용될 수있는 항 염증 및 항 혈소판 화합물로보고되었기 때문에 내피에 대한 chalcone의 영향에 특히 관심이 있었다 병리학²⁶. Chalcone 처리는 실험 개시 후에 1 시간, chalcone 처리한 단층은 총 6 시간 동안 심상하고, 심상 처리는 견인을 결정하기 위하여 주문을 쓰여진 MATLAB 부호로 수행되고 그 후에 세포 간 스트레스. 우리의 결과는 Cx43이 내피 생체 역학에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의하는 견인및 세포간 응력에 있는 전반적인 감소를 보여주었습니다.

프로토콜

1. 폴리아크릴아미드 (PA) 젤 만들기

1. 페트리 접시의 준비
   1. 200 mL의 초순수와 80 μL 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트를 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비합니다. 바인드 시레인은 하이드로겔 부착을 위해 유리 바닥 페트리 접시 표면을 기능화하는 데 사용되는 용액이다.
   2. 바인드 시란 용액을 교반판에 적어도 1시간 동안 저어줍니다.
   3. 페트리 접시의 중심을 바인드 실란 용액으로 45분 동안 처리합니다.
   4. 바인드 스틸란 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수 2x-3x로 헹구세요.
   5. 페트리 접시 표면을 말려 실온에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
2. 하이드로겔 용액의 준비
   1. 표 1에따라 초순수, 40% 아크릴아미드 및 2% 비스-아크릴아미드를 15 mL 원심분리기 튜브에 섞는다.
   2. 하이드로겔 용액에 80 μL의 형광 비드를 추가합니다.
   3. 튜브를 부드럽게 흔들어 구슬을 젤 용액과 섞습니다.
   4. 원심분리기 튜브의 튜브 캡을 가볍게 조이고 진공 챔버에 놓습니다.
   5. 진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈기하십시오.
3. 하이드로겔 중합
   1. 먼저, 10% 황황산 암모늄(초순수에 용해)의 75 μL을 넣고 8 μL의 TEMED(N,N,N', N'-Tetramelelethane-1,2-diamine)를 하이드로겔 용액에 추가합니다.
   2. 페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액 24 μL을 놓습니다(표 2참조).
   3. 하이드로겔을 평평하게 하려면 18mm 커버슬립을 사용합니다. 이것은 ~ 100 μm의 높이를 줄 것이다.
   4. 겔 중합을 위해 적어도 30-40 분 기다립니다.
   5. 겔 탈수를 방지하기 위해 고분자 하이드로겔을 초순수에 담급합하십시오.
   6. 형광 비드의 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 페트리 접시를 덮고 4 °C에서 보관하십시오.
      참고 : 하이드로 겔은 최대 3 개월의 기간을 저장할 수 있지만, 이 젤은 최상의 결과를 얻기 위해 제조 후 1 주 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다.

2. 세포 배양

1. 배양 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs)는 세포 배양 배지 200(재료 표참조)에서 37°C 및 5%_CO2에서0.1% 젤라틴 코팅 플라스크상에 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하였다.

3. 마이크로 패턴 스텐실 준비

1. 실리콘 염기를 실리콘 경화제와 20:1 의 비율로 혼합하여 100 mm 페트리 접시에 폴리디메틸실록산(PDMS)의 얇은 층을 경화(base: 경화제).
   참고: 경화제 비율(예: 10:1 또는 30:1)에 다른 베이스를 사용할 수 있습니다. 그러나, 경화제 비율이 낮은 염기는 더 단단한 패턴을 산출하고, 경화제 비율이 높을수록 더 부드러운 패턴을 생성할 것이다.
2. 20:1(기본:경화제) PDMS 용액을 준비하고 50 mL 원심분리기 튜브에 조심스럽게 섞습니다. 불균일한 혼합으로 불완전한 중합을 초래할 것이므로 튜브를 거꾸로 뒤집고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액의 적절한 혼합을 보장합니다.
3. 190 x g에서1 분 동안 PDMS 솔루션을 원심 분리하여 위의 단계에서 도입 된 기포를 제거하십시오.
4. 100mm 페트리 접시의 중앙에 5-6 mL의 PDMS 용액을 붓고 PDMS 용액이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.
5. PDMS 용액을 50-60°C에서 밤새 경화하였다. PDMS는 또한 실온에서 경화될 수 있다.
6. 구멍 펀처가 있는 원형 직경 16mm PDMS 스텐실을 제거합니다.
7. 생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다. 이 프로토콜은 1.25 mm 직경 생검 펀치를 사용합니다.
8. PDMS 스텐실을 먼저 70% 에탄올에 2-3분 동안 담근 다음, 과도한 에탄올을 흡입한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 두어 멸균합니다.

4. 콜라겐-I 하이드로겔 코팅

1. 하이드로겔에서 커버슬립을 제거하고 여분의 액체를 흡인합니다.
2. PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓습니다.
   참고: 핀셋은 PDMS 스텐실에 광압을 가하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 방수 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 PDMS 스텐실은 수밀성이므로 젤 상부 표면과 PDMS 스텐실 바닥 면 사이의 물 접근을 방지합니다. 또한, 하이드로겔 강성은 PDMS 강성에 대하여 조정될 필요가 없다.
3. 0.1M HEPES(4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진에탄설포산)에 용해된 헥사노에이트(설포-산파아미노)를 설포수니미딜-6-(4-아지도-2-니트로페닐아미노)로 하이드로겔 표면을 100대 농도로 커버한다. 램프(전력 36W)를 8분 동안 사용할 수 있습니다.
4. 여분의 설포-SANPAH 및 HEPES 용액을 흡인하고 0.1 M HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수로 2 개의 린스를 추가로 헹구습니다.
5. 0.1 mg/mL 콜라겐-I를 4°C에서 하룻밤 동안 과량의 초순수 및 코팅 하이드로겔을 흡인합니다.
6. 접시를 덮고 형광 비드를 광표백으로부터 보호하십시오.
   참고: PDMS 스텐실은 마이크로 패턴 단층을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 패턴 단층은 각 실험 중에 동일한 형상과 치수의 여러 단층이 동시에 관찰될 수 있도록 하기 때문에 활용됩니다. 그러나, 마이크로패턴이 바람직하지 않은 경우 4.2단계를 제외하고 위의 단계를 따를 수 있다.

5. 하이드로겔에 HUVEC 단층 만들기

1. 인큐베이터에서 3-5 분 동안 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 1x 트립신을 사용하십시오.
2. 트립시니화 후, 트립신 용액에 세포 배양 배지를 첨가하고 15 mL 원심분리튜브에 첨가한다.
3. 1710 x g에서3 분 동안 세포 용액을 원심 분리기. 세포의 작은, 백색 펠릿은 원심 분리기 관의 바닥에 표시되어야 합니다.
4. 50 x 10^{4 세포} / mL의 농도로 매체에서 상류 세포를 흡인하고 재중단.
5. 하이드로겔에서 콜라겐-I를 제거하고 PBS로 1x 헹구어 주세요.
6. PDMS 스텐실의 상부에 75 x 10³ 세포를 추가하고 세포가 37°C 및 5%_CO2에서인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 하이드로겔 표면에 부착되도록 한다.
7. PDMS 스텐실을 제거하고 페트리 접시에 적어도 2 mL의 미디어를 추가합니다. PDMS 스텐실을 10x 트립신에 담그고 부착된 세포를 제거하고 70% 에탄올로 분무한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 소독합니다.
8. 인큐베이터에 페트리 접시를 놓고 적어도 36 시간 또는 동시 단층이 관찰 될 때까지 기다립니다.

6. Cx43 중단을 위한 2,5디하이드록시찰콘 처리

1. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 2,5디하이드록시찰콘(chalcone)을 용해하여 0.1875 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다.
2. 낮은 chalcone 농도 (0.2 μg/mL) aliquot 및 높은 chalcone 농도 (2 μg/mL) aliquot를 만들기 위해 세포 배양 매체로 주식 용액을 희석.

7. 데이터 수집

1. 현미경으로 세포 섬을 찾습니다.
2. 위상 대비 및 비드 이미지를 각각 이미지 셀 형태및 하이드로겔 변위를 획득합니다.
   참고: 이 프로토콜은 데이터 수집을 위해 10배 의 목표를 사용했습니다.
3. 실험의 끝에서, 10x 트립신으로 세포를 분리하고 세포없이 겔 표면의 이미지를 획득 (참조 이미지).

8. 면역 염색

1. 4% 포름알데히드로 단층을 고정하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
2. 4% 포름알데히드를 제거하고 0.2% 트리톤 X-100을 37°C에서 5분 동안 추가하여 세포를 투과시합니다.
3. 0.2% 트리톤 X-100을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.
4. 37°C에서 45분 동안 2% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 단층을 덮습니다.
5. 2% BSA 용액을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.
6. 1차 Cx43 항체를 1:400의 농도로 시료에 넣고 4°C에서 밤새 배양한다.
7. 원발성 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 시료를 헹구다.
8. 3:200의 농도로 이차 항체를 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양한다.
   참고: 광표백을 방지하기 위해 샘플을 덮어야 합니다.
9. 이차 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 헹구어 보시고 자합니다.
10. 장착 매체(Fluromount-G DAPI)로 시료를 덮고 18mm 커버 슬립으로 밀봉합니다.

9. 견인력 현미경 검사법 (TFM) 및 단층 응력 현미경 검사법 (MSM)의 구현

1. 하이드로겔 변형 계산
   참고: MATLAB을 사용하는 단계별 변위 계산 절차는 다음과 같습니다.
   1. MATLAB에서 기본 traction.m 파일을 엽니다(모든 MATLAB 루틴에 대한 보충 자료 참조).
      참고: 코드에 제공된 지침을 따라 MATLAB 디렉터리를 설정합니다.
   2. 이미지 형식, 픽셀 대 미크론 변환, 영의 계수, 푸아송 비율 및 현미경 목표의 다음 변수를 정의합니다.
   3. OpenFiles 서브루틴을 사용하여 비드, 트립신 이미지 및 위상 이미지를 찾습니다.
      참고: 대용량 데이터 세트의 경우 파일의 이름을 순차적으로 지정하는 것이 가장 좋습니다. 예를 들어 파일 이름은 "filename1.tif", "filename2.tif" 등이어야 합니다.
   4. 셀 단층 주위에 사각형 ROI(관심 영역)를 정의하고 cell_cropper 서브루틴을 실행하여 원본 이미지를 자르는 것입니다.
   5. 변위_finder 서브루틴을 실행하여 변위를 계산합니다.
   6. Dedrift 서브루틴을 실행하여 현미경 단계 드리프트로 인해 발생할 수 있는 추가적인 비세포 변위를 제거합니다.
2. 견인력 계산
   참고: 여기서 는 맞춤형 MATLAB 루틴을 사용하여 제한되지 않은 견인력이 계산됩니다. 앞서 언급한 MATLAB 루틴을 이용한 단계별 견인 계산은 아래에 제시되어 있다.
   1. traction.m 루틴 내에서 경계 조건, 겔 두께, 젤 높이 및 드리프트 내에서 다음 변수를 정의합니다.
   2. traction_finder 서브루틴을 실행하여 견인을 계산하고 plot_traction 서브루틴을 실행하여 견인을 플롯합니다. 해당 픽셀 위치와 함께 x 방향(Tx) 및 y 방향(Ty)의 모든 트랙션은 코드에 의해 생성되는 traction.dat 파일에서 찾을 수 있습니다.
3. 세포간 응력 계산
   참고: 앞에서 언급한 MATLAB 루틴을 사용하여 세포간 응력 계산에 대한 단계별 지침은 다음과 같습니다.
   1. mark_circular_domain 서브루틴을 실행하여 단일레이어 경계를 지정합니다. 이 루틴은 사용자가 수동으로 단일 레이어 주위에 경계를 그릴 수 있도록 모든 자른 위상 이미지를 순차적으로 묻는 메시지를 표시합니다. 명령 창에서 생성된 nXPt를 기록하고 나중에 FEM 해석을 위해 X축과 Y축의 그리드 매개변수로 사용합니다(9.3.2 단계 참조).
   2. Run_StressCode를 실행하여 셀룰러 응력을 계산합니다. 이 서브루틴은 "model.in" 파일에서 매개 변수를 직접 읽고 FEM 분석을 수행하기 위해 "island.exe"를 실행합니다. 이 루틴을 실행하기 전에 model.in 파일의 모든 매개변수(예: X 및 Y의 그리드 매개변수, 픽셀에서 미크론 변환, 젤의 영의 계수, 푸아송 비율, 단층 높이 및 단층 패턴(스트립 또는 구멍)가 편집되었는지 확인합니다. 올바르게.
   3. plot_FEM_결과 서브루틴을 사용하여 모든 FEM 결과를 플로팅합니다.
      참고: 생성된 모든 결과는 MATLAB 디렉터리에 있는 결과 폴더에 자동으로 저장됩니다.

결과

대조군 이미지, 0.2 μg/mL, 및 2 μg/mL 단층 처리된 단층은 찰콘 처리 30분 전에 촬영하였다(그림1A-C)및 2시간 후 의 찰콘 처리(도1D-F). 세포-유도 비드 변위(μm)는 HUVEC 단층 대조층 대조층 대조군과 비교했을 때 저용량 chalcone 및 고용량chalcone 조건 모두에서 감소하는 것으?...

토론

우리 그룹뿐만 아니라 다른 사람뿐만 아니라,^{성공적으로}시험관 7,^15,18,27에서 다양한 병리학 및 생리 적 세포 과정에서 세포 접합의 영향을 조사하기 위해 TFM과^MSM을사용하고있다 . 예를 들어, Hardin 등은 세포간 스트레스 전달가이드 내피 세포에서의 파라셀룰러 갭 형성을 시사하는 매우 통찰력 있는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm coverslip	ThermoFisher	18CIR-1	Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide	BIO-RAD	1610143	Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone	SIGMA	IDF00046	To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	SIGMA	2530-85-0	Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide	BIO-RAD	1610140	Component of polyacrylamide gel
Acetic acid	Fisher-Sceintific	64-19-7	Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;	ThermoFisher	Catalog # A-11001	Secondary antibody
Ammonium persulfate	BIO-RAD	1610700	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	9048-46-8	To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL	Advance Biomatrix	5005-100ML	Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents	Fisher-Sceintific	67-68-5	To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI	ThermoFisher	00-4959-52	Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads	ThermoFisher	F8812	0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M	SIGMA	7365-45-9	Essential to
LVES	ThermoFisher	A1460801	Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200	ThermoFisher	M200500	Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)	ThermoFisher	Catalog #13-8300	Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)	CellVis	D35-20-1.5H	35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW corning	2646340	Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED	BIO-RAD	1610801	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	To permeabilize cells
Trypsin -EDTA	ThermoFisher	25300054	Used to detach cells