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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Abstract

Sono state create cellule endoteliali per generare sollecitazioni e trazioni intercellulari, ma il ruolo delle giunzioni gap giocate nella generazione di stress e trazione intercellulare endoteliale è attualmente sconosciuto. Pertanto, presentiamo qui un protocollo basato sulla meccanica per sondare l'influenza della giunzione gap connexin 43 (Cx43) ha sulla biomeccanica endoteliale esponendo monostrati endoteliali confluenti a un noto inibitore Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) e misurando l'impatto di questo inibitore sulle trazioni e sulle sollecitazioni intercellulari. Vi presentiamo risultati rappresentativi, che mostrano una diminuzione sia delle trazioni che delle sollecitazioni intercellulari sotto un alto dosaggio di chalcone (2 g/mL) rispetto al controllo. Questo protocollo può essere applicato non solo a Cx43, ma anche ad altre giunzioni di gap, supponendo che venga utilizzato l'inibitore appropriato. Crediamo che questo protocollo sarà utile nei campi della ricerca cardiovascolare e meccanobiologia.

Introduzione

Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia1. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell'interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all'interno di un monostrato2 ,3,4,5,6. I risultati ottenuti dai metodi precedenti hanno suggerito che le sollecitazioni meccaniche derivate dalle cellule svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino di una serie di processi cellulari3,4,5. Ad esempio, dopo l'esposizione a una forza meccanica esterna, un gruppo di cellule che migrano collettivamente può alterare la loro morfologia e polarizzare la loro forma per allineare e migrare lungo la direzione della forza applicata, in parte, generando trazioni7, 8. Le trazioni forniscono una metrica che può essere utilizzata per valutare la contrattilità delle celle e vengono calcolate utilizzando la microscopia della forza di trazione (TFM). La microscopia della forza di trazione (TFM) inizia con la determinazione delle deformazioni del substrato indotte dalle cellule seguita dal calcolo del campo di trazione utilizzando un approccio computazionale matematicamente rigoroso e basato sulla meccanica. Dal momento che la capacità di calcolare le trazioni è stata intorno per un bel po 'di tempo, i ricercatori hanno utilizzato TFM per rivelare l'impatto che le trazioni hanno su una serie di processi, tra cui il cancro9, guarigione della ferita10 e valutazione del cardiaco ingegnerizzato tessuto11.

L'implementazione di TFM e MSM insieme può essere suddivisa in tre fasi essenziali che devono essere eseguite nel seguente ordine: in primo luogo, vengono determinate le deformazioni dell'idrogel prodotte dalle cellule; in secondo luogo, le trazioni vengono recuperate dalle deformazioni degli idrogel; e terzo, un approccio a elemento finito viene utilizzato per calcolare le sollecitazioni intercellulari normali e di taglio all'interno dell'intero monostrato. Per calcolare gli spostamenti di gel, le immagini di perline di fluorescenza con le cellule sono state confrontate con l'immagine di perline di riferimento (senza cellule) utilizzando una routine di velocitàmetria dell'immagine di particella (PIV) scritta su misura. Le dimensioni e la sovrapposizione della finestra di correlazione incrociata per l'analisi PIV sono state scelte rispettivamente per 32 x 32 pixel e 0,5. A questo punto, gli spostamenti dei pixel sono stati convertiti in micron moltiplicandosi con un fattore di conversione da pixel a micron (per il nostro microscopio, questo fattore di conversione è 0,65) per ottenere spostamenti in piano. Gli errori associati all'ignorare gli spostamenti fuori piano sono trascurabili12,13. Dopo il calcolo degli spostamenti in gel, ci sono due tipi di misurazioni di trazione che possono essere utilizzate, trazioni vincolate e trazioni non vincolate8,14. Le trazioni non vincolate forniscono il campo di trazione per l'intero campo visivo (comprese le regioni con e senza celle), mentre le trazioni vincolate forniscono il campo di trazione solo per le regioni che includono le celle14. Quindi, le sollecitazioni intercellulari vengono calcolate utilizzando la microscopia a stress monomero (MSM), che è un'estensione della microscopia a forza di trazione. L'attuazione di MSM si basa sull'assunto che le trazioni locali esercitate da un monostrato di cellule nell'interfaccia cellulare-substrato devono essere bilanciate da forze meccaniche trasmesse tra le cellule all'interfaccia cellulare, come richiesto dalle leggi di Newton7 ,12,13. Un presupposto chiave qui è che il monostrato cellulare può essere trattato come un foglio elastico sottile perché la distribuzione di trazione nel monostrato è nota e l'equilibrio di forza non dipende dalle proprietà del materiale cellulare. Un'altra ipotesi chiave è che le forze di trazione sono bilanciate da sollecitazioni intercellulari locali all'interno del campo visivo ottico (all'interno del monostrato) e l'influenza di questo equilibrio di forza è minima nella regione distale (al di fuori del monostrato)13. Pertanto, le condizioni di contorno definite da sollecitazioni intercellulari, spostamenti o una combinazione di entrambi al limite del monostrato sono cruciali per eseguire MSM13. Tenendo conto delle informazioni di cui sopra, utilizziamo MSM per eseguire un'analisi degli elementi finiti (FEM) per recuperare la sollecitazione massima principale(-max) e la sollecitazione principale minima(zmin)ruotando il piano di sollecitazione in ogni punto all'interno del Monostrato. Queste sollecitazioni principali vengono successivamente utilizzate per calcolare la media 2Ddella normale sollecitazione intercellulare [(((max 12,13. Questa procedura è descritta in dettaglio da Tambe etal.

La microscopia a stress monostrato (MSM) consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari cellulari generate all'interno di un monostrato6,7,8,12,13. Questi stress intercellulari sono stati suggeriti per essere importanti per la crescita e la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro12,15,16,17. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite per essere importanti anche nella migrazione delle cellule endoteliali e nella funzione di barriera endoteliale17,18. Mentre le giunzioni cellulari-cellule come giunzioni strette e giunzioni di adesione sono state entrambe suggerite per svolgere un ruolo critico nella generazione e trasmissione della sollecitazione intercellulare endoteliale, il ruolo delle giunzioni gap rimane sfuggente. Le giunzioni gap collegano fisicamente celle adiacenti e forniscono un percorso per la corrente elettrica e le molecole (<1 KDa) per passare tra le celle vicine19,20,21. Sebbene le cellule endoteliali esprimano le giunzioni gap Cx37, Cx40 e Cx4319,22, Cx43 è probabilmente la più importante in termini di progressione della malattia23. Prova dell'importanza di Cx43 può essere trovato nel fatto che la delezione genetica di Cx43 nei topi si traduce in ipotensione24 e ha effetti negativi sull'angiogenesi25. Inoltre, Cx43 è stato documentato per essere importante per la migrazione cellulare e la proliferazione e nella progressione dell'aterosclerosi18,22,23,24,25 .

In questo protocollo, abbiamo usato TFM e MSM per studiare se la generazione di trazione e stress intercellulare all'interno del monostrato confluente e endoteliale sarebbe stata influenzata dall'interruzione della giunzione del gap endoteliale Cx43. Abbiamo interrotto Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molecola documentata per inibire l'espressione Cx4326. Chalcone è stato usato per interrompere cx43 invece di siRNA come chalcone è stato segnalato in precedenza da Lee et al. per interrompere l'espressione Cx4326. Inoltre, eravamo particolarmente interessati all'influenza di chalcone sull'endotelio in quanto è stato anche segnalato per essere un composto anti-infiammatorio e anti-platelet che può essere potenzialmente utilizzato per la prevenzione e il trattamento di vari vascolari patologie26. I trattamenti Chalcone sono stati eseguiti un'ora dopo l'inizio dell'esperimento, i monostrati trattati con chalcone sono stati immagini per un totale di sei ore e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con un codice MATLAB scritto su misura per determinare le trazioni e successivamente intercellulare Sottolinea. I nostri risultati hanno mostrato una diminuzione complessiva delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari, suggerendo che il Cx43 gioca un ruolo chiave nella biomeccanica endoteliale.

Protocollo

1. Produrre gel poliacrilammide (PA)

  1. Preparazione del piatto Petri
    1. Preparare la soluzione legare la soluzione silarante mescolando 200 mL di acqua ultrapura con 80 .L acido acetico e 50 .L di 3-(trimethoxysilyl)methacrylato. Bind silane è una soluzione utilizzata per funzionalizzare la superficie della piastra Petri fondo di vetro per l'attacco idrogel.
    2. Mescolare la soluzione di sbarramento su una piastra di mescolare per almeno 1 h.
    3. Trattare il pozzo centrale della piastra Petri con soluzione silano a scalo per 45 min.
    4. Rimuovere la soluzione silaceri di rilegamento e sciacquare la piastra Petri con acqua ultra-pura 2x-3x.
    5. Asciugare la superficie del piatto Petri e conservarla a temperatura ambiente per un uso futuro.
  2. Preparazione della soluzione idrogel
    1. Mescolare acqua ultra-pura, 40% acrilammide e 2% bis-acrilamide in un tubo di centrifuga di 15 mL secondo la tabella 1.
    2. Aggiungere 80 gradi di perline fluorescenti alla soluzione idrogel.
    3. Scuotere delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel.
    4. Stringere leggermente il tappo del tubo sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto.
    5. Degas la soluzione gel per almeno 45 min nella camera a vuoto.
  3. Polimerizzazione idrogel
    1. In primo luogo, aggiungere 75 L del 10% di persolto di ammonio (disciolto in acqua ultrapura) e poi aggiungere 8 -L di TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) alla soluzione idrogel.
    2. Collocare 24 - L di soluzione idrogel al centro del piatto Petri (vedi tabella 2).
    3. Utilizzare un coperchio da 18 mm per appiattire l'idrogel. Questo darà un'altezza di 100 m.
    4. Attendere almeno 30-40 min per la polimerizzazione gel.
    5. Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultrapura per prevenire la disidratazione del gel.
    6. Coprire il piatto Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento di perline fluorescenti e conservare a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Gli idrogel possono essere conservati per un periodo fino a 3 mesi, ma si suggerisce che questi gel siano utilizzati non più di 1 settimana dopo la fabbricazione per ottenere i migliori risultati.

2. Cultura cellulare

  1. Coltura cellule endoteliali ombelicali (HUVEC) nel mezzo di coltura cellulare 200 (vedi Tabella dei materiali) integrato con 1% penicillina-streptomicina su flaconi rivestiti di gelatina 0.1% a 37 gradi centigradi e 5% CO2.

3. Preparazione stencil Micropattern

  1. Curare un sottile strato di polidimetetiloxane (PDMS) in una parabola Petri da 100 mm mescolando la base in silicone con l'agente di polimerazione in silicone a un rapporto di 20:1 (base: agente di polimerità).
    NOTA: È possibile utilizzare altri rapporti agente di base (ad es. 10:1 o 30:1). Tuttavia, un rapporto tra base e agente di polimerità inferiore produrrà un modello più rigido, mentre un rapporto base-agente di stagionatura più alto produrrà un modello più morbido.
  2. Preparare una soluzione PDMS 20:1 (agente di base:stagionatura) e mescolare con cura in un tubo di centrifuga di 50 mL. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS, in quanto la miscelazione non uniforme si tradurrà in una polimerizzazione incompleta.
  3. Rimuovere le bolle introdotte dal passaggio precedente centrifudendo la soluzione PDMS per 1 min a 190 x g.
  4. Versare 5-6 mL di soluzione PDMS al centro di una parabola Petri da 100 mm e agitare il piatto fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra Petri.
  5. Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi centigradi. Il PDMS può anche essere curato a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 mm di diametro con un perforatore.
  7. Utilizzare un punzone biopsia per creare piccoli fori nello stencil PDMS. Questo protocollo utilizza un punzone biopsia di 1,25 mm di diametro.
  8. Sterilizzare gli stencil PDMS prima immergendoli nel 70% di etanolo per 2-3 min, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionando sotto una luce UV per 5 min.

4. Rivestimento idrogel collagen-i

  1. Togliere il coperchio dall'idrogel e aspirare qualsiasi liquido in eccesso.
  2. Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel.
    NOTA: Le pinzette possono essere utilizzate per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie idrogel. I nostri stencil PDMS sono a tenuta d'acqua e quindi impediscono l'accesso all'acqua tra la superficie superiore del gel e la superficie inferiore dello stencil PDMS. Inoltre, la rigidità dell'idrogel non deve essere regolata rispetto alla rigidità del PDMS.
  3. Coprire la superficie idrogel con sulfosucciminimidyl-6-(4-azido-2-nitrophelamino) esanotato (sulfo-SANPAH) sciolto in una soluzione cuscinetto da 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanethanesulfonic) con una concentrazione di 1 : 1000 e posta sotto uv lampada (potenza 36 W) per 8 min.
  4. Aspirati la soluzione solfo-SANPAH e HEPES in eccesso e risciacquano due volte l'idrogel con 0,1 M DI HEPES seguiti da altri due risciacquo con acqua ultra-pura.
  5. Aspirare l'acqua ultrapura e gli idrogel del mantello con 0,1 mg/mL di collagene-I durante la notte a 4 gradi centigradi.
  6. Coprire i piatti e proteggere le perline fluorescenti dal fotosbiancamento.
    NOTA: gli stencil PDMS vengono utilizzati per creare monostrati micromodellati. I monostrati micropattern sono utilizzati in quanto consentono di osservare contemporaneamente più monostrati della stessa geometria e delle stesse dimensioni durante ogni esperimento. Tuttavia, se i micromodelli non sono desiderati, i passaggi precedenti possono essere seguiti con l'eccezione del passaggio 4.2.

5. Creazione di monostrati HUVEC su idrogel

  1. Utilizzare 1x di prova per staccare le cellule dai flaconi di coltura tissutale per 3-5 min nell'incubatrice.
  2. Dopo la prova, aggiungere i supporti di coltura cellulare alla soluzione trypsin e aggiungere al tubo di centrifuga di 15 mL.
  3. Centrifugare la soluzione cellulare per 3 min a 1710 x g. Un piccolo pellet bianco di cellule dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo di centrifuga.
  4. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule nei media ad una concentrazione di 50 x 104 cellule / mL.
  5. Rimuovere il collagene-I dall'idrogel e risciacquare 1x con PBS.
  6. Aggiungete 75 x 103 celle nella parte superiore dello stencil PDMS e permettete alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno 1 h nell'incubatrice a 37 e 5% di CO2.
  7. Rimuovere lo stencil PDMS e aggiungere almeno 2 mL di supporti al piatto Petri. Immergere lo stencil PDMS in 10x trypsin per rimuovere eventuali cellule collegate e sterilizzare spruzzando con 70% etanolo e poi mettendo sotto la luce UV per 5 min.
  8. Mettere il piatto Petri nell'incubatrice e attendere almeno 36 h o fino a quando non viene osservato un monostrato confluente.

6. 2,5 trattamento dihydroxychalcone per l'interruzione di Cx43

  1. Sciogliere 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) in ditilfossido di dimetilzot (DMSO) per creare una soluzione stock da 0,1875 mg/mL.
  2. Diluire la soluzione di stock con i mezzi di coltura cellulare per creare una bassa concentrazione di chalcone (0,2 g/mL) e un'alta concentrazione di chalcone (2 g/mL) aliquota.

7. Acquisizione dei dati

  1. Individuare le isole cellulari con un microscopio.
  2. Acquisire il contrasto di fase e le immagini di perline per la morfologia delle cellule di immagine e spostamenti di idrogel, rispettivamente.
    NOTA: questo protocollo utilizzava un obiettivo 10x per l'acquisizione dei dati.
  3. Alla fine dell'esperimento, scollegare le cellule con 10x trypsin e acquisire un'immagine della superficie del gel senza cellule (immagine di riferimento).

8. Immunostaining

  1. Fissare monostrati con 4% formaldeide e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.
  2. Rimuovere il 4% di formaldeide e aggiungere 0.2% Triton X-100 per 5 min a 37 gradi centigradi per permeabilizzare le cellule.
  3. Rimuovere lo 0,2% Triton X-100 e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.
  4. Coprire il monostrato con la soluzione 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 45 min a 37 gradi centigradi.
  5. Rimuovere la soluzione BSA del 2% e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.
  6. Aggiungere al campione l'anticorpo primario Cx43 ad una concentrazione di 1:400 e incubare pertutta la notte.
  7. Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare il campione con PBS 2x-3x.
  8. Aggiungere l'anticorpo secondario ad una concentrazione di 3:200 e incubare per 2 h a 37 .
    NOTA: i campioni devono essere coperti per evitare il fotosbiancamento.
  9. Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare con PBS 2x-3x.
  10. Campione di copertura con supporto di montaggio (Fluromount-G DAPI) e guaritivo con coperchio da 18 mm.

9. Implementazione della microscopia a forza di trazione (TFM) e della microscopia a stress monostrato (MSM)

  1. Calcolo della deformazione dell'idrogel
    NOTA: di seguito è riportata una procedura di calcolo dello spostamento passo-passo utilizzando MATLAB.
    1. Aprire il file traction.m principale in MATLAB (per tutte le routine MATLAB vedere Materiali supplementari).
      NOTA: seguire le istruzioni fornite nel codice per impostare la directory MATLAB.
    2. Definisci le seguenti variabili: formato immagine, conversione pixel-micron, modulo di Young, rapporto di Poisson e obiettivo del microscopio.
    3. Individuate il tallone, l'immagine trypsin e l'immagine di fase utilizzando la subroutine OpenFiles.
      NOTA: per set di dati di grandi dimensioni, è consigliabile denominare i file in ordine sequenziale. Ad esempio, i file devono essere denominati "nomefile1.tif", "nomefile2.tif" e così via.
    4. Definire un ROI quadrato (regione di interesse) intorno al monostrato di cella ed eseguire la subroutine cell_cropper per ritagliare l'immagine originale.
    5. Eseguire la subroutine di displacement_finder per calcolare gli spostamenti.
    6. Eseguire la subroutine Dedrift per rimuovere eventuali spostamenti non cellulari aggiuntivi che possono essere dovuti alla deriva dello stadio al microscopio.
  2. Calcolo delle trazioni
    NOTA: Qui, le trazioni non vincolate vengono calcolate utilizzando la nostra routine MATLAB scritta su misura. Il calcolo della trazione passo dopo passo utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza è riportato di seguito.
    1. Definire le seguenti variabili all'interno della routine traction.m: condizione limite, spessore del gel, altezza del gel e dedrift.
    2. Eseguire la subroutine traction_finder per calcolare le trazioni ed eseguire la subroutine plot_traction per tracciare le trazioni. Tutte le trazioni in direzione x (Tx) e direzione y (Ty) insieme alle corrispondenti posizioni dei pixel possono essere trovate in un file traction.dat che verrà generato dal codice.
  3. Calcolo delle sollecitazioni intercellulari
    NOTA: Di seguito sono riportate le istruzioni passo passo per il calcolo della sollecitazione intercellulare utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza.
    1. Eseguite la subroutine mark_circular_domain per specificare il limite del monostrato. Questa routine richiederà all'utente di disegnare manualmente un contorno intorno al monostrato per tutte le immagini di fase ritagliate in sequenza. Nota gli nXPt generati nella finestra di comando e usali in un secondo momento come parametri della griglia sia nell'asse X che nell'asse Y per l'analisi FEM (vedere il passaggio 9.3.2).
    2. Eseguire Run_StressCode per calcolare le sollecitazioni intercellulari. Questa subroutine legge direttamente i parametri dal file "model.in" ed esegue "island.exe" per eseguire l'analisi FEM. Prima di eseguire questa routine, assicurarsi che tutti i parametri nel file model.in, ad esempio i parametri della griglia nella conversione X e Y, pixel a micron, modulo di Young del gel, rapporto di Poisson, altezza del monostrato e pattern monostrato (striscia o foro), siano modificati Correttamente.
    3. Tracciate tutti i risultati FEM utilizzando la subroutine plot_FEM_results.
      NOTA: tutti i risultati generati verranno automaticamente memorizzati nella cartella Risultati nella directory MATLAB.

Risultati

Le immagini a contrasto di fase del controllo, 0,2 g/mL e 2 monostrati di chalcone trattati con chalcone di fase sono state scattate 30 minuti prima del trattamento dei chalcone (Figura 1A-C) e 2 ore dopo il trattamento dei chalcone (Figura 1D-F). Sono stati osservati spostamenti di perline indotta da cellule (m) diminuire sia nelle condizioni di chalcone a bassa dose che in condizioni di chalcon...

Discussione

Il nostro gruppo, così come altri, ha utilizzato con successo TFM e MSM per sondare l'influenza delle giunzioni cellula-cellula in vari processi cellulari patologici e fisiologici in vitro7,15,18,27 . Per esempio, Hardin e altri hanno presentato uno studio molto approfondito che suggerisce guide di trasmissione intercellulare della trasmissione della stress la formazione di gap paracellulare n...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università della Florida centrale e dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institute of Health sotto il premio K25HL132098.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
18 mm coverslipThermoFisher18CIR-1Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamideBIO-RAD1610143Component of polyacrylamide gel
2′,5′-DihydroxychalconeSIGMAIDF00046To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSIGMA2530-85-0Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% AcrylamideBIO-RAD1610140Component of polyacrylamide gel
Acetic acidFisher-Sceintific64-19-7Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;ThermoFisherCatalog # A-11001Secondary antibody
Ammonium persulfateBIO-RAD1610700Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)SIGMA9048-46-8To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mLAdvance Biomatrix5005-100MLUse as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)Fisher-Sceintific21040CVBuffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagentsFisher-Sceintific67-68-5To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPIThermoFisher00-4959-52Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beadsThermoFisherF88120.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 MSIGMA7365-45-9Essential to
LVESThermoFisherA1460801Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200ThermoFisherM200500Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)ThermoFisherCatalog #13-8300Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)CellVisD35-20-1.5H35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mgProteochem102568-43-4Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW corning2646340Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMEDBIO-RAD1610801Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100SIGMA9002-93-1To permeabilize cells
Trypsin -EDTAThermoFisher25300054Used to detach cells

Riferimenti

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

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