通过 Connexin 43 结构中断干扰内皮生物力学

摘要

在这里，我们提出了一个基于力学的协议，以破坏间隙结康康辛43，并通过观察牵引力和细胞间应力测量其对内皮生物力学的后续影响。

摘要

内皮细胞已经建立，以产生细胞间应力和牵引，但间隙结在内皮细胞间应力和牵引生成中的作用目前尚不清楚。因此，我们在这里提出了一个基于力学的协议，通过向已知的Cx43抑制剂2，5-二羟基沙酮（chalcone）和测量该抑制剂对牵引力和细胞间应力的影响。我们提出了具有代表性的结果，与对照相比，在高沙酮剂量（2微克/mL）下，牵引力和细胞间应力均有所下降。该协议不仅适用于 Cx43，还适用于其他间隙结，前提是使用适当的抑制剂。我们相信，该协议将在心血管和美能生物学研究领域有用。

引言

研究物理力和机械特性对细胞和组织生理学和病理学的影响的领域被称为机械^{生物学1。}在微量生物学中已经应用的一些有用的技术是单层应力显微镜和牵引力显微镜。牵引力显微镜允许计算在细胞基板界面生成的牵引力，而单层应力显微镜允许计算单层2内相邻细胞之间产生的细胞间应力 ^{，3，4，5，6}.从以前的方法得出的结果表明，细胞源的机械应力在决定一系列细胞^{过程3、4、5}的命运中起着至关重要的作用。例如，在暴露于外部机械力时，作为集体迁移的一组细胞可以改变其形态，使其形状极化，从而沿施加力的方向对齐和迁移，部分产生牵引力^{7， 8}.牵引力提供可用于评估细胞收缩性且使用牵引力显微镜 （TFM） 计算的指标。牵引力显微镜 （TFM） 首先确定细胞引起的基板变形，然后使用数学严谨的基于力学的计算方法计算牵引场。由于计算牵引力的能力已经存在了相当长的时间，研究人员利用TFM揭示了牵引力对一系列过程的影响，包括^癌症9、伤口^愈合10和工程心脏评估组织¹¹.

TFM和MSM的实现可以分为三个基本步骤，必须按以下顺序执行:第一，确定细胞产生的水凝胶变形;第二，从水凝胶变形中恢复牵引力;第三，使用有限元法计算整个单层内的法线和剪切细胞间应力。为了计算凝胶位移，使用自定义编写的粒子图像速度测量（PIV）例程，将具有细胞的荧光珠图像与参考珠图像（无细胞）进行比较。PIV 分析的交叉关联窗口大小和重叠分别选择为 32 x 32 像素和 0.5 像素。此时，像素偏移被转换为微米，通过乘以像素到微米的转换系数（对于我们的显微镜，此转换系数为 0.65）来获得平面内位移。与忽略平面外位移相关的错误可以^{忽略12，13。}在计算凝胶位移后，可以使用两种类型的牵引力测量，约束牵引力和无约束牵引力^8、14。无约束牵引力为整个视场（包括带单元和无单元的区域）提供牵引场，而约束牵引力仅为包含单元¹⁴的区域提供牵引场。然后，使用单层应力显微镜（MSM）计算细胞间应力，这是牵引力显微镜的延伸。MSM的实现基于以下假设:细胞基质界面上单层细胞施加的局部牵引力必须按照牛顿定律7 的要求，通过细胞-细胞界面上的细胞之间传输的机械力来平衡。 ^，12，13.此处的一个关键假设是，细胞单层可以被视为薄弹性片，因为单层中的牵引力分布是已知的，并且力平衡不依赖于细胞材料属性。另一个关键假设是牵引力由光学视场（单层内）内的局部细胞间应力平衡，这种力平衡在远端区域（单层^外）13中的影响最小。因此，由细胞间应力、位移或单层边界处两者的组合定义的边界条件对于执行 MSM¹³至关重要。考虑到上述信息，我们利用 MSM 执行有限元分析 （FEM）， 通过在膜。这些主应力随后用于计算整个单层内的 2D 平均正常细胞间应力_{[（[ 最大值}] ±_最小） /2] 和 2D 最大剪切细胞间应力 [（[_最大值- ±_最小] /2]^12，13.Tambe^{等人12、13}更详细地描述了这一过程。

单层应力显微镜（MSM）允许计算在单^{层6、7、8、12、13}内产生的细胞细胞间应力。这些细胞间应力被建议是重要的组织生长和修复，伤口愈合，和癌症转移12，15，16，17。此外，细胞间应力也被认为在内皮细胞迁移和内皮屏障^{功能17，18}也很重要。虽然细胞-细胞结，如紧密结和附着结都建议在内皮细胞间应力生成和传输中发挥关键作用，但间隙结的作用仍然难以捉摸。间隙结物理地连接相邻的细胞，为电流和分子（<1 KDa）在相邻^{细胞19、20、21}之间传递提供一条通道。虽然内皮细胞表达Cx37，Cx40和Cx43间隙结19，22，Cx43可以说是最重要的疾病^进展23。Cx43的重要性的证据可以发现的事实，在小鼠的Cx43基因删除导致低^血压24，并有不良影响的血管^生成25。此外，Cx43 已被记录为重要的细胞迁移和增殖和动脉粥样硬化的进展^{18，22，23，24，25}.

在此协议中，我们使用 TFM 和 MSM 来调查在交波内皮单层内产生的牵引力和细胞间应力是否会受到内皮间隙结 Cx43 中断的影响。我们用2，5-二羟基沙酮（chalcone）扰乱了Cx43，一种被记录抑制Cx43^表达26的分子。查尔酮被用来破坏Cx43，而不是siRNA，因为查尔酮以前曾被李等人报道，以扰乱Cx43^表达26。此外，我们对沙酮对内皮的影响特别感兴趣，因为它也被报道为抗炎和抗血小板化合物，可能可用于预防和治疗各种血管^病理学26。在实验开始一小时后进行切尔酮处理，对经过切尔酮处理的单层共成像6小时，并使用定制编写的MATLAB代码进行图像处理，以确定牵引力和随后的细胞间应力。我们的结果显示，牵引力和细胞间应力总体下降，这表明 Cx43 在内皮生物力学中起着关键作用。

研究方案

1. 制造聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶

1. 培养培养皿
   1. 通过将 200 mL 超纯水与 80 μL 醋酸和 50 μL 3-（三聚氧硅）丙酸丙烯酸混合制备结合硅烷溶液。粘结硅烷是一种用于使玻璃底部培养皿表面功能化用于水凝胶附件的解决方案。
   2. 在搅拌板上搅拌结合硅烷溶液至少 1 小时。
   3. 用结合硅烷溶液处理培养皿的中心，45分钟。
   4. 去除结合硅烷溶液，用超纯水2x-3x冲洗培养皿。
   5. 干燥培养皿表面，并在室温下储存，以供将来使用。
2. 水凝胶溶液的制备
   1. 根据表1，在15 mL离心管中混合超纯水、40%丙烯酰胺和2%丙烯酰胺。
   2. 在水凝胶溶液中加入80μL荧光珠。
   3. 轻轻摇动管，将珠子与凝胶溶液混合。
   4. 轻轻拧紧离心管上的管盖，并放入真空室。
   5. 在真空室中脱气凝胶溶液至少45分钟。
3. 水凝胶聚合
   1. 首先，加入75μL的10%过硫酸铵（溶解在超纯水中），然后在水凝胶溶液中加入8μL的TEMED（N，N，N'，N'-四甲基甲烷-1，2-二胺）。
   2. 将 24 μL 的水凝胶溶液放在培养皿的中心（参见表2）。
   3. 使用 18 mm 盖玻片将水凝胶压平。这将给出 ±100 μm 的高度。
   4. 等待至少30-40分钟的凝胶聚合。
   5. 将聚合水凝胶浸入超纯水中，防止凝胶脱水。
   6. 用铝箔盖住培养皿，防止荧光珠的光漂白，并储存在4°C。
      注:水凝胶可储存长达3个月，但建议在制造后不超过1周使用，以获得最佳效果。

2. 细胞培养

1. 培养人类脐带静脉内皮细胞（HUVECs）在细胞培养基200（见材料表）补充1%青霉素-链霉素在0.1%明胶涂层烧瓶在37°C和5%CO_2。

3. 微型模具制备

1. 将硅胶基与硅胶固化剂以20:1的比例混合在100毫米培养皿中，固化一层薄薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
   注: 可以使用其他碱基固化剂比率（例如 10:1 或 30:1）。然而，较低的基固化剂比将产生更硬的图案，而较高的基固化剂比将产生较软的图案。
2. 准备 20:1（碱基:固化剂）PDMS 溶液，并仔细混合在 50 mL 离心管中。倒置管并剧烈摇动多次，以确保PDMS溶液的正确混合，因为不均匀的混合将导致不完整的聚合。
3. 通过使 PDMS 溶液在 190 x g下离心 1 分钟，去除从上述步骤中引入的气泡。
4. 将 5-6 mL 的 PDMS 溶液倒入 100 mm 培养皿的中心，搅拌培养皿，直到 PDMS 溶液覆盖整个培养皿表面。
5. 在50-60°C下整夜固化PDMS溶液。PDMS 也可在室温下固化。
6. 拆下带孔打孔器的圆形、直径为 16 mm 的 PDMS 模具。
7. 使用活检冲孔在 PDMS 模具中创建小孔。该协议使用直径为 1.25 mm 的活检冲床。
8. 先将PDMS模具浸入70%乙醇中2-3分钟，吸走多余的乙醇，然后在紫外线下放置5分钟，从而对PDMS模具进行消毒。

4. 胶原蛋白-I水凝胶涂层

1. 从水凝胶中取出盖玻片，吸出任何多余的液体。
2. 将 PDMS 模具放在水凝胶表面上。
   注: 钳子可用于对 PDMS 模具施加轻压，以确保 PDMS 模具和水凝胶表面之间的防水密封。我们的 PDMS 模具防水，因此可防止凝胶顶部表面和 PDMS 模具底面之间的水进入。此外，水凝胶刚度也无需根据 PDMS 刚度进行调整。
3. 用磺酸二甲酰6-（4-阿齐多-2-硝基苯甲酸）六溴二苯丙胺（磺胺-SANPAH）覆盖水凝胶表面，溶解在0.1 M HEPES（4-（2-羟基乙酸）-1-管乙酸乙酸，浓度为1:1000，置于紫外线下灯（功率 36 W）8 分钟。
4. 吸出多余的磺酸-SANPAH和HEPES溶液，用0.1 M HEPES冲洗水凝胶两次，然后用超纯水再冲洗两次。
5. 吸出过量的超纯水和涂覆水凝胶与0.1毫克/mL胶原蛋白-I过夜在4°C。
6. 盖住盘子，防止荧光珠光漂白。
   注: PDMS 模具用于创建微图案单层。微图案单层被利用，因为它们允许在每次实验中同时观察到多个具有相同几何和尺寸的单层。但是，如果不需要微模式，则可以执行上述步骤，但步骤 4.2 除外。

5. 在水凝胶上创建HUVEC单层

1. 使用1x胰蛋白酶从组织培养瓶中分离细胞3-5分钟在培养箱中。
2. 胰蛋白酶化后，将细胞培养基剂添加到胰蛋白酶溶液中，并加入15 mL离心管。
3. 在1710 x g下将细胞溶液离心3分钟。在离心机管的底部应可见一小粒白色细胞。
4. 吸出上清液，在介质中重新悬浮细胞，浓度为50 x 10⁴细胞/mL。
5. 从水凝胶中取出胶原蛋白I，用PBS冲洗1x。
6. 在PDMS模具顶部加入75×10³细胞，使细胞在37°C和5%CO₂的培养箱中附着在水凝胶表面至少1小时。
7. 拆下 PDMS 模具，并将至少 2 mL 的介质添加到培养皿中。将 PDMS 模具浸入 10x 胰蛋白酶中，以去除任何附着的细胞，然后使用 70% 乙醇喷洒，然后在紫外线下放置 5 分钟，进行灭菌。
8. 将培养皿放入培养箱中，等待至少 36 小时或直到观察到汇合单层。

6. 2，5 二羟基沙尔克酮治疗Cx43中断

1. 在二甲基硫酸盐（DMSO）中溶解2，5二羟基沙酮（chalcone），以制造0.1875mg/mL库存溶液。
2. 用细胞培养基稀释库存溶液，使低沙卡酮浓度（0.2微克/mL）等分和高沙酮浓度（2微克/mL）等分。

7. 数据采集

1. 用显微镜定位细胞岛。
2. 分别采集相位对比度和珠子图像，以成像细胞形态和水凝胶位移。
   注: 此协议使用 10 倍目标进行数据采集。
3. 在实验结束时，分离具有10倍胰蛋白酶的细胞，并获取无细胞的凝胶表面图像（参考图像）。

8. 免疫染色

1. 用4%甲醛固定单层，在37°C孵育15分钟。
2. 去除4%甲醛，在37°C下加入0.2%的Triton X-100，5分钟，以渗透细胞。
3. 取出 0.2% Triton X-100，用 PBS 2x-3x 冲洗单层。
4. 在37°C下用2%牛血清白蛋白（BSA）溶液覆盖单层45分钟。
5. 取出 2% 的 BSA 溶液，用 PBS 2x-3x 冲洗单层。
6. 在样品中加入浓度为1:400的原生Cx43抗体，并在4°C下孵育过夜。
7. 取出原抗体，用PBS 2x-3x冲洗样品。
8. 在3:200浓度下加入二级抗体，在37°C下孵育2小时。
   注:应覆盖样品，以防止光漂白。
9. 去除二次抗体，用PBS 2x-3x冲洗。
10. 用安装介质（Fluromount-G DAPI）盖住样品，用18 mm盖滑盖密封。

9. 实施牵引力显微镜（TFM）和单层应力显微镜（MSM）

1. 水凝胶变形计算
   注: 下面给出了使用 MATLAB 的分步位移计算过程。
   1. 在 MATLAB 中打开主牵引.m文件（对于所有 MATLAB 例程，请参阅补充材料）。
      注: 按照代码中提供的说明设置 MATLAB 目录。
   2. 定义以下变量:图像格式、像素到微米转换、Young 的模量、泊森的比率和显微镜目标。
   3. 使用OpenFiles子例程定位珠子、胰蛋白酶图像和相位图像。
      注: 对于大型数据集，最好按顺序命名文件。例如，文件应命名为"文件名1.tif"、"文件名2.tif"等。
   4. 定义围绕细胞单层的方形 ROI（感兴趣区域），并执行单元格_cropper子例程以裁剪原始图像。
   5. 执行置换查找器子例程以计算位移。
   6. 执行去漂移子例程，以去除可能由于显微镜级漂移而导致的任何其他非蜂窝位移。
2. 牵引力的计算
   注:此处，使用我们自定义编写的 MATLAB 例程计算无约束牵引力。下面给出了使用前面提到的 MATLAB 例程的逐步牵引计算。
   1. 在traction.m例程中定义以下变量:边界条件、凝胶厚度、凝胶高度和漂移。
   2. 执行牵引_查找器子例程以计算牵引力并执行绘图-牵引子例程以绘制牵引力。X 方向 （Tx） 和 y 方向 （Ty） 的所有牵引力及其相应的像素位置都可以在由代码生成的 traction.dat 文件中找到。
3. 细胞间应力的计算
   注:下面给出了使用前面提到的MATLAB例程进行细胞间压力计算的分步说明。
   1. 执行标记_循环_域子例程以指定单层边界。此例程将按顺序提示所有裁剪的阶段图像，以便用户手动在单层周围绘制边界。记下在命令窗口中生成的 nXPt，并在以后将它们用作 X 轴和 Y 轴中的网格参数以进行 FEM 分析（请参阅步骤 9.3.2）。
   2. 执行运行应力代码以计算细胞间应力。此子例程直接从"model.in"文件中读取参数，并执行"island.exe"以执行 FEM 分析。在运行此例程之前，请确保编辑model.in文件中的所有参数，即 X 和 Y 中的网格参数、像素到微米转换、Young 凝胶的模量、泊层比、单层高度和单层图案（条带或孔）正确。
   3. 使用绘图_FEM_结果子例程绘制所有 FEM 结果。
      注: 生成的所有结果将自动存储在 MATLAB 目录中的"结果"文件夹中。

结果

控制相对比图像，0.2 μg/mL，和2微克/mL锥形处理单层在沙酮处理前30分钟（图1A-C）和2小时后处理沙酮（图1D-F）。与对照HUVEC单层相比，观察到细胞诱导的珠位移位（μm）在低剂量沙酮和高剂量沙酮条件下（图2E，F）均减少（图2D）。...

讨论

我们小组，以及其他小组，已经成功地使用TFM和MSM来探索细胞-细胞结^{在体外7、15、18、27}的各种病理和生理细胞过程中的影响.例如，哈丁等人提出了一个非常有见地的研究，表明细胞间应力传输指导了内皮^细胞15的准细胞间隙形成。虽然我们在这里报告的 Cx43 相关更改与 Hardin 等人报...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm coverslip	ThermoFisher	18CIR-1	Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide	BIO-RAD	1610143	Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone	SIGMA	IDF00046	To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	SIGMA	2530-85-0	Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide	BIO-RAD	1610140	Component of polyacrylamide gel
Acetic acid	Fisher-Sceintific	64-19-7	Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;	ThermoFisher	Catalog # A-11001	Secondary antibody
Ammonium persulfate	BIO-RAD	1610700	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	9048-46-8	To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL	Advance Biomatrix	5005-100ML	Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents	Fisher-Sceintific	67-68-5	To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI	ThermoFisher	00-4959-52	Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads	ThermoFisher	F8812	0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M	SIGMA	7365-45-9	Essential to
LVES	ThermoFisher	A1460801	Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200	ThermoFisher	M200500	Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)	ThermoFisher	Catalog #13-8300	Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)	CellVis	D35-20-1.5H	35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW corning	2646340	Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED	BIO-RAD	1610801	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	To permeabilize cells
Trypsin -EDTA	ThermoFisher	25300054	Used to detach cells