نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوه بخطوه لاعداد وزراعه الخنازير الانقسام أزرار القرنية. كما يظهر هذا النموذج العضوي المزروع عاده معدلات وفيات الخلايا في غضون 15 يوما ، مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية ، فانه يمثل النموذج الأول الذي يسمح للزراعة طويلة الأجل من القرنيات غير البشرية دون أضافه السامة ديكسان.

Abstract

يرتبط البحث التجريبي علي الخلايا البطانية القرنية مع العديد من الصعوبات. القرنيات المتبرعة البشرية نادره ونادرا ما تكون متاحه للتحقيقات التجريبية لأنها عاده ما تكون ضرورية لزرع. الخلايا البطانية الثقافات في كثير من الأحيان لا تترجم بشكل جيد في الحالات المجرية. نظرا للخصائص الهيكلية الحيوية لقرنيات غير البشرية ، فان تورم الورم اللحمية اثناء الزراعة يؤدي إلى فقدان الخلايا البطانية القرنية الكبيرة ، مما يجعل من الصعب القيام بالزراعة لفتره طويلة من الزمن. وتستخدم عوامل أزاله الترسبات مثل دكديكان لمواجهه هذه الاستجابة. ومع ذلك ، فانها تسبب أيضا فقدان الخلايا البطانية كبيره. ولذلك ، تم إنشاء نموذج ثقافة الجهاز السابق الجسم الذي لا يتطلب وكلاء القاع. واستخدمت عيون الخنازير من مسلخ محلي لاعداد أزرار القرنية الانقسام. بعد التراص الجزئي القرنية ، تمت أزاله الطبقات الخارجية من القرنية (ظهاره ، طبقه بومان ، وأجزاء من سدي). هذا يقلل بشكل كبير من فقدان الخلايا البطانية القرنية الناجمة عن تورم الورم الدموي الضخم وطي غشاء Descemet في جميع انحاء فترات زراعه أطول ويحسن الحفاظ العام علي طبقه الخلايا البطانية. وتبع ذلك أزاله القرنية الكاملة اللاحقة من الجزء المتبقي من زر القرنية من لمبة العين والزراعة. وتم تقييم كثافة الخلايا البطانية في أوقات المتابعة التي تصل إلى 15 يوما بعد الاعداد (اي الأيام 1 و 8 و 15) باستخدام المجهر الضوئي. تقنيه التحضير المستخدمة تسمح بحفظ أفضل لطبقه الخلايا البطانية التي يتم تمكينها من خلال تورم الانسجه الأقل تضخما ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الانحدار البطيء والخطي في انقسام أزرار القرنية مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية. وبما ان هذا النموذج الموحد للبحوث الذي يزرع عاده للمرة الاولي يسمح بزراعه مستقره لمده أسبوعين علي الأقل ، فهو بديل قيم لقرنيات المتبرعين البشريين بالنسبة للتحقيقات المستقبلية للعوامل الخارجية المختلفة فيما يتعلق الآثار علي بطانة القرنية.

Introduction

إجراءات زراعه القرنية هي من بين المزارع الأكثر شيوعا في جميع انحاء العالم¹. كما ان هناك نقص حاد في القرنيات المتبرعين البشرية ، والبحوث التجريبية التي تعالج الخلايا البطانية القرنية في القرنيات البشرية من الصعب أداء¹. ومع ذلك ، فان إدخال حلول الري وغيرها من المواد المستخدمة داخل العين ، والاجهزه البصرية المطاطية ، فضلا عن الاداات والتقنيات الجراحية (علي سبيل المثال ، أدوات الاستحلاب والتقنيات ، والطاقة الموجات فوق الصوتية) يتطلب تحقيقات صحيحه ومستفيضة فيما يتعلق بآثارها علي بطانة القرنية قبل الاستخدام السريري.

توجد بدائل قليله لقرنيات المتبرعين البشريين للبحوث. نماذج البحوث الحيوانية هي قيمه جدا ولكن في نفس الوقت تستهلك الموارد جدا وبشكل متزايد شكك أخلاقيا. العيب الرئيسي في ثقافات الخلايا الانبوبيه هو ترجمتها المحدودة للعين البشرية. النتائج التي تم الحصول عليها من ثقافات الخلايا يمكن ان تكون غير لائقه في ظروف الجسم الحي ، لان الخلايا قد تمر بمرحله انتقاليه البطانة الغشائية (EMT) ، مما يؤدي إلى الليفية مثل المورفولوجية الناجمة عن فقدان قطبيه الخلية والتغيرات في شكل الخلية والجينات التعبير².

في حين ذكرت السابقة نماذج الجسم القديم زراعه فترات تصل إلى 120 h فقط ، وهي تقنيه اعداد رواية لإنشاء نموذج ثقافة القرنية الغشاء الوركي الجهاز عن طريق ذبح القرنيات الخنازير الطازجة لمده 15 يوما علي الأقل وقد أدخلت مؤخرا^{3 ،4،5،6}. إذا تمت أزاله ظهاره القرنية وأجزاء من ستروما (حوالي 300 μm في المجموع) من القرنية قبل الزراعة ، يتم تقليل تورم سدي في انقسام أزرار القرنية مما ادي إلى فقدان اقل الخلايا البطانية وبطانية الحفاظ عليها بشكل جيد طبقه الخلية بعد ما يصل إلى 15 يوما ، في حين ان أزرار القرنية غير المنقسمة تظهر خسارة كبيره في الخلايا البطانية بسبب تورم الورم المفتول وتشكيل طيات Descemet. عاده ما تستخدم بنوك العيون عوامل التشبع بالهواء الخافض للحرارة مثل ديكدكان لتقليل تورم القرنيات قبل الزرع. ومع ذلك, وأظهرت هذه العوامل للحث علي زيادة فقدان الخلايا البطانية^7,8,9.

تهدف هذه المقالة إلى تصور هذا نموذج البحوث السابقة الفيفو الموحدة في بروتوكول مفصل خطوه بخطوه من أجل تمكين المحققين في المستقبل لاجراء البحوث علي بطانة القرنية باستخدام أزرار القرنية الانقسام. ويمثل هذا النموذج طريقه مباشره لاختبار المواد والتقنيات المستخدمة داخل العين ، مثل الاجهزه البصرية المطاطية ، وحلول الري ، وطاقة الموجات فوق الصوتية ، أو غيرها من الإجراءات التي يكون فيها بطانة القرنية من الفائدة.

Protocol

ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية الاخلاقيه لمؤسستنا. وفقا للنظام الأساسي للجنة المراجعة الاخلاقيه لمؤسستنا ، لم يكن يجب الحصول علي موافقه اخلاقيه قبل التجارب ، كما تم الحصول علي جميع القرنيات الخنازير من المسلخ المحلي.

1-ثقافة الجهاز

1. اعداد عيون الخنازير.
   1. من المسلخ المحلي ، والحصول علي عيون الخنازير التي تم ازالتها بعد الوفاة بفترة وجيزة ولكن قبل المعالجة الحرارية. نقل العينين إلى المختبر ومعالجتها في غضون ساعات قليله. اثناء النقل ، والحفاظ علي العينين في درجه حرارة الغرفة (حوالي 21 درجه مئوية) قبل المعالجة.
   2. أزاله جميع الادازل المدارية (عضلات العين ، الملتحمة ، الانسجه الدهنية) قبل التطهير باستخدام مقص العين وملقط كوليبري. افصل وتخلص من جميع العينين مع الصدمات الواضحة ، والاضرار الخارجية (علي سبيل المثال ، قطع سكين) ، أو البصرية القرنية المدن.
   3. اعداد 5 ٪ اليود--تلفزيوني--الحل (1:20) في كوب معقمه عن طريق أضافه 3 مل من 7.5 ٪ البوفيدون اليود إلى 57 ml من الفوسفات مخزنه المحلول الملحي (تلفزيوني). أيضا اعداد كاس معقمه منفصلة تحتوي علي 60 mL نقيه التلفزيونية.
      ملاحظه: المبلغ الإجمالي لاستخدام اليود--تلفزيوني--الحل وحجم الكاس يعتمد علي عدد من القرنيات التي سيتم تشريحها. خمسه إلى سته عيون تتطلب ما يقرب من 60 مل من 5 ٪-اليود-تلفزيوني-الحل ليتم تطهيرها بشكل صحيح.
   4. وضع خمسه إلى سته عيون في الحل 5 ٪-اليود-بسته دولارات لما مجموعه 5 دقيقه لتطهير بشكل صحيح سطح العينين. يحرك بعناية كل دقيقه لضمان الغمر الكامل لسطح العينين وتطهيرها تماما في محلول اليود.
   5. بعد 5 دقائق ، نقل العينين تطهيرها إلى كوب أعدت مليئه بالخدمات التلفزيونية البحتة. مره أخرى ، وأثاره بعناية لضمان يغسل اليود--تلفزيوني--الحل بعيدا عن سطح العينين.
      ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوة علي مقعد نظيفه لمنع تلوث العينين تطهيرها.
2. اعداد لوحات ثقافة الخلية.
   ملاحظه: تنفيذ الخطوات التالية علي مقاعد البدلاء نظيفه مع تدفق الهواء الرقائقي ثابت.
   1. ذوبان 2 مل من مصل الساق الجنينية (FCS). ملء حقنه (5 مل) مع FCS باستخدام cannula حاده. إفراغ حقنه من خلال فلتر حقنه (0.22 μm) لمنع كونتاميناتيونوف البكتيرية المحتملة FCS إلى 80 مل من المتوسطة الثقافة الحرة ديكسسين (المتوسط الأساسي الحد الأدنى [م] مع أملاح Earle ، البنسلين/ستربتوميسين ، L-الجلوتامين [200 mM] ، امهوتيريسين ب [250 ميكروغرام/مل] ، العازلة Hepes [1 م] [50x] ، ناهكو₃، والماء المقطر). اجتت الخليط لضمان توزيع الركيزة حتى.
   2. ملء كل بئر من 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا مع 3 مل من خليط الركيزة.
3. أداء التشريح والحضانة.
   ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوة علي مقعد نظيف. لا تلمس بطانة القرنية مع اي أدوات.
   1. نقل لمبة العين من الكاس مع تلفزيوني في حامل لمبة العين مع القرنية التي تواجه صعودا ووضعه تحت المجهر الجراحية العيون. استخدام حقنه مليئه 0.9 ٪ NaCl لتطبيق بعض الشفط قليلا علي العين علي حامل لمبة العين لتثبيت العين في موقف لتشريح.
   2. استخدام منقب (ø 7.5 mm) التي تحتوي علي بطانة موحده ، والتي تضمن عمق المرتجف لن يتجاوز 300 μm ، لقطع سطحيه في القرنية المركزية (الشكل 1ا).
   3. استخدم ملقط كوليبري ومشرط أحادي الاستخدام مع شفره مثلثه الشكل لقطع وأزاله جزء القرنية الجزئي للنمرة أفقيا من خلال سدي. تجاهل جزء القرنية المفصولة تتكون من ظهاره القرنية ، وطبقه بومان ، وجزء من سدي.
      ملاحظه: الحفاظ بدقه علي اتجاه القطع الأفقي للحصول علي سمك حتى من سدي المتبقية.
   4. سطحيا مكان 10-0 خياطه (10-0 بولياميد 6) في سدي لتكون قادره علي التفريق بين بطانية من الجانب المفتول خلال التجارب (الشكل 1ب). منع تغلغل بطانة القرنية. تجاهل لمبة العين إذا تم اختراق بطانة.
      ملاحظه: اختراق بطانة القرنية مع ابره خياطه ستكون مرئية ، كما السائل من غرفه العين الاماميه سوف يتسرب من خلال قناه خياطه.
   5. استخدام منقب دون ترصيع لدفع قطع المبرومة إلى عمق كامل حتى يتم التوصل إلى غرفه العين الاماميه (الشكل 1ج). ويمكن النظر إلى انخفاض واضح في المقاومة وتسرب السوائل من غرفه العين الاماميه بعد اختراق كامل من القرنية.
      ملاحظه: استخدام سكين الهوكي إذا بقي زر القرنية الانقسام المرفقة علي جانب واحد من زر القرنية الانقسام بعد التراص.
   6. نقل زر القرنية الانقسام التي تم الحصول عليها ، والتي تتكون الآن من جزء من سدي (الشكل 2) ، وغشاء Descemet ، وبطانة القرنية ، في الثقافة المتوسطة (الثقافة المتوسطة انا + FCS ، انظر القسم 1.2) في 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا مع الموسومة الجانب الذي يواجه أسفل, بحيث بطانة القرنية هو مواجهه.
      ملاحظه: إذا كان الجانب البطانية التي تواجه لأسفل ، قد تتلف البطانة.
   7. تعيين رقم فردي لكل زر القرنية الانقسام لتحديد الهوية اثناء المتابعة وتسميه الآبار علي لوحه ثقافة الخلية وفقا لذلك.
   8. احتضان لوحات ثقافة الخلايا المملوءة في حاضنه في ظل الظروف القياسية عند درجه حرارة 37 درجه مئوية ، و 5 ٪ CO₂ ورطوبة الهواء النسبية من 95 ٪. تغيير الثقافة المتوسطة (الثقافة المتوسطة I + FCS) في اليوم 8 إذا تم تجاوز فتره حضانة من 7 أيام.
      ملاحظه: تم التحقق من صحة اجراء الحضانة باستخدام أزرار القرنية الانقسام لمده تصل إلى 15 يوما.

الشكل 1: تشريح القرنية الخنازير للحصول علي أزرار القرنية الانقسام. (ا) بعد التخلص من القرنية باستخدام التريفين مع بطانة لقطع إلى عمق 300 ميكرومتر وأزاله ظهاره وأجزاء من الانسجه اللحمية ، (ب) يتم وضع خياطه بشكل سطحي في ستروما دون تغلغل القرنية. بطانة لتحديد لاحق للجانب اللحمية. (ج) يتبع الفصل الكامل من القرنية المتبقية (د) أزاله زر القرنية الانقسام الذي تم الحصول عليه من لمبة العين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2. المجهر وفحص البطانة

1. اجراء فحص غير ملون.
   ملاحظه: يمكن اجراء الفحص غير الملون عده مرات (علي سبيل المثال ، في المتابعة الاسبوعيه في اليوم 1 و 8 و 15). ومع ذلك ، فان العد غير الملون يسمح فقط بتقييم كثافة الخلايا البطانية ، وليس المعلمات المورفولوجية.
   1. ملء 3 مل من محلول الملح متوازن الوتر (hBSS ، انظر التكوين في جدول المواد) في كل بئر من 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا. وضع بعناية زر واحد القرنية الانقسام في hBSS للحث علي تورم في الخلايا البطانية القرنية وتحسين الرؤية للخلايا لعد الخلايا.
      ملاحظه: تاكد من ان الجانب البطانية يواجه اتجاه المجهر. إذا تم استخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة ، يجب ان يواجه الجانب البطانية للأسفل. اثناء وجوده ، لا ينبغي نقل لوحه الثقافة لمنع تلف الخلايا البطانية.
   2. السماح للخلايا تنتفخ لمده 1-2 دقيقه قبل التقاط صوره لبطانة مع الكاميرا المرفقة بالمجهر. خذ ما لا يقل عن ثلاث صور لثلاثه مناطق مختلفه علي الأقل من أجل الحصول علي انطباع ممثل عن الحالة الفعلية لبطانة القرنية. أضافه شريط مقياس مع الحقيقي لحجم طول 100 μm للتحليل في وقت لاحق من كثافة الخلايا البطانية القرنية والمعلمات المورفولوجية.
   3. لمنع الضرر الاسموزي ، قم بازاله زر القرنية المنقسم من hBSS بعد حد اقصي 5 دقائق ونقله مره أخرى إلى الوسط الثقافي³.
2. أداء الفحص الملون.
   ملاحظه: تلطيخ ينهي التجارب ، كما المواد تلطيخ المستخدمة هي سامه للخلايا. ولذلك ، يمكن ان يتم تلطيخ فقط في نهاية فتره المراقبة لتقييم المعلمات المورفولوجية (الأرقام التقويم ، وتشكيلات الوردة ، الخلايا الملونة الحمراء الاليزارين).
   1. اعداد 0.25 ٪ التريان الحل الأزرق و 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر S الحل لاجراء تلطيخ.
      1. بالنسبة للحل الأزرق 0.25 ٪ التريان ، تمييع 0.4 ٪ التريان الحل الأزرق مع محلول NaCl 0.9 ٪.
         ملاحظه: علي سبيل المثال ، للحصول علي 20 مل من 0.25 ٪ التريكان الحل الأزرق ، تمييع 12.5 mL من المحلول الأزرق 0.4 ٪ تريبان مع 7.5 mL من الحل 0.9 ٪ NaCl. يمكن تخزين محلول التريكان الأزرق في درجه حرارة الغرفة لعده أسابيع أو أشهر.
      2. للحصول علي 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر s حل تذوب 100 ملغ من مسحوق s الاليزارين الأحمر في 50 mL من محلول كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحت التحريك المستمر والتدفئة إلى 50 درجه مئوية علي مغناطيس تحريك لوحه مع وظيفة التدفئة. لأزاله الرواسب المحتملة ، قم بتصفية الحل الذي تم الحصول عليه. ضبط درجه الحموضة من الحل الأحمر الاليزارين S إلى 4.2 الأس الهيدروجيني عن طريق أضافه هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك وفقا لذلك.
         ملاحظه: قبل كل تطبيق من الحل الأحمر الاليزارين S تاكد من تصحيح الرقم الهيدروجيني إلى 4.2 وانه لا توجد رواسب في الحل. قد يتم تخزين الحل في درجه حرارة الغرفة. لا تخزن المحلول لمده أطول من 4 أسابيع.
   2. وضع أزرار القرنية الانقسام في اطباق بيتري مع الجانب البطانية التي تواجه صعودا من أجل وصمه عار الخلايا البطانية. استخدام ماصه لتنقيط ببطء 0.25 ٪ التريكان الحل الأزرق قطره عن طريق إسقاط علي بطانة القرنية ل 90 s.
      ملاحظه: الأزرق التريان يسمح بتحديد خلايا القرنية التالفة مع غشاء نفاذيه لأنه البقع نوى بهم.
   3. شطف بعناية زر القرنية الانقسام 3x في 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم في كوب زجاجي صغير. مره أخرى ، واستخدام ماصه لتنقيط ببطء 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر S الحل قطره عن طريق إسقاط علي بطانة القرنية ل 90 s.
      ملاحظه: اللون الأحمر Alizarin S البقع غشاء Descemet ، مما يساعد علي تسليط الضوء علي حدود الخلية في الخلايا البطانية القرنية غير التالفة وتسليط الضوء علي الخلايا المدمرة عندما يصبح غشاء Descemet الكامنة مرئية. كما انه يتيح التعرف بسهوله علي المناطق المدمرة الأكبر حجما.
   4. لفحص بطانة القرنية الملطخة اتبع الخطوات الموضحة للعد غير الملون في القسم 2.1.

3. تحليل كثافة الخلايا البطانية القرنية والمعلمات المورفولوجية

1. مشروع عد المربعات علي الصور باستخدام برنامج تحريرالرسومات (جدول المواد).
   1. فتح البرنامج وفتح صوره لبطانة القرنية عن طريق تحديد ملف | الفتح | حدد.
   2. مشروع مربع مع صحيح لقياس طول الجانب من 100 μm علي الصورة.
      ملاحظه: يمكن تجاهل الخطوات التالية من المقطع 3-1-2 إذا كان برنامج العرض يسمح لإسقاط مربعات العد علي الصورة. الطول الجانبي لمربع يعتمد علي دقه الصور الملتقطة بكاميرا المجهر ويمكن حسابه مع شريط المقياس.
      1. اقتصاص شريط المقياس من الصورة الملتقطة بالمجهر: حدد أداه السرادق المستطيلة علي شريط الاداات أو اضغط M، ثم قم بتحديد شريط المقياس ، ثم حدد تحرير | اقتصاص أو اضغط Ctrl + X.
      2. انقر فوق ملف | جديد (أو اضغط Ctrl + N). في الإطار القادم حدد الحافظة في القائمة المنسدلة نوع المستند . عدد البيكسلات المعروضة هو الطول الجانبي لمربع العد. لاحظ بكسل المطابق للصور الأخرى ثم انقر فوق موافق.
      3. حدد ملف | جديد (أو Ctrl + N). ادراج العرض والطول (بالبكسل) من مربع العد في النافذة القادمة وفقا لطول شريط المقياس. حدد لون الخلفية الأبيض، ثم اضغط OK.
      4. انقر علي تحديد | حدد الكل (أو Ctrl + A). حدد تحرير | نسخ (أو Ctrl + C).
      5. حدد صوره بطانة القرنية المفتوحة في الخطوة 3-1-1. حدد تحرير | ألصق (أو Ctrl + V) لادراج المربع علي صوره بطانة القرنية.
      6. حدد طبقه المربع واضبط الشفافية. اختر الطبقة | نمط الطبقة | خيارات المزج | تعيين التعتيم إلى 30 ٪ | حسنا، لا باس
      7. حفظ الصورة مع مربع المتوقعة مع الصحيح لقياس طول الجانب من 100 μm. كرر مع الصور الأخرى اللازمة للتحليل.
2. تقييم كثافة الخلايا البطانية والمعلمات المورفولوجية.
   1. فتح الصور مع الساحات المتوقعة في ImageJ (الإصدار 1.50 i) واستخدام CellCounter المساعد لحساب الخلايا داخل المربع. افتح ImageJ ، حدد ملف | فتح (أو Ctrl + O) | حدد الصورة.
      ملاحظه: ImageJ والمساعد CellCounter هي مجانية متاحه للتحميل علي الإنترنت.
   2. اختر الإضافات | Cell_Counter | عداد الخلية | تهيئه. عد الخلايا البطانية وسجل النتيجة. علي جانبي الساحة ، عد الخلايا التي تقطعها حافه المربع. لا تحسب الخلايا المقطوعة علي الجانبين الآخرين.
   3. تحليل ما لا يقل عن سته مربعات لكل قرنيه من مناطق مختلفه (علي سبيل المثال ، ثلاث صور ، مربعين في الصورة) وتحديد متوسط كثافة الخلايا البطانية القرنية لكل مربع (100 μm²). استقراء كثافة الخلايا البطانية لكل 100 ميكرومتر² إلى 1 مم² بالضرب بواسطة 100.
3. لتقييم التغيرات المورفولوجية ، عد الأرقام التقويم (اجتماع مشترك من ≥ 4 خلايا/حدود الخلية بدلا من ثلاثه) ، وتشكيلات الوردة (المظهر المميز علي شكل الوردة ، خمسه أو أكثر من الخلايا المشعة المحيطة بخليه مدمره ) ، أو المناطق الحمراء الاليزارين (الخلايا المدمرة) في المربعات المتوقعة.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، قد يكون من المفيد استخدام مربعات أكبر (علي سبيل المثال ، 200 x 200 μm²) للتحليل المورفولوجية في عينات محفوظه جيدا للحصول علي نتائج أكثر تمثيلا.

النتائج

تقنيه التشريح المعروضة تعني الازاله الجزئية للانسجه اللحمية ، مما يؤدي إلى ارق عينه القرنية التالي التورم الأقل تضخما (الشكل 1 والشكل 2). اقل تورم الورم يدفع اقل القص وقرصه القوات التي لها تاثير سلبي علي بطانة القرنية ، مما تسبب في انخفاض م?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقه لاعداد الخنازير تقسيم أزرار القرنية ، والذي يمثل موحده ومنخفضه التكلفة السابقين الجسم الغشائي القرنية النموذج ثقافة الجهاز لأغراض البحث⁶. وأظهرت الخنازير انقسام القرنية أزرار انخفاض كثافة الخلايا البطانية مماثله لخسائر الخلايا البطانية التي لوحظ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland