使用分裂的角质按钮的孔膜内皮器官培养模型

摘要

这里提出了猪分裂角膜纽扣的制备和培养的分步方案。由于这种通常培养的器官培养模型显示细胞死亡率在15天内，相当于人类捐赠角膜，它代表了第一个模型，允许长期种植非人类角膜，而不添加有毒的dextran。

摘要

角膜内皮细胞的实验研究与几个困难有关。供体角膜很少，很少可用于实验性调查，因为通常移植需要角膜。内皮细胞培养物往往不能很好地翻译到体内的情况。由于非人类角膜的生物结构特征，栽培过程中的基质肿胀会导致角膜内皮细胞大量流失，长期难以进行栽培。脱毛剂（如 dextran）用于抵消此响应。然而，它们也导致显著的内皮细胞损失。因此，建立了不需要脱肿剂的体外器官培养模型。当地屠宰场的猪眼被用来准备分裂的角膜纽扣。局部角膜发角膜后，角膜的外层（表皮、弓形层、频闪部分）被移除。这大大减少了角膜内皮细胞损失引起的大规模基质肿胀和Descemet膜折叠在较长的培养期，并改善内皮细胞层的一般保存。随后，完全角膜裂解，然后从剩余的眼球和培养中去除分裂的角膜按钮。使用光显微镜在制备后长达15天的随访时间（即第1天、第8天、第15天）评估内皮细胞密度。使用制备技术可以更好地保存内皮细胞层，通过较少的基质组织肿胀实现，从而导致分裂角膜按钮与人类供体角膜相媲美的缓慢和线性下降率。由于这种标准化的有机体典型栽培研究模式首次允许稳定种植至少两周，它是人类供体角膜的宝贵替代品，用于今后研究各种外部因素，对角膜内皮的影响。

引言

角膜移植手术是全世界最常见的移植之^一。由于人类供体角膜严重短缺，人类角膜内皮细胞的实验研究难以^进行。然而，引进灌溉溶液和眼睛内使用的其他物质，眼科粘弹性装置，以及手术器械和技术（例如，乳化仪器和技术，超声波能量）需要临床使用前，对角膜内皮药的影响进行有效和广泛的调查。

除了人类供体角膜之外，几乎没有其他选择可供研究。动物研究模型是非常有价值的，但与此同时，非常耗费资源，并越来越质疑伦理。体外细胞培养的一个主要缺点是它们对人眼的翻译有限。从细胞培养得到的结果可能与体内条件不协调，因为细胞可能经历内皮性等位体过渡（EMT），导致细胞极性丧失和细胞形状和基因变化引起的成纤维细胞样形态表达式².

而以前的前体模型报告培育期只有120小时，一种新的制备技术，以建立猪角膜内皮器官培养模型，通过培育新鲜猪角膜至少15天最近^{推出3 ，4，5，6}.如果在种植前从角膜上皮和频闪部分（总计约300 μm）去除角膜，则角质的肿胀在分裂的角膜按钮中减少，从而减少内皮细胞损失，并维持良好的内皮细胞层后长达15天，而非分裂的角膜按钮显示显着的内皮细胞损失，由于不均匀的基质肿胀和德塞梅特的褶皱的形成。眼库通常使用渗透消肿剂，如dextran，以减少在移植前角膜肿胀。然而，这些制剂被证明诱导增加的内皮细胞损失7，8，9。

本文旨在以详细的分步协议来可视化这种标准化的体外研究模型，以便未来的研究者能够使用分割角膜按钮对角膜内皮进行研究。该模型代表一种简单的方法来测试眼睛中使用的物质和技术，如眼粘弹性装置、灌溉溶液和超声波能量，或角膜内皮感兴趣的其他程序。

研究方案

本协议遵循我们机构的道德准则。根据我们机构道德审查委员会的章程，在实验之前无需获得道德批准，因为所有猪角膜都是从当地屠宰场获得的。

1. 器官文化

1. 准备猪眼。
   1. 从当地的屠宰场，获得猪眼，在验尸后，但在热处理之前被摘除。将眼睛转移到实验室，并在几个小时内处理它们。在运输过程中，在加工前将眼睛保持在室温（约21°C） 下。
   2. 使用眼剪刀和大肠杆菌进行消毒之前，去除所有轨道腺体（眼肌、结膜、脂肪组织）。分离并丢弃所有有明显创伤、外部损伤（如刀切）或可见角膜不整的眼睛。
   3. 在无菌杯中制备 5% 碘-PBS 溶液 （1:20），在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中加入 3 mL 的 7.5% 波维多碘。还准备一个单独的无菌杯，包含60 mL纯PBS。
      注:使用的碘-PBS溶液总量和杯的大小取决于要解剖的角膜数量。五至六只眼睛需要大约 60 mL 的 5%碘-PBS 溶液进行适当消毒。
   4. 将五至六只眼睛放入5%碘-PBS溶液中，共5分钟，对眼睛表面进行适当消毒。小心搅拌每一分钟，以确保眼睛的表面完全浸没，并在碘溶液中完全消毒。
   5. 5分钟后，将消毒的眼睛转移到装满纯PBS的准备好杯子。再次，小心搅拌，以确保碘-PBS溶液从眼睛表面洗去。
      注:在干净的长凳上执行此步骤，以防止消毒的眼睛受到污染。
2. 准备细胞培养板。
   注:在具有恒定层气流的清洁工作台上执行以下步骤。
   1. 解冻2 mL的胎儿小牛血清（FCS）。使用钝管将注射器 （5 mL） 填充 FCS。通过注射器过滤器（0.22 μm）将注射器倒入，以防止FCS可能细菌污染至80 mL的无dextran培养基I（最低必需介质[MEM]，含Earle的盐、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺[200 mM]，五氯二苯甲酸B[250μg/mL]，海带缓冲液[1 M] [50x]，NaHCO₃和蒸馏水。搅拌混合物，确保基板均匀分布。
   2. 用3 mL的基板混合物填充12孔细胞培养板的每个孔。
3. 进行解剖和孵育。
   注:在干净的长凳上执行此步骤。请勿用任何仪器触摸角膜内皮。
   1. 将一个眼球从杯与PBS转移到眼球持有人与角膜朝上，并将其放在眼科手术显微镜下。使用装有 0.9% NaCl 的注射器，在眼球支架上稍微对眼睛施加一些吸力，将眼睛固定到位进行解剖。
   2. 使用含有标准化镶嵌的三角（± 7.5 mm），确保颤音深度不超过300μm，表面切入中央角膜（图1A）。
   3. 使用大肠杆菌钳和一次性手术刀与三角刀片切割和删除部分角膜部分水平通过频闪。丢弃由角膜上皮、弓手层和频闪部分组成的分离角膜部分。
      注:严格保持水平切割方向，以获得剩余频闪的均匀厚度。
   4. 在实验中将10-0缝合（10-0聚酰胺6）放入频闪中，以便能够在实验中区分内皮和基质侧（图1B）。防止角膜内皮的渗透。如果内皮球被穿透，请丢弃眼球。
      注:角膜内皮与缝合针的渗透是可见的，因为前眼室的液体会通过缝合通道泄漏。
   5. 使用没有镶嵌的颤音将颤动切割推进到全深度，直到达到前眼室（图1C）。角膜完全穿透后，可以看到前眼室的抵抗力和液体泄漏的明显下降。
      注:如果裂角膜按钮在裂口后仍固定在分裂的角膜按钮的一侧，请使用曲棍球刀。
   6. 将获得的分割角膜按钮，现在由频闪的一部分（图2），Descemet的膜和角膜内皮，转移到培养基（培养基I +FCS，见第1.2节）到12孔细胞培养板与标记侧朝下，使角膜内皮朝上。
      注:如果内皮侧朝下，内皮可能受损。
   7. 在后续过程中为每个分裂的角膜按钮分配一个单个编号，以便进行识别，并在细胞培养板上相应地标记孔。
   8. 在37°C、5%CO2和95%的相对空气湿度下，在标准条件下在培养箱中孵育填充细胞培养板。如果超过 7 天的潜伏期，则在第 8 天更改培养基（培养基 I + FCS）。
      注:使用分割角膜按钮的孵育程序已验证长达15天。

图1:解剖猪角膜，获得角膜分割按钮。（A） 在角膜的颤变后，使用带镶嵌的颤音切割成300 μm的深度，并去除上皮和基质组织的某些部分，（B）缝合线表面地放入频闪，而不穿透角膜内皮，用于以后鉴定基质侧。（C） 剩余角膜完全裂开后，D） 从眼球上去除获得的裂角膜按钮.请点击此处查看此图的较大版本。

2. 内皮的显微镜和检查

1. 执行无染色检查。
   注:无污点检查可以多次执行（例如，在第 1 天、第 8 天和第 15 天的每周随访中）。然而，未染色计数只允许评估内皮细胞密度，而不是形态参数。
   1. 在12孔细胞培养板的每口井中填充3 mL的亚通平衡盐溶液（hBSS，见材料表中的成分）。小心地在 hBSS 中放置单个分裂的角膜按钮，以诱导角膜内皮细胞肿胀，并提高细胞的可见性，以便进行细胞计数。
      注:确保内皮侧朝向显微镜的方向。如果使用倒置相对比显微镜，内皮侧需要朝下。在就位时，培养板不应移动，以防止内皮细胞损伤。
   2. 让细胞膨胀1-2分钟，然后用相机连接到显微镜拍摄内皮。至少拍摄三张至少三个不同区域的照片，以便对角膜内皮的实际状况有代表性。添加一个比例尺，其真度到刻度长度为100μm，以便以后分析角膜内皮细胞密度和形态参数。
   3. 为了防止渗透损伤，在最多 5 分钟后从 hBSS 上取下分裂的角膜按钮，并将其移回培养基³。
2. 执行染色检查。
   注:染色终止实验，因为所使用的染色物质是细胞毒性的。因此，染色只能在观察期结束时进行，以评估形态参数（改造数字、玫瑰花层、阿里扎林红染色细胞）。
   1. 为染色程序准备 0.25% 试盘蓝色溶液和 0.2% 阿利扎林红色 S 溶液。
      1. 对于 0.25% 锥蓝色溶液，用 0.9% NaCl 溶液稀释 0.4% 的锥型蓝色溶液。
         注:例如，要获得20 mL的0.25%锥蓝色溶液，用0.9%NaCl溶液的7.5 mL稀释0.4%锥蓝色溶液的12.5 mL。试青蓝溶液可在室温下储存数周或数月。
      2. 为了获得0.2%的阿利扎林红S溶液，在具有加热功能的磁体搅拌板上，在具有加热功能的磁搅拌板上，在50mL的0.9%NaCl溶液中溶解100mg的阿利扎林红S粉。要去除可能的沉淀物，请过滤所得溶液。通过相应地添加氢氧化钠或盐酸，将阿利扎林红S溶液的pH量调整至pH 4.2。
         注:在每次应用 alizarin 红色 S 溶液之前，请确保 pH 被校正为 4.2，并且溶液中没有沉淀物。溶液可储存在室温下。请勿将溶液存放超过 4 周。
   2. 将分裂的角膜纽扣放在培养皿中，内皮侧朝上，以染色内皮细胞。使用移液器缓慢地将 0.25% 的锥形蓝色溶液滴入角膜内皮，90s。
      注:Trypan蓝色允许识别受损的角膜细胞与渗透膜，因为它污渍其核。
   3. 小心地在小玻璃杯中冲洗分割角膜纽扣 3x，在 0.9% NaCl 中冲洗。再次，使用移液器缓慢地将0.2%的阿利扎林红S溶液滴入角膜内皮，90s。
      注:Alizarin 红色 S 染色 Descemet 的膜，这有助于突出显示未受损的角膜内皮细胞中的细胞边界，并在底层 Descemet 膜可见时突出显示被破坏的细胞。此外，它可以很容易地识别更大的破坏区域。
   4. 为了检查染色角膜内皮，请按照第2.1节中解释的无染色计数的步骤进行。

3. 角膜内皮细胞密度和形态参数分析

1. 使用图形编辑软件（材料表）对图片进行投影计数。
   1. 通过选择"文件 " 打开软件并打开角膜内皮的图像|打开 |选择。
   2. 在图像上投影一个与比例为 100 μm 的正比例方长度的正方形。
      注:如果查看软件允许在图片上投影计数方块，则可以忽略第 3.1.2 节的以下步骤。正方形的侧面长度取决于使用显微镜相机拍摄的图像的分辨率，并且可以使用比例尺进行计算。
      1. 从显微镜拍摄的照片中裁剪比例尺:选择工具栏上的矩形选取框工具或按M，然后边框比例尺，然后选择"编辑" |裁剪或按Ctrl = X。
      2. 单击文件 |新建（或按Ctrl = N）。在即将发布的窗口中，在"文档类型"下拉列表中选择剪贴板。显示的像素数是计数方块的边长。请注意其他图片的相应像素，然后单击"确定"。
      3. 选择文件 |新建（或Ctrl = N）。根据比例尺的长度，在即将到来的窗口中插入计数正方形的宽度和长度（以像素为单位）。选择背景颜色白色，然后按"确定"。
      4. 单击"选择 " |选择全部（或Ctrl + A）。选择"编辑" |复制（或Ctrl + C）。
      5. 选择步骤 3.1.1 中打开的角膜内皮的图像。选择"编辑" |粘贴（或Ctrl + V） 以在角膜内皮的照片上插入正方形。
      6. 选择正方形的图层并调整透明度。选择图层 |图层样式 |混合选项 |将不集中率设置为 30% |好的。
      7. 将投影的正方形保存为 100 μm 的正比刻度侧长。对分析所需的其他图片重复上述步骤。
2. 评估内皮细胞密度和形态参数。
   1. 打开图像J（版本1.50i）中投影的方块，并使用细胞计数器插件对方块内的单元格进行计数。打开 ImageJ，选择"文件" |打开（ 或Ctrl = O） |选择图像。
      注:ImageJ和CellCounter插件是免费软件，可在线下载。
   2. 选择插件 |单元格_计数器 |细胞计数器 |初始化。计算内皮细胞并记录结果。在正方形的两侧，计算由正方形边缘切割的单元格。不要计算其他两侧的切单元格。
   3. 分析来自不同区域的角膜至少六平方（例如，三张图片，每张图片两个方块），并确定每平方（100 μm²）的平均角膜内皮细胞密度。将内皮细胞密度乘以100，将每100μm2至1 mm²外推。
3. 为了评估形态变化，计算改造数字（由+4细胞/细胞边界而不是3个细胞组成的联席会议）、玫瑰花层形成（特征玫瑰形外观、围绕被破坏细胞的5个或更多径向排列的细胞），或预测方块中的阿里扎林红色区域（破坏的细胞）。
   注:或者，在保存完好的样品中使用较大的方块（例如，200 x 200 μm^2）进行形态分析，以获得更具代表性的结果可能很有用。

结果

提出的解剖技术意味着部分去除基质组织，导致角膜样本更薄，从而减少基质肿胀（图1和图2）。较少基质肿胀诱导较少的剪切和捏力，对角膜内皮有负面影响，从而导致较低的内皮细胞损失^率6。与非分裂的角膜纽扣和整个角膜样本相比，分离角膜按钮在15天的培养后明显具有更好的保存性内皮细胞层，这反?...

讨论

该协议提供了一种制备猪分裂角膜纽扣的方法，它代表了一种标准化和低成本的外体角膜内皮器官培养模型，用于研究^目的6。猪分裂角膜纽扣显示内皮细胞密度下降，与在眼库培养的人类供体角膜中观察到的内皮细胞损失相当，在两周内6，10，11^{， 12}.

优于非分?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland