Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Özet

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Özet

Kornea endotel hücreleri üzerinde deneysel araştırma çeşitli zorluklarla ilişkilidir. İnsan donör kornealar nadirdir ve normalde transplantasyon için gerekli olduğu için deneysel araştırmalar için nadiren kullanılabilir. Endotel hücre kültürleri genellikle in vivo durumlara iyi tercüme etmez. İnsan olmayan korneaların biyoyapısal özellikleri nedeniyle, ekim sırasında stromal şişlik önemli kornea endotel hücre kaybına neden olur, bu da uzun bir süre için ekimi yapmak zor hale getirir. Bu yanıtı etkisiz hale getirmek için dextran gibi şişme ajanları kullanılır. Ancak, onlar da önemli endotel hücre kaybına neden olur. Bu nedenle şişme ajanlar gerektirmeyen bir ex vivo organ kültür modeli oluşturulmuştur. Yerel bir mezbahadan domuz gözleri bölünmüş kornea düğmeleri hazırlamak için kullanılmıştır. Kısmi kornea trehinasyonundan sonra korneanın dış katmanları (epitel, bowman tabakası, stromanın bazı kısımları) çıkarıldı. Bu önemli ölçüde büyük stromal şişme ve Descemet membran uzun ekim dönemleri boyunca katlama tarafından indüklenen kornea endotel hücre kaybını azaltır ve endotel hücre tabakasının genel korunmasını artırır. Sonraki tam kornea trehinasyonu kalan göz soğanı ve ekimi bölünmüş kornea düğmesinin kaldırılması izledi. Endotel hücre yoğunluğu, ışık mikroskobu kullanılarak hazırlıktan 15 gün sonraya kadar (örn. 1, 8, 15 gün) takip sürelerinde değerlendirildi. Kullanılan hazırlama tekniği daha az stromal doku şişmesi ile etkin endotel hücre tabakasının daha iyi korunmasını sağlar, hangi insan donör kornea karşılaştırılabilir bölünmüş kornea düğmelerinde yavaş ve doğrusal düşüş oranları ile sonuçlanır. İlk kez bu standart organo-tipik ekili araştırma modeli en az iki hafta istikrarlı bir ekimi sağlar gibi, onların açısından çeşitli dış faktörlerin gelecekteki araştırmalar için insan donör kornealar için değerli bir alternatiftir kornea endotel üzerindeki etkileri.

Giriş

Kornea transplantasyon işlemleri dünya çapında en sık yapılan transplantasyonlar arasında dır^1. İnsan donör kornea ciddi bir sıkıntısı olduğu gibi, insan kornea kornea kornea endotel hücrelerini ele deneysel araştırma¹gerçekleştirmek zordur. Ancak, göz içinde kullanılan sulama solüsyonları ve diğer maddelerin, oftalmik viskoelastik cihazların yanı sıra cerrahi alet ve tekniklerin (örn. fakoemülsifikasyon aletleri ve teknikleri, ultrason enerjisi) tanıtılması, klinik kullanım dan önce kornea endotel üzerindeki etkileri ile ilgili geçerli ve kapsamlı araştırmalar.

Araştırma için insan donör kornealarına birkaç alternatif vardır. Hayvan araştırma modelleri çok değerli ama aynı zamanda çok kaynak tüketen ve giderek etik sorgulanan. In vitro hücre kültürlerinin önemli bir dezavantajı insan gözüne sınırlı çeviri olduğunu. Hücre kültürlerinden elde edilen sonuçlar in vivo koşullara uyumsuz olabilir, çünkü hücreler endotel mezenkimal geçiş (EMT) geçirebilir, bu da hücre polaritesinin kaybı ve hücre şekli ve gen değişikliklerinden kaynaklanan fibroblast benzeri morfolojiile sonuçlanabilir. ifade².

Önceki ex vivo modelleri sadece 120 saate kadar ekim süreleri rapor ederken, en az 15 gün taze domuz korneaları kültüre getirerek bir domuz kornea endotel organ kültür modeli oluşturmak için yeni bir hazırlık tekniği son zamanlarda^{tanıtıldı 3 3 ,4,5,6}. Kornea epiteli ve stromanın parçaları ekimden önce korneadan çıkarılırsa (toplam 300 m) stromanın şişmesi bölünmüş kornea düğmelerinde azalır ve bu da daha az endotel hücre kaybına ve bakımlı endotel kaybına neden olur. hücre tabakası 15 güne kadar, bölünmemiş kornea düğmeleri ise düzensiz stromal şişlik ve Descemet kıvrımlarının oluşumuna bağlı olarak önemli endotel hücre kaybı gösterir. Göz bankaları genellikle transplantasyon öncesi kornea ların şişmesini azaltmak için dekstran gibi ozmotik deswelling ajanları kullanır. Ancak, bu ajanlar artmış endotel hücre kaybı^nedengösterilmiştir 7^,8,9.

Bu makalede, gelecekteki araştırmacıların bölünmüş kornea düğmeleri kullanarak kornea endotel üzerinde araştırma yapmalarını sağlamak amacıyla bu standartlaştırılmış ex vivo araştırma modelini ayrıntılı bir adım adım protokolde görselleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu model, göz içi viskoelastik cihazlar, sulama solüsyonları ve ultrason enerjisi veya kornea endotellerinin ilgi çekici olduğu diğer işlemler gibi göz içinde kullanılan maddeleri ve teknikleri test etmek için basit bir yöntemi temsil eder.

Protokol

Bu protokol kurumumuzun etik kurallarına uygundur. Kurumumuzun etik inceleme komitesi tüzüğüne uygun olarak, tüm domuz korneaları yerel mezbahadan alındığı için deneylerden önce etik onay alınmak zorunda değildir.

1. Organ kültürü

1. Domuz gözlerini hazırlayın.
   1. Yerel mezbahadan, kısa bir süre sonra ölümden sonra kaldırıldı domuz gözleri elde ama termal tedavi den önce. Gözleri laboratuara götürün ve birkaç saat içinde işleyin. Taşıma sırasında, işlemeden önce gözleri oda sıcaklığında (yaklaşık 21 °C) tutun.
   2. Göz makasve kolibri forseps kullanarak dezenfeksiyon öncesinde tüm orbital adnexes (göz kasları, konjonktiva, yağ dokusu) kaldırın. Belirgin travma, dış hasar (örn. bıçak kesme) veya görünür kornea oparesi ile tüm gözleri ayırın ve atın.
   3. Steril bir kapta %5 iyot-PBS çözeltisi (1:20) bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 57 mL'lik povison iyot %7,5 povison iyot ekleyerek hazırlayın. Ayrıca 60 mL saf PBS içeren ayrı bir steril bardak hazırlayın.
      NOT: Kullanılan iyot-PBS çözeltisinin toplam miktarı ve kabın büyüklüğü kesilecek kornea sayısına bağlıdır. Beş ila altı göz, düzgün dezenfekte edilmesi için %5-iyot-PBS çözeltisinin yaklaşık 60 mL'sini gerektirir.
   4. 5-iyot-PBS çözeltisi içine 5-altı göz koyun toplam 5 dakika düzgün göz yüzeyini dezenfekte etmek için. Göz yüzeyinin tamamen batmış ve iyot çözeltisinde tamamen dezenfekte edildiğinden emin olmak için her dakikayı dikkatlice karıştırın.
   5. 5 dakika sonra dezenfekte edilmiş gözleri saf PBS ile dolu hazır bardağa aktarın. Yine, iyot-PBS çözeltisinin göz yüzeyinden yıkandığından emin olmak için dikkatlice karıştırın.
      NOT: Dezenfekte edilmiş gözlerin kirlenmesini önlemek için bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin.
2. Hücre kültür plakaları hazırlayın.
   NOT: Sabit laminar hava akışı ile temiz bir bankta aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Fetal baldır serumunun 2 mL'si (FCS) çözülür. Bir şırınga (5 mL) fcs ile künt bir kanül kullanarak doldurun. Şırıngayı, FCS'nin 80 mL dekstran içermeyen kültür ortamı I'e (earle tuzları, penisilin/streptomisin, L-glutamin [200 mM] ile olası bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için şırınga filtresinden (0,22 μm) boşaltın, amphotericin B [250 μg/mL], Hepes tampon [1 M] [50x], NaHCO₃, ve distile su). Hatta substrat dağılımını sağlamak için karışımı çalkalayın.
   2. 12 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuyu 3 mL substrat karışımı ile doldurun.
3. Diseksiyon ve kuluçka yapın.
   NOT: Bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin. Kornea endoteline herhangi bir aletle dokunmayın.
   1. PBS ile bardaktan kornea yukarı bakan göz ampulü tutucu içine bir göz ampulü aktarın ve bir oftalmik cerrahi mikroskop altına yerleştirin. Biraz diseksiyon için pozisyonda göz sabitleme göz ampul tutucu üzerinde göze bazı emme uygulamak için% 0.9 NaCl ile dolu bir şırınga kullanın.
   2. Merkezi korneanın yüzeysel olarak kesilmesi için, trephined derinliğinin 300 μm'yi geçmemesini sağlayan standart bir kayı içeren bir trephin (ø 7,5 mm) kullanın (Şekil 1A).
   3. Kolibri forceps ve üçgen bıçak ile tek kullanımlık neşter kullanın kesmek ve stroma ile yatay korneakısmen trephined kısmını kaldırmak için. Kornea epiteloluşan ayrılmış kornea parçası atın, bowman tabakası, ve stroma bir parçası.
      NOT: Kalan stromanın eşit kalınlığını elde etmek için yatay kesme yönünü sıkı bir şekilde koruyun.
   4. Deneyler sırasında endotel'i stromal taraftan ayırt edebilmek için 10-0 sütür (10-0 poliamid 6) stromaya yüzeysel olarak yerleştirin(Şekil 1B). Kornea endotel penetrasyonunu önleyin. Endotel nüfuz edilirse göz ampulü atın.
      NOT: Ön göz odasından gelen sıvı dikiş kanalından sızacağı için kornea endotellerinin dikiş iğnesi ile penetrasyonu görülebilir.
   5. Ön göz odasına ulaşılına kadar trephined kesim tam derinliğe ilerlemek için kayı olmadan trephine kullanın (Şekil 1C). Anterior göz odasından sızan direnç ve sıvıda belirgin bir düşüş korneanın tam penetrasyonundan sonra algılanabilir.
      NOT: Bölünmüş kornea düğmesi trephination sonra bölünmüş kornea düğmesinin bir tarafında bağlı kalırsa bir hokey bıçağı kullanın.
   6. Elde edilen bölünmüş kornea düğmesini, şimdi stroma bir parçası oluşan(Şekil 2),Descemet membran ve kornea endotel, kültür ortamı (kültür orta I + FCS, bölüm 1.2 bakınız) içine 12 kuyu hücre kültür plakası içine aşağı bakan etiketli tarafı, böylece kornea endotel yukarı bakıyor.
      NOT: Endotel tarafı aşağı bakacaksa, endotel zarar görebilir.
   7. Takipler sırasında kimlik tespiti için her bölünmüş kornea düğmesine ayrı bir numara atayın ve hücre kültür plakasındaki kuyuları buna göre etiketleyin.
   8. Dolu hücre kültür plakalarını standart koşullar altında 37 °C, %5 CO₂ ve bağıl hava nemi %95 sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. 7 günlük kuluçka süresi aşılırsa, 8.
      NOT: Bölünmüş kornea düğmeleri kullanılarak kuluçka işlemi 15 güne kadar doğrulanmıştır.

Şekil 1: Bölünmüş kornea düğmeleri elde etmek için domuz korneasının diseksiyonu. (A) Korneanın trefinin 300 μm derinliğe kesilmesi ve epitelin ve stromal doku parçalarının çıkarılması için bir kalıtım ile trefilasyondan sonra, (B) korneanın penetrasyonu olmadan stromaya yüzeysel olarak bir dikiş konur. stromal tarafın daha sonra tanımlanması için endotel. (C) Kalan korneanın tam trehinasyonu takip edilir (D) göz ampulünden elde edilen bölünmüş kornea düğmesinin çıkarılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Endoskopi ve endotel muayenesi

1. Lekesiz muayene yapın.
   NOT: Lekesiz muayene birden çok kez yapılabilir (örn. 1, 8 ve 15. gün haftalık takiplerde). Ancak, lekesiz sayma sadece endotel hücre yoğunluğunun değerlendirilmesine izin verir, morfolojik parametreleri değil.
   1. 12 kuyuluk hücre kültür plakasının her kuyuda 3 mL hipotonik dengeli tuz çözeltisi doldurun (hBSS, Malzeme Tablosu'ndakikompozisyona bakın). Kornea endotel hücrelerinin şişmesine neden olmak ve hücre sayımı için hücrelerin görünürlüğünü artırmak için hBSS'ye tek bir bölünmüş kornea düğmesini dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Endotel tarafının mikroskop yönünde olduğundan emin olun. Ters faz kontrastmikroskopu kullanılırsa, endotel tarafının aşağıya dönük olması gerekir. Yerinde iken, kültür plakası endotel hücre hasarı önlemek için hareket ettirilmemelidir.
   2. Mikroskoba bağlı kamera ile endotel bir resim çekmeden önce hücreleri 1-2 dakika şiştirin. Kornea endotel gerçek durumu temsili bir izlenim elde etmek için en az üç farklı alanlarda en az üç fotoğraf çekin. Kornea endotel hücre yoğunluğu ve morfolojik parametrelerin daha sonra analizi için 100 μm doğru ölçekli uzunluğu ile bir ölçek çubuğu ekleyin.
   3. Ozmotik hasarı önlemek için, hBSS'den bölünmüş kornea düğmesini en fazla 5 dk sonra çıkarın ve kültür^ortamınageri aktarın 3 .
2. Lekeli muayene yapın.
   NOT: Kullanılan boyama maddeleri sitotoksik olduğundan, boyama deneyleri sonlandırır. Bu nedenle, morfolojik parametrelerin (reformasyon figürleri, rozet oluşumları, alizarin kırmızı lekeli hücreler) değerlendirilmesi için sadece gözlem döneminin sonunda boyama yapılabilir.
   1. Boyama işlemi için %0,25 trypan mavi solüsyonu ve %0,2 alizarin kırmızı S çözeltisi hazırlayın.
      1. %0,25 trypan mavi çözeltisi için %0,4 trypan mavi çözeltisini %0,9 NaCl çözeltisi ile seyreltin.
         NOT: Örneğin, %0,25'lik trypan mavi çözeltisinin 20 mL'sini elde etmek için % 0,4 trippan mavi çözeltisinin 12,5 mL'sini seyreltin ve %0,9 NaCl çözeltisinin 7,5 mL'sini elde edin. Trypan mavi çözeltisi birkaç hafta veya ay oda sıcaklığında saklanabilir.
      2. %0.2 alizarin kırmızı S çözeltisi elde etmek için 100 mg alizarin kırmızı S tozunu 50 mL'lik bir NaCl çözeltisinin %0,9 NaCl çözeltisi altında sürekli karıştırma ve ısıtma 50 °C'ye Kadar ısıtma işlevi ile bir mıknatıs karıştırma plakası üzerinde çözünür. Olası çökeltileri gidermek için elde edilen çözeltiyi filtreleyin. Buna göre sodyum hidroksit veya hidroklorik asit ekleyerek alizarin kırmızı S çözeltisinin pH'ını pH 4.2'ye ayarlayın.
         NOT: Alizarin red S çözeltisinin her uygulamasından önce pH'ın 4.2'ye kadar düzeltildiklerinden ve çözeltide çökelti olmadığından emin olun. Çözelti oda sıcaklığında saklanabilir. Çözümü 4 haftadan uzun süre saklamayın.
   2. Endotel hücrelerini boyamak için endotel tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kaplarında bölünmüş kornea düğmelerini yerleştirin. 90 s için kornea endotel üzerine damla% 0.25 trypan mavi çözelti damla yavaş yavaş damla için bir pipet kullanın.
      NOT: Trypan mavisi, çekirdeklerini lekelediği için hasarlı kornea hücrelerinin geçirilebilir bir zarla tanımlanmasını sağlar.
   3. Küçük bir cam kabın içinde %0,9 NaCl'de bölünmüş kornea düğmesini 3x dikkatlice durulayın. Yine, yavaş yavaş 90 s için kornea endotel üzerine damla% 0.2 alizarin kırmızı S çözeltisi damla damla için bir pipet kullanın.
      NOT: Alizarin kırmızı S descemet membran lekeleri, hasarsız kornea endotel hücrelerinde hücre sınırlarını vurgulamak ve altta yatan Descemet membran görünür hale geldiğinde yok hücreleri vurgulamak için yardımcı olur. Ayrıca, daha büyük tahrip alanların kolayca tanımlanmasını sağlar.
   4. Lekeli kornea endotel incelemesi için bölüm 2.1 lekesiz sayma için açıklanan adımları izleyin.

3. Kornea endotel hücre yoğunluğu ve morfolojik parametrelerin analizi

1. Grafik düzenleme yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak resimlere kare sayma projesi .
   1. Dosya yı seçerek yazılımı açın ve kornea endotel görüntüsünü açın | Aç | Seçin.
   2. Görüntüüzerinde 100 μm'lik gerçek bir ölçek kenarı uzunluğuna sahip bir kare yansıtın.
      NOT: Görüntüleme yazılımı resim üzerine sayma kareleri yansıtılmasına izin veriyorsa, bölüm 3.1.2'nin aşağıdaki adımları yoksayılabilir. Karenin yan uzunluğu mikroskop kamerası ile çekilen görüntülerin çözünürlüğüne bağlıdır ve ölçek çubuğu ile hesaplanabilir.
      1. Mikroskopla çekilen fotoğraftan ölçek çubuğunu kırpma: Araç çubuğundaki Dikdörtgen Çerçeve Aracı'nı seçin veya Mtuşuna basın, ardından ölçek çubuğunu sınırlayın, sonra Düzenleme'yi seçin | Kırpma veya Ctrl + Xtuşuna basın.
      2. Dosyayı Tıklatın | Yeni (veya Ctrl + Ntuşuna basın). Gelecek pencerede Belge Türü açılır listesinde Pano'yu seçin. Gösterilen piksel sayısı, sayım karesinin yan uzunluğudur. Diğer resimler için karşılık gelen pikselleri not edin ve Tamam'ıtıklatın.
      3. Dosya Yı Seçin | Yeni (veya Ctrl + N). Ölçek çubuğunun uzunluğuna göre, gelecek penceredeki sayma karesinin genişliğini ve uzunluğunu (piksel olarak) ekleyin. Arka plan rengi Beyaz'ıseçin, ardından Tamam tuşunabasın.
      4. Seç'e tıklayın | Tümünü seçin (veya Ctrl + A). Seç Edit | Kopyala (veya Ctrl + C).
      5. Adım 3.1.1'de açılan kornea endotel görüntüsünü seçin. Seç Edit | Kornea endotel fotoğrafına kare eklemek için yapıştırın (veya Ctrl + V).
      6. Kare katmanını seçin ve saydamlığı ayarlayın. Katman Seçin | Katman Stili | Harmanlama Seçenekleri | Opaklığı %30'a ayarlayın | Tamam.
      7. Görüntüyü, doğru ve ölçeklenmiş yan uzunluğu 100 μm olan yansıtılan kareyle kaydedin.
2. Endotel hücre yoğunluğunu ve morfolojik parametreleri değerlendirin.
   1. Görüntüleri ImageJ'de (Sürüm 1.50i) yansıtılan karelerle açın ve kare içindeki hücreleri saymak için CellCounter PlugIn'i kullanın. ImageJ'i aç, Dosya'yı seç | Aç (veya Ctrl + O) | Resim'i seçin.
      NOT: ImageJ ve CellCounter PlugIn online indirmek için ücretsiz.
   2. Eklentileri Seçin | Cell_Counter | Hücre Sayacı | Initialize . Endotel hücrelerini sayın ve sonucu kaydedin. Karenin iki tarafında, kare kenarı tarafından kesilen hücreleri sayın. Diğer iki tarafta kesilmiş hücreleri saymayın.
   3. Farklı alanlardan kornea başına en az altı kareyi analiz edin (örn. üç resim, resim başına iki kare) ve kare başına ortalama kornea endotel hücre yoğunluğunu belirleyin (100 μm^2). 100 μm^{2 ila} 1 mm² başına endotel hücre yoğunluğunu 100 ile çarparak tahmin edin.
3. Morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için, sayım reformasyon rakamları (üç yerine ≥4 hücre/hücre sınırlarının ortak buluşması), rozet oluşumları (karakteristik rozet şeklinde görünüm, yok edilmiş bir hücreyi çevreleyen beş veya daha fazla radyal olarak düzenlenmiş hücre ), veya yansıtılan karelerde alizarin kırmızı alanları (yok edilen hücreler).
   NOT: Alternatif olarak, daha fazla temsili sonuç elde etmek için iyi korunmuş numunelerde morfolojik analiz için daha büyük kareler (örneğin, 200 x 200 μm²⁾kullanmak yararlı olabilir.

Sonuçlar

Sunulan diseksiyon tekniği stromal dokunun kısmi olarak çıkarılması, daha ince kornea örneği ve dolayısıyla daha az stromal şişlik ile sonuçlanan anlamına gelir(Şekil 1 ve Şekil 2). Daha az stromal şişlik kornea endotel üzerinde olumsuz bir etkiye sahip daha az makas ve çimdik kuvvetleri neden olur, böylece daha düşük endotel hücre kaybı oranları neden⁶. Bölünmüş kornea düğ...

Tartışmalar

Bu protokol araştırma amaçlı standart ve düşük maliyetli ex vivo kornea endotel organ kültür modeli temsil domuz bölünmüş kornea düğmeleri, hazırlanması için bir yöntem sağlar⁶. Domuz bölünmüş kornea düğmeleri iki haftalık bir süre içinde göz bankalarında ekili insan donör korneagöz görülen endotel hücre kayıpları ile karşılaştırılabilir endotel hücre yoğunluğunda bir azalma gösterdi^6,10,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland