JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية ، ونحن الإبلاغ عن طريقه جديده خاليه من العلامات الحيوية من توصيف وظيفية للخلايا مثل الجذعية بواسطة كروي القائم علي التسمية الاحتفاظ الفحص. يتم وصف بروتوكول خطوه بخطوه ل BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد وضع العلامات خليه 2D ؛ تشكيل كروي ثلاثي الابعاد ؛ التسمية الاحتفاظ الجذعية مثل الخلية تحديد من قبل الكيمياء المناعية; والعزلة من قبل FACS.

Abstract

وعلي الرغم من التقدم المحرز في بحوث الخلايا الجذعية البالغة ، لا يزال تحديد وعزل الخلايا الجذعية من عينات الانسجه يشكل تحديا كبيرا. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا مع القيود المتخصصة في انسجه الكبار ، فانها تدخل دوره الخلية في الثقافة الثلاثية الابعاد (3D) خاليه من المرساة والخضوع لانقسام الخلايا المتناظرة وغير المتناظرة ، مما يؤدي إلى كل من الجذعية والسلف الخلايا. وتتكاثر هذه الاخيره بسرعة وتشكل الخلية الرئيسية في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، وتشكل خزان غير متجانسة. باستخدام الخلايا الظهاريه البشرية العادية الاساسيه البروستاتا (هبريك) ، تم تطوير الفحص القائم علي الكروي ، والاحتفاظ بالعلامات التي تسمح بتحديد وعزل وظيفي للخلايا الجذعية كروي البدء في قرار خليه واحده.

هبريك أو خطوط الخلايا هي ثنائيه الابعاد (2D) مثقف مع BrdU لمده 10 أيام للسماح بدمجها في الحمض النووي لجميع الخلايا الفاصلة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية تجديد الذاتي. تبدا الغسيل عند الانتقال إلى الثقافة ثلاثية الابعاد لمده 5 أيام ، وخلالها تجدد الخلايا الجذعية ذاتيا من خلال التقسيم غير المتناظر والبدء في تكوين كروي. بينما الخلايا الجذعية ابنه هادئه نسبيا الاحتفاظ بالحمض النووي الأبوي المسمي BrdU ، والأسلاف ابنه تتكاثر بسرعة ، وفقدان التسمية BrdU. ويمكن استبدال BrdU مع CFSE أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ ، والتي تسمح الحية عزل الخلايا الجذعية من قبل FACS. وأكدت خصائص الخلايا الجذعية من قبل في تشكيل كروي المختبر, في اختبارات تجديد الانسجه الجسم الحيوي, وعن طريق توثيق الانقسامات المتماثلة/غير متناظرة الخلايا. يمكن استجواب الخلايا الجذعية المعزولة التي تحتفظ بالملصقات بدقه من خلال الدراسات الجزيئية والبيولوجية المصب ، بما في ذلك الحمض الريبي المتسلسل ، ورقاقه-seq ، والتقاط الخلايا المفردة ، والنشاط الأيضي ، وتنميط البروتين ، والمناعة المناعية ، وتشكيل الانسجه والاهم من ذلك ، فان نهج عزل الخلايا الجذعية الوظيفية الخالي من العلامات يحدد الخلايا الجذعية من عينات السرطان الطازجة وخطوط الخلايا السرطانية من أجهزه متعددة ، مما يوحي بامكانيه تطبيقها علي نطاق واسع. ويمكن استخدامه لتحديد سرطان الخلايا الحيوية مثل الجذع الجذعية ، والادويه الشاشة التي تستهدف الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، واكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة في السرطان.

Introduction

غده البروستاتا البشرية تحتوي علي ظهاره التلالؤ مع وظيفة سيكريتوري والخلايا القاعدية الكامنة وراء ذلك مع مكون خليه الغدد الصماء العصبية غير عادية. الخلايا الظهاريه ، في هذه الحالة ، يتم إنشاؤها من السكان نادره من الخلايا الجذعية البروستاتا التي هي هادئه نسبيا في الجسم الحي وتعمل كنظام إصلاح للحفاظ علي التوازن الغديه في جميع انحاء الحياة1. وعلي الرغم من العديد من التطورات ، لا يزال تحديد الخلايا الجذعية لبروستاتا وعزلها وظيفيا يشكل تحديا كبيرا في الميدان. ويشيع استخدام الخلايا الجذعية الحيوية ، بما في ذلك المنهجيات القائمة علي علامات سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي لأبحاث الخلايا الجذعية2،3،4. ومع ذلك ، فان النتائج المتعلقة بالإثراء والعزلة تتفاوت علي نطاق واسع باعتبارها داله لمجموعات العلامات وخصوصية الأجسام المضادة5،6، مما يثير تساؤلات حول هويه الخلايا المعزولة. نهج آخر يستخدم علي نطاق واسع لتخصيب الخلايا الجذعية مثل ثلاثي الابعاد (3d) كروي الثقافة2,3,4. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا في فيفو مع القيود المتخصصة ، فانها تخضع لانقسام الخلايا في الثقافة مصفوفة 3d (متماثلة وغير متناظرة) ، وتوليد كل من الجذعية وخلايا سلف التي تتكاثر بسرعة نحو النسب التزام7،8. وتشكل الخزان المشكلة خليطا غير متجانس يحتوي علي كل من الخلايا الجذعية وخلايا السلف في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، بما في ذلك الخلايا المبكرة والمتاخره لمرحله السلف. التالي ، فان المقايسات باستخدام الخزان بأكملها ليست الخلية الجذعية الحصرية ، مما يجعل تحديد خصائص الخلايا الجذعية الفريدة غير حاسمه. ولذلك ، فمن المهم لخلق المقايسات لتحديد وفصل الخلايا الجذعية البروستاتا من الأسلاف ابنتهم. وتحقيقا لهذه الغاية ، فان الهدف من البروتوكول الحالي هو إنشاء نظام فحص يسمح بالتحديد والعزل الفعالين للخلايا الجذعية من انسجه البروستاتا البشرية يعقبه تحليل قوي لمجري الهواء لوظائفها البيولوجية.

علي المدى الطويل 5-برومو-2 '-ديوكسيريدين (brdu) التسمية-الاحتفاظ يستخدم علي نطاق واسع لفي الجسم المجري والمختبر تتبع سلاله من الخلايا الجذعية علي أساس وقت المضاعفة لفترات طويلة9,10. ويستند النهج الحالي لتحديد الخلايا الجذعية البروستاتا والعزلة الموصوفة هنا علي خصائصها النسبية هادئه وخاصيه الاحتفاظ بالتسمية داخل السكان الظهاريه مختلطة. وعلاوة علي ذلك ، استنادا إلى فرضيه الحمض النووي الخالدة حبلا ، يمكن فقط الخلايا الجذعية الخضوع لانقسام الخلايا غير المتناظرة. الخلية الجذعية تمثل خليه ابنه التي تحتوي علي الحمض النووي الابويه القديمة في حين ان خليه السلف ، وهي خليه ابنه الملتزمة ، يتلقى الحمض النووي توليفها حديثا. يتم استغلال خاصيه الخلايا الجذعية الفريدة الموصوفة أعلاه لتنفيذ وسم BrdU في الخلايا الجذعية الابويه في الثقافات الاوليه ومن ثم تتبع علامتها بعد الانتقال إلى الثقافة الكروية الخالية من المرساة. في حين ان معظم الخلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه تحتفظ القاعدية والعابرة تضخيم النمط الظاهري في الثقافة 2d, وهناك أيضا عدد نادر من الخلايا الجذعية متعددة القوية تجديد والحفاظ علي التوازن الظهاريه كما يتضح من تشكيل خزان أو العضوية المتمايزة تماما مع وسائل الاعلام ثقافة المقابلة عند نقل إلى 3d أنظمه3,12 في البروتوكول الحالي لدينا ، باستخدام هبريك خزان البروستاتا أو بروستاسفيري القائم علي BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد اختبارات الاستبقاء تليها الفرز الخلية المنشطة فلوري (FACS) ، ونحن تحديد الخلايا الجذعية الاحتفاظ بالتسمية في خزان علي مستوي خليه واحده13.

والاهم من ذلك ، أكدنا كذلك خصائص الخلايا الجذعية للخلايا المحتفظة بالملصقات في المرحلة المبكرة من الخزان بالمقارنة مع خلايا السلف التي لديها التزام بالنسب. وتشمل هذه الانقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة, في المختبر القدرة علي تكوين كروي وفي الجسم الحيوي تجديد القدرات, النشاط الغيار التلقائية مرتفعه, التكوين الإحيائي المعزز وانخفاض النشاط الأيضي. وفي وقت لاحق ، اجري تحليل RNAseq. ولوحظت الجينات بشكل مختلف في الخلايا الكروية الاحتفاظ التسمية التي قد تكون بمثابه العلامات الحيوية الجديدة للخلايا الجذعية البروستاتا البشرية. وهذا النهج القائم علي التسمية القائمة علي الكروي يمكن ان ينطبق علي عينات السرطان لتحديد عدد صغير من الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، التالي توفير فرص انتقاليه لأداره السكان مقاومه العلاجية13. ويرد أدناه اختبار الاحتفاظ بالتسمية القائم علي بروستاسفيري باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية (هبريك) كمثال.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وينبغي ان يتم كل مناوله الخلايا والاستعدادات وسائل الاعلام مع تقنيه العقيم في الدرجة الثانية مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC).

1. ثقافة وصيانة خلايا هبريك في 2D

  1. معطف 100 مم الاطباق الثقافية مع 2 مل من 2.5 ميكروغرام/سم2 الفيبرونكتين جنيني الحل بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة (RT). يستنشق الحل والسماح للاطباق الثقافة الهواء الجاف في BSC ل 45 دقيقه. يمكن تخزين الاطباق الثقافة المغلفة Fibronectin 2-4 أسابيع في 4 ° c.
  2. أضافه 9 مل من البروستاتا النمو خليه الظهاريه المتوسطة (علي سبيل المثال ، PrEGM) إلى صحن الثقافة المغلفة fibronectin 100 mm والحفاظ علي الطبق الدافئ في الحاضنة2 CO في 37 درجه مئوية.
  3. ذوبان قارورة واحده من الخلايا هبريك المجمدة (2 × 105/مل) في 37 درجه مئوية حمام المياه وأعاده تعليق الخلايا في 10 مل من المتوسطة الدافئة.
  4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق والتخلص من supernatant.
  5. أعاده تعليق الخلايا بدقه في 1 مل من وسط الثقافة الدافئة. خلايا البذور عن طريق الأنابيب 1 مل من تعليق الخلية مباشره إلى المغلفة fibronectin 100 ملم ثقافة الطبق الذي يحتوي علي 9 مل من المتوسطة مسبقا (الحجم الإجمالي لمتوسط والخلايا هو 10 مل). مكان الاطباق الثقافية مره أخرى إلى CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية.
  6. تجديد المتوسطة كل يومين. للقيام بذلك ، يستنشق بعناية جميع وسائل الاعلام وأضافه 10 مل من المتوسطة الدافئة الطازجة.
  7. في حوالي 5 أيام ، والتاكد من ان الثقافات هي ~ 70-80 ٪ متموج. أداء الهضم الانزيميه من خلال احتضان الخلايا مع 3 مل من 0.05 ٪ التريبسين/أدتا في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  8. وقف الهضم عن طريق أضافه 3 مل من تلفزيوني الدافئة التي تحتوي علي 10 ٪.
  9. جمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 50 mL والطرد المركزي في 500 x ز لمده 5 دقائق في RT. الشفط والتخلص من supernatant.
  10. أعاده تعليق بيليه الخلية في 30 مل من المتوسطة الدافئة والاستغناء عنها علي قدم المساواة في ثلاثه جديده fibronectin المغلفة 100 مم الاطباق الثقافية للمرور المقبل.
    ملاحظه: يمكن ان تكون الخلايا هبريك الاساسيه العبور ~ 3 – 5x دون تغيير خصائص الخلايا الظهاريه القاعدية. يتم اختبار النمط الظاهري الظهاريه من قبل التعبير عن علامات الخلايا الظهاريه القاعدية سيتوكيراتين 5 و p63 مع المناعية/المناعية (ICC/IF) اختبارات.

2. وضع العلامات هبريك مع BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ

ملاحظه: الخلايا يمكن المتابعة اما إلى الخطوة 2.1 أو الخطوة 2.2 متبوعا النقل إلى الثقافة بروستاسفيري ثلاثي الابعاد كما هو موضح في الخطوة 3.1.

  1. وسم واحد من الخلايا مع BrdU
    1. الثقافة 2 × 105 هبريك الخلايا في الاطباق المغلفة فيبرونكتين 100 mm الثقافة مع 10 مل من المتوسطة الدافئة التي تحتوي علي 1 ΜM من brdu. ثقافة الخلايا لمده 10 أيام (علي اثنين من الممرات) لضمان وضع العلامات علي جميع الخلايا بما في ذلك الجذعية البروستاتا والخلايا سلف.
    2. بعد 10 أيام ، يستنشق بعناية المتوسطة PrEGM التي تحتوي علي BrdU وغسل الخلايا مع 5 مل من تلفزيوني الدافئة. كرر 1x.
    3. اجراء الهضم الانزيمي باستخدام 0.05 ٪ التريبسين/أدتا كما هو موضح في الخطوات 1.7-1.8. الطرد المركزي الخلايا في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق وتجاهل supernatant.
    4. أعاده تعليق الخلايا المغلفة BrdU المسمي (5 × 104) في 500 μl من الجليد الباردة (1:1) مصفوفة غشاء الطابق السفلي/المتوسطة ونقل إلى ثقافة بروستاسفيري 3d (الموصوفة في الخطوة 3.1) لمده 5 أيام للسماح brdu تبييض خلال تشكيل كروي (~ 6 دورات الخلية).
  2. وضع العلامات المزدوجة للخلايا مع BrdU و CFSE أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ
    1. إذا كان المطلوب المشاركة في وضع العلامات للخلايا الحية ، واتخاذ ما قبل المسمي الخلايا حضن مع BrdU لمده 10 أيام من الخطوة 2.1 والتسمية المشتركة مع CFSE 5 μM أو الأحمر البعيد خليه الفلورسنت الموالية للاصباغ لمده 30 دقيقه. أداء المشاركة في وضع العلامات في اليوم 10.
    2. يستنشق بعناية المتوسطة التي تحتوي علي BrdU و CFSE أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ. غسل الخلايا مع 5 مل من تلفزيوني الدافئة. كرر الغسيل 1x.
    3. اجراء الهضم الانزيمي باستخدام 0.05 ٪ التريبسين/أدتا كما هو موضح في الخطوات 1.7-1.8. الطرد المركزي الخلايا في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. أزاله وتجاهل supernatant.
    4. أعاده تعليق الخلايا المسمية المشتركة (5 × 104) في 500 μl من الجليد الباردة (1:1) مصفوفة غشاء الطابق السفلي/المتوسطة ونقل إلى ثقافة بروستاسفيري 3d (الموصوفة في القسم 3.1) لمده 5 أيام للسماح BRDU و cfse أو الأحمر البعيد اثناء تشكيل كروي (~ 6 دورات الخلية).
  3. قم بالكشف عن الخلايا المحتفظة بالتسمية في المجالات (اليوم 5 بروستاسفيريس) كما هو موضح في الخطوات 4.1 ، 4.2 ، 4.3 ، أو 5.
    ملاحظه: كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) والأحمر البعيد هي طويلة الأمد الفلورسنت الموالية للاصباغ ويتم الاحتفاظ بشكل جيد داخل الخلايا المسمية. استريز داخل الخلايا الحية يلتصق المجموعات خلات التي تنشط جزيئات الفلورسنت الخضراء أو الحمراء التي هي الآن غشاء المهددة بالخطر.

3. تشكيل بروستاسفيري في القبو 3D نظام ثقافة الغشاء

  1. بروستاسفيري الثقافة في نظام مصفوفة غشاء الطابق السفلي 3D
    1. ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها والحفاظ علي الجليد قبل الاستخدام.
    2. أضف برفق 1 مل من مصفوفة غشاء القبو الجليدي البارد إلى حجم متساو من الوسط الثقافي البارد والجليدي. خلط ببطء عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا ، وتجنب فقاعات.
      ملاحظه: قبل معطف الجزء السفلي من 12 بئر الآبار لوحه الثقافة مع 100 μL من هذا الحل. وهذا سوف يقلل من عدد الخلايا التي تقع من خلال المصفوفة وتنمو باعتبارها أحاديه الطبقة.
    3. أعاده التعليق 5 × 104 خلايا هبريك في الجليد الباردة (1:1) مصفوفة غشاء الطابق السفلي/ثقافة مزيج متوسط في حجم إجمالي من 500 μl.
    4. ماصه 500 μL من هذا الحل الخلية حول الحافة السفلي من كل بئر.
    5. دوامه لوحه لتوزيع بالتساوي الخليط حول حافه البئر. ضع الصحن في حاضنه CO2 عند 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه للسماح بترسيخ المصفوفة.
    6. بمجرد ان المصفوفة قد عززت ، وتغطيه مع 1 مل من الثقافة الدافئة المتوسطة لكل بئر. لا تزعج حلقه مصفوفة غشاء الطابق السفلي. تهدف بعناية غيض ماصه والاستغناء عن الثقافة المتوسطة إلى وسط البئر.
      ملاحظه: يجب ان تكون حرارة متوسطه الثقافة إلى 37 درجه مئوية عندما تضاف إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي عززت. ستفقد مصفوفة غشاء القبو نزاهتها وتذوب عند تعرضها لوسائل الاعلام الباردة/الباردة.
    7. تجديد المتوسطة كل يومين. يستنشق بعناية ~ 500 μL من المتوسطة المستهلكة وأضافه 500 μL من الثقافة الدافئة الطازجة المتوسطة.
    8. مراقبه تشكيل بروستاسفيري والنمو لمده 5-7 أيام باستخدام المجهر المقلوب.
  2. تمرير البروستاسفيريس
    1. حصاد بروستاسفيريس من المصفوفة عن طريق الشفط بعناية قباله أكبر قدر ممكن من وسائل الاعلام. تجنب إزعاج أو التقاط القطع العائمة من مصفوفة عززت.
    2. أضافه 1 مل من محلول ديداز (مصفوفة غشاء الطابق السفلي: يوزع بنسبه 1:2). تخلط جيدا عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات.
    3. احتضان لوحات الثقافة في حاضنه CO2 في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    4. التقاط صور لبروستاسفيريس التي هي في الجزء السفلي من الطبق الثقافة لفرز عدد المجال وقياسات الحجم.
    5. جمع خليط الكره في أنبوب 15 مل. الطرد المركزي تعليق في 500 x g لمده 5 دقائق في RT إلى بيليه المجالات. يستنشق والتخلص من سوبرناتانت.
    6. تفريق المجالات في خلايا واحده عن طريق هضم مع 500 μL من الحارة 0.05 ٪ التريبسين/أدتا ونقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
    7. احتضان أنبوب الطرد المركزي في حاضنه CO2 في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    8. وقف العمل التريبسين مع 500 μL من تلفزيوني الدافئة التي تحتوي علي 10 ٪. تمرير التعليق المجال هضمها من خلال حقنه 1 مل مع 26 ز 5x ابره لفصل المجالات في خلايا واحده.
    9. الطرد المركزي تعليق في 500 x g لمده 5 دقائق إلى بيليه الخلايا في RT. يستنشق الفائق والتخلص منه.
    10. أعاده التعليق بيليه الخلية في 1 مل من الوسط الثقافة الدافئة وتصفيه من خلال 40 μm المسام حجم النايلون مصفاه الخلية.
    11. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g ل 5 دقيقه لبيليه الخلايا في RT. يستنشق والتخلص من supernatant.
    12. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من الجليد الباردة (1:1) مصفوفة غشاء الطابق السفلي/ثقافة المتوسطة والثقافة الفرعية في مصفوفة غشاء الطابق السفلي 3D للمرور الثاني لبروستاسفيري.

4. تحديد الخلايا الجذعية البروستاتا BrdU الاحتفاظ بها تلطيخ المناعية

  1. يتفوق علي بروستاسفيريس المرفقة تليها النيون المناعي (IF) تلطيخ للتصوير الخلايا الجذعية البروستاتا 2D.
    1. حصاد بروستاسفيريس بواسطة الهضم يوزع كما هو موضح في الخطوات 3-2-1-3-2-3. الطرد المركزي في المجالات في أنبوب 1.5 mL ميكروالطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل supernatant.
    2. أعاده التعليق المجالات في 1 مل من الثقافة الدافئة المتوسطة.
    3. احتضان ~ 50 بروستاسفيريس لكل بئر في 8 شرائح الغرفة بشكل جيد في 200 μL من الثقافة المتوسطة في الحاضنة 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها للسماح للمرفق والنمو من المجالات.
    4. في اليوم الثاني ، يستنشق ويتخلص من الثقافة المتوسطة. غسل المجالات التي تزرع مع 200 μL من تلفزيوني لمده 5 دقائق.
    5. إصلاح المجالات في 200 μL/بئر من الميثانول الجليد الباردة في-20 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    6. غسل المجالات مع 200 μL/well من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 2x.
    7. حمض غسل المجالات مع 200 μL/بئر من HCl 2N لمده 30 دقيقه في RT.
    8. غسل المجالات مع 200 μL/well من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 3x.
    9. أضافه 100 μL من الحل المانع الذي يحتوي علي 5% مصل الماعز الطبيعي في PBST (التلفزيونية مع 0.25% تريتون X-100) واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
    10. يستنشق قباله حل الحجب وأضافه 100 μL من PBST التي تحتوي علي 2% مصل الماعز العادي والماوس الاساسيه المضادة للإنسان BrdU الأضداد (1:200) لكل بئر وحضن في مربع ترطيب في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: يتم استخدام الأجسام المضادة الماوس مفتش كعنصر تحكم سلبي.
    11. يستنشق وأزاله الحل المضاد الأساسي. غسل المجالات مع 200 μL من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 2x.
    12. أضافه 100 μL من PBST التي تحتوي علي 2 ٪ المصل الماعز العادي والثانوية الماعز المضادة للماوس اليكسا فلور 488 الجسم (1:500) لكل بئر واحتضان في RT في الظلام لمده 2 ساعة.
    13. يستنشق وأزاله حل الأجسام المضادة الثانوية. غسل المجالات مع 200 μL من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 3x.
    14. جبل الشرائح مع ~ 25-40 μL من المتوسطة التركيب المائي التي تحتوي علي DAPI.
    15. الحصول علي صور للمجالات/الخلايا الملونة مع المجهر الفلورسنت وكاميرا رقميه ملونه.
  2. كامل جبل IF تلطيخ بروستاسفيريس للخلايا الجذعية البروستاتا التصوير 3D
    ملاحظه: لكامل جبل IF تلطيخ ، يتم التعامل مع بروستاسفيريس باستخدام أنابيب الطرد المركزي 1.5 mL الصغرى.
    1. حصاد البروستاسفيريس عن طريق الهضم يوزع كما هو موضح في الخطوات 3-2-1-3-2-3. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في أنبوب 1.5 mL ميكروالطرد المركزي في 500 x g ل 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل.
    2. أعاده التعليق وإصلاح المجالات مع 1 مل من بارافورمالدهيد 4 ٪ في RT لمده 20 دقيقه. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في 500 x g ل 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل.
    3. غسل المجالات عن طريق أعاده تعليق بيليه في 1 مل من تلفزيوني. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في 500 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل. كرر 1x.
    4. حمض غسل المجالات عن طريق أعاده تعليق بيليه في 1 مل من HCl 2N لمده 30 دقيقه.
    5. غسل المجالات مع 1 مل من تلفزيوني لمده 5 دقائق وأجهزه الطرد المركزي في 500 x g ل 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل. كرر 3x.
    6. أعاده التعليق ~ 15-30 المجالات في 100 μL من الحل المانع الذي يحتوي علي 5% مصل الماعز الطبيعي في PBST (التلفزيونية مع 0.25% تريتون X-100) واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
    7. لأزاله حل الحجب ، الطرد المركزي في المجالات في 500 x g ل 5 دقيقه. يستنشق وتجاهل supernatant.
    8. أعاده تعليق المجالات في 100 μL من PBST التي تحتوي علي 2 ٪ المصل الماعز العادي والماوس الاساسيه المضادة للإنسان BrdU الجسم (1:200) واحتضان في 4 °C بين عشيه وضحيها.
    9. غسل المجالات عن طريق أعاده تعليق بيليه في 1 مل من تلفزيوني. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في 500 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل. كرر 1x.
    10. أعاده تعليق المجالات في 100 μL من PBST التي تحتوي علي 2% مصل الماعز العادي والماعز الثانوية المضادة للماوس اليكسا فلور 488 الأضداد (1:1000) واحتضانها في RT ل 2 ح.
    11. غسل المجالات عن طريق أعاده تعليق بيليه في 1 مل من تلفزيوني. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في 500 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وتجاهل. كرر 1x.
    12. أعاده تعليق المجالات في 30-50 μL من المتوسطة المائية المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI. لمنع تسطيح المجالات ، والاستغناء عنها في خلق بئر من طبق ثقافة غير المصقول 35 mm مع غطاء من الزجاج السفلي. ثم أضف المشبك إلى طبق الثقافة ، الذي يغطي البئر.
    13. الحصول علي الكره بأكملها Z-كومه الصور باستخدام ضوء المنقولة النيون مقلوب المجهر البؤري. تحويل هذه الصور المكدس Z إلى صور ثلاثية الابعاد باستخدام برنامج التصوير مع قدرات الرسم حره.
      ملاحظه: يتم استخدام الأجسام المضادة الماوس مفتش كعنصر تحكم سلبي.
  3. تحليل الخلايا المقترنة (بروتوكول 4 أيام)
    1. ثقافة المجالات المسمية BrdU إلى اليوم 5.
    2. اليوم 1: حصاد المجالات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع 1 مل من الهضم يوزع. تفريق في خلايا واحده عن طريق 500 μL من الحارة 0.05 ٪ التريبسين/أدتا في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL كما هو موضح في الخطوات 3-2-1-3.2.11.
    3. أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الثقافة الدافئة.
    4. لوحه فرقت خلايا واحده (~ 300-500 في بئر) في 8 الشرائح الغرفة بشكل جيد والثقافة في 200 μL/بئر ثقافة متوسطه بين عشيه وضحيها للسماح للمرفق.
    5. اليوم الثاني: تغيير الثقافة المتوسطة مع 200 μL من 2 μM سيتوتشاسين د في الثقافة المتوسطة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية للسماح تقسيم خليه واحده ان يتوقف في وقت متاخر من الغيبية إلى انافاز.
    6. اليوم 3 – 4: يستنشق ويتخلص من الوسط. إصلاح الخلايا في 200 μL/بئر من الميثانول الجليد الباردة في-20 درجه مئوية لمده 20 دقيقه. اتبع بروتوكول المناعية ل BrdU كما هو موضح في الخطوات 4.1.5 – 4.1.14.
    7. التقاط صور من الخلايا المقترنة مع المجهر مضان. تاكد من ان المسافة بين النواتين اقل من 30 ميكرومتر. واستنادا إلى الاحتفاظ بالخلايا الجذعية المزدوجة ، يمكنك التعرف علي الخليتين الجذعين المقترنتين بتقسيم الخلايا المتناظرة أو غير المتناظرة.
      ملاحظه: الخلايا الجذعية البروستاتا الاحتفاظ بالتسمية BrdU الخضوع الانقسام المتماثل لإعطاء الخلايا الجذعية اثنين من ابنه الاحتفاظ بكميه متساوية من BrdU ، في حين ان الخلايا الجذعية التي تمر بقسمه غير متناظرة تؤدي إلى الخلية الجذعية ابنه واحده الاحتفاظ بجميع BrdU و الخلية الأخرى ابنه سلف التي فقدت التسمية brdu.

5. عزل الخلايا الجذعية البروستاتا الاحتفاظ بالتسمية CFSE بواسطة الفرز FACS

  1. اليوم الخامس: حصاد اليوم المسمي CFSE 5 بروستاسفيريس ينمو في 6 لوحات الثقافة بشكل جيد في ثقافة 3D عن طريق استبدال المتوسطة مع 2 مل من ديداز (مصفوفة غشاء الطابق السفلي: يوزع بنسبه 1:2). ماصه لاعلي ولأسفل عده مرات لخلط جيدا.
  2. احتضان لوحات في الحاضنة2 CO في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لهضم المصفوفة.
  3. جمع خليط الكره في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزه الطرد المركزي في المجالات في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق ماده طافي وتجاهل.
  4. أعاده تعليق الكره بيليه في 500 μL من الحارة 0.05 ٪ التريبسين/أدتا ، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
  5. احتضان المجالات في حاضنه CO2 في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق. أضافه 500 μl من تلفزيوني الدافئة التي تحتوي علي 10 ٪.
  6. تمرير المجالات من خلال حقنه 1 مل مع ابره 26 G 5x للفصل تماما في المجالات في خلايا واحده.
  7. الطرد المركزي الخلايا في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق وتجاهل supernatant.
  8. أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من الثقافة الدافئة المتوسطة التي تحتوي علي 1 ميكروغرام/مل بروبيديوم يوديد (PI) لتلطيخ الخلايا الميتة. احتضان لمده دقيقه واحده في RT.
  9. الطرد المركزي الخلايا في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق وتجاهل supernatant.
  10. أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الثقافة الدافئة. الطرد المركزي الخلايا في 500 x g لمده 5 دقائق في RT. يستنشق وتجاهل supernatant.
  11. أعاده تعليق الخلايا في 500 μL من وسط الثقافة الدافئة وجمع الخلايا في 5 مل البوليسترين أنابيب القاع المستديرة عن طريق تصفيه لهم من خلال 35 μm المسام حجم الخلية مصفاه قبعات المفاجئة.
  12. اجراء تحليل الخلايا البروستاسفيريه المسمية بوحدات التحويل الذاتي التي تمت تسميتها ب "التريبسين" مع محلل FACS أحادي القناة.
  13. بوابه السكان الفرعيين لل CFSE المجزاهمرحبا، Cfseميد، و cfseLo الخلايا. استخدام الضوابط السلبية والايجابيه لل النابضة.
    ملاحظه: وجود FACS فرزها الخلايا الجذعية البروستاتا الاحتفاظ بتسميه CFSE (انظر هو وآخرون13) يمكن تاكيدها بواسطة المجهر الأخضر مضان وحجم الخلية الأكبر مقارنه بالخلايا غير المحتفظ بها. هذا أكبر حجم الخلية هو خاصيه من الخلايا الجذعية البروستاتا بالنسبة لسكان الخلايا السلف. قد يكون هذا مختلفا مع أنواع الانسجه الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم وضع الاساسيه الطبيعية البروستاتا البشرية الخلايا الظهاريه في الاطباق الثقافة المغلفة fibronectin ويتم الحفاظ علي نمو الخلايا في الثقافة 2D (الشكل 1ا). عند نقلها إلى ثقافة 3D مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، والخلايا الظهاريه المتمايزة يموت ببطء. فقط الخلايا الجذعية ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تدفق الخلوي باستخدام عده علامات سطح الخلايا الجذعية هو نهج يستخدم عاده للبحوث الخلايا الجذعية علي الرغم من عدم وجود كل من الخصوصية والانتقائية1,5,6. في حين ان تشكيل كروي في نظام ثقافة 3d هو وسيله أخرى مفيده في إثراء الخلايا الجذعية النادرة م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين علاقات مالية للكشف عنها.

Acknowledgements

وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من المعهد الوطني للسرطان R01-CA172220 (المعمم ، WYH) ، R01-ES02207 (المعمم ، WYH). نشكر النواة تدفق الخلوية في جامعه إلينوي في شيكاغو للحصول علي المساعدة في فرز الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054
1 mL tuberculin syringesBectin DickinsonBD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishesCorning/Falcon353003
12-well culture plateCorning/Falcon353043
15 mL centrifuge tubesCorning/Falcon352097
22 x 22 mm coverslips, sqCorning284522For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslipsCorning2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needleMonoject1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottomMatTek CorpP35G-0-10-CGlass bottom No. 0, uncoated, figure-materials-994 irradiated
40 µm pore nylon cell strainerCorning352340
5% CO2 culture incubator, 37 °CForma
50 mL centrifuge tubesCorning/Falcon352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap capCorning35223535 µm nylon mesh
6-well culture platesCorning353046
8-well chamber slidesMillipore SigmaPEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPIVector LaboratoriesH-1200A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine)Sigma-AldrichB50021 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf
Centrifuge for 15 mL tubesBeckman CoulterAllegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)Thermo Fisher ScientificC345545 mM stock solution in DMSO
cytochalasin DThermo Fisher ScientificPHZ1063
Dispase 1U/mLStemCell Technologies07923
FACS CellSorter MoFlo XDPBeckman Coulters
Far-Red pro-dyeThermo FisherC345645 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
FibronectinSigma-AldrichF0895For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital cameraCarl ZeissAxioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo FisherA-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)Lifeline Cell TechnologyFC-0038Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red freeCorning356239
MethanolCorningA452-4
Mouse anti-BrdU antibodyCell Signaling5292S
Mouse IgG antibody (negative control)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Normal goat serumVector LaboratoriesS-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Sigma-AldrichP5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)Lifeline Cell TechnologyLL-0041
Propidium Iodide (PI)R & D Systems5135/1010 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope

References

  1. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
  2. Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
  3. Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
  4. Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
  5. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
  6. Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
  7. Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758(2014).
  8. Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
  9. Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
  10. Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
  11. Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
  12. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
  13. Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  14. Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
  15. Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012(2014).
  16. Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
  17. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved