בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Wen-Yang Hu; Dan-Ping Hu; Lishi Xie; Lynn A. Birch; Gail  S. Prins

doi:10.3791/60357

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

שימוש בתאי אפיתל הערמונית העיקרי האנושי, אנו מדווחים על שיטה ביוארינקר הרומן החופשי של אפיון פונקציונלי של תאים גזע דמוי על ידי שמירת תווית מבוסס ספרואיד מבוססי. פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור BrdU, CFSE, או הרחוק האדום תיוג תא 2D; היווצרות ספרואיד תלת מימדי; זיהוי תאים מתמך בתוויות באמצעות כימיה חיסונית מדומה; ובידוד על ידי FACS.

Abstract

למרות ההתקדמות במחקר תאי גזע מבוגרים, זיהוי ובידוד של תאי גזע מדגימות רקמה נשאר אתגר גדול. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית עם מרסנים נישה ברקמות מבוגרים, הם נכנסים למחזור התא בתרבות תלת-מימדית תלת ממדית (3D) ולעבור שתי החלוקה התא סימטרי ו אסימטרית, המעניקה הן גזע ומחולל קדמון תאים. האחרון מתרבים במהירות, הם אוכלוסיית התאים העיקריים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, היוצרים spheroids הטרוגנית. באמצעות העיקרי האנושי נורמלי האפיתל הערמונית תאים (HPrEC), מבוסס ספרואיד, שמירה על התווית שיטת השמירה פותחה כי מאפשר זיהוי ובידוד פונקציונלי של תאי גזע ספרואיד ליזום ברזולוציה תא יחיד.

HPrEC או קווי התאים הם דו מימדי (2D) תרבותי עם BrdU 10 ימים כדי לאפשר התאגדות שלה ל-DNA של כל התאים המפריד, כולל תאי גזע לחידוש עצמי. לשטוף את מתחיל עם העברה לתרבות תלת-ממד עבור 5 ימים, במהלכה תאי גזע להתחדש באמצעות חלוקה אסימטרית וליזום היווצרות ספרואיד. בעוד השקט יחסית בתאי גזע בת לשמור BrdU התווית DNA הורים, הבת ושלתי מתרבים במהירות, לאבד את תווית BrdU. BrdU יכול להיות החליף עם CFSE או בצבע אדום הפרו-צבעים, אשר להתיר בידוד תא גזע חי על ידי FACS. מאפייני תא גזע מאושרים על ידי היווצרות מחוץ למבחנה, בvivo רקמות התחדשות הרקמה, ועל ידי תיעוד חטיבות התאים סימטרי/אסימטרי שלהם. בודדים מותג תוויות בתאי גזע ניתן לחקור בקפדנות על ידי במורד לימודים מולקולריים הביולוגיים, כולל RNA-seq, שבב-seq, לכידת תא בודד, פעילות מטבולית, פרופיל פרוטדום, אימונולוציטוכימיה, היווצרות אורגאיד, והתחדשות רקמות vivo. חשוב לציין, זה מסמן הגישה חופשי גזע פונקציונלי בידוד מזהה תאים גזע כמו מדגימות סרטן טריים ושורות תאים סרטניים מאיברים מרובים, מציע ישימות רחב. זה יכול לשמש כדי לזהות את הסרטן כמו גזע תאים ביוארקרס, תרופות המסך מיקוד סרטן כמו תאים, ולגלות מטרות טיפוליות הרומן סרטן.

Introduction

בלוטת הערמונית האנושית מכיל אפיתל הלומינום עם תפקוד הפרשה ותאי בסיס המשמשים אותו יחד עם רכיב חריג מנוירואנדוקריניים תאים. התאים האפיתל, במקרה זה, נוצרות מאוכלוסיה נדירה של תאי גזע הערמונית כי הם השקט יחסית vivo ולפעול כמערכת תיקון כדי לשמור על הומאוסטזיס בלוטות ברחבי החיים¹. למרות מספר מקדמות, הבידוד ההזדהות והפונקציונלי של תאי גזע הערמונית נשאר אתגר גדול בתחום. תא גזע ביואריטים, כולל מתודולוגיות מבוססות סמן תא מבוסס בשילוב עם הזרמת cy, משמשים בדרך כלל עבור מחקר תאי גזע²^,³^,⁴. עם זאת, תוצאות עבור העשרה ובידוד להשתנות באופן נרחב כפונקציה של שילובים סמן ונוגדן ספציפיות⁵^,⁶, העלאת שאלות על זהותו של התאים המבודדים. גישה נוספת בשימוש נרחב עבור העשרה תאים גזע דמוי הוא תלת מימדי (3d) תרבות ספרואיד²^,³^,⁴. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית ב vivo עם מרסנים נישה, הם עוברים חלוקת התא בתרבות מטריקס תלת-ממד (הן סימטרי ו-אסימטרי), יצירת תאים גזע ומחולל קדמון במהירות להתרבות לכיוון שושלת היוחסין⁷^,⁸. הרורואידים שנוצרו הם תערובת הטרוגנית המכילה תאי גזע ותאים מחולל שלבים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, כולל מוקדם ומאוחר תאים בשלב הקדמון. כך, בחני אומר שימוש בspheroids כולו אינם תא גזע בלעדי, מה שהופך את הזיהוי של מאפייני תא גזע ייחודי לא חד-משמעית. לכן, זה קריטי ליצור בחני לזהות ולהפריד תאים גזע הערמונית ושלתי בתם. לקראת סוף זה, המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא להקים מערכת שיטה המאפשרת זיהוי יעיל ובידוד של תאי גזע מרקמות הערמונית האנושית ואחריו בדיקה חזקה במורד הזרם של התפקודים הביולוגיים שלהם.

לטווח ארוך 5-bromo-2'-deoxyuridine (bromo) תווית-שימור משמש רבות עבור vivo ובמעקב השושלת מבחנה של תאי גזע מבוסס על זמן ההכפלה הממושך שלהם⁹^,¹⁰. הגישה הנוכחית לזיהוי תא גזע הערמונית ובידוד המתואר בזאת מבוססת על המאפיין השקט היחסי שלהם והחזקת תוויות בתוך אוכלוסיית אפיתל מעורבת. יתר על כן, מבוסס על השערת ה-DNA גדיל הנצחי, רק תאי גזע יכולים לעבור חלוקת תאים אסימטריים. תא הגזע מייצג את התא הבת המכיל את ה-DNA הורים מבוגרים בעוד התא מחולל, שהוא תא הבת מחויבת, מקבל את ה-DNA החדש מסונתז. המאפיין תא גזע ייחודי המתואר לעיל הוא ניצל כדי לבצע תיוג BrdU בתאי גזע הורים בתרבויות הראשיות ולאחר מכן לעקוב אחר התווית שלהם בעקבות BrdU-כשלון בעת העברת 3D עוגן-התרבות ספרואיד ללא. בעוד שרוב התאים העיקריים האפיתל הערמונית לשמור על בסיס ומעבר הגברה פנוטיפ בתרבות 2d, יש גם אוכלוסייה נדירה של תאים גזע רב עוצמה מחידוש ושמירה על הומאוסטזיס אפיתל כפי שמעידים על ידי היווצרות spheroids^{או באופן}מלא אורגנואידים עם מדיה התרבות המתאימה^{עם העברת}מערכות 3d³ בפרוטוקול הנוכחי שלנו, באמצעות הערמונית hprec באמצעות spheroids או prostasphere מבוסס brdu, cfse, או שמירה האדום הרחוק בחני מיון הופעל על ידי האתר הפעיל פלואורסצנטית (facs), אנו מזהים בתאי גזע שמירת תוויות ב spheroids ברמת תא בודד¹³.

חשוב לעשות זאת, אנו מאשרים את תאי הגזע של תאים התומכים בתוויות בתוך השלב המוקדם בהשוואה לתאי הקדמון עם מחויבות השושלת. אלה כוללים החלוקה האסימטרית של תא גזע, ביכולת היווצרות מחוץ לתחום העור ובקיבולת התחדשות vivo רקמות, פעילות אוטומטית מוגבר, הריבובביוגנזה מורחבת וירידה בפעילות מטבולית. לאחר מכן, ניתוח RNAseq בוצע. דיפרנציאלי הביע גנים בתאים ספרואיד שמירת תוויות נצפו כי עשוי לשמש בסמנים הרומן עבור תאים גזע האדם הערמונית. זו הגישה מבוססי תווית שמירה על תוויות יכול לחול על דגימות סרטן כדי לזהות באופן דומה מספר קטן של תאים גזע דמוי סרטן, ובכך מספק הזדמנויות translational לנהל את אוכלוסיות עמידות טיפולית¹³. המוצג להלן הוא prostasphere מבוססי תווית שמירה שיטת השמירה באמצעות תאים האפיתל הערמונית העיקרי האנושי (HPrEC) כדוגמה.

Protocol

כל הטיפול בתאים וההכנות מדיה יש לבצע בטכניקת אספטי בקבינט בטיחות ביולוגית Class II (תואר ראשון).

1. תרבות ואחזקה של תאים HPrEC ב-2D

המעיל 100 מ"מ מנות תרבות עם 2 מ ל של 2.5 μg/ס"מ² fibronectin פתרון לילה בטמפרטורת החדר (RT). מייבשים את התמיסה ומאפשרים לתרבות להתייבש באוויר בתואר ראשון ל45 דקות. המטבח התרבותי מצופה Fibronectin ניתן לאחסן 2 – 4 שבועות ב -4 ° c.
הוסף 9 מ"ל של הצמיחה האפיתל הערמונית תא בינונית (g., PrEGM) כדי fibronectin מצופה 100 מ"מ מאכל התרבות ולשמור את התבשיל חם בחממה₂ ב 37 ° c.
הפשרת בקבוקון אחד של תאי HPrEC קפואים (2 x 10⁵/mL) באמבט מים 37 ° c ולהשעות מחדש את התאים ב 10 מ ל של בינוני חם.
צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
השהה מחדש ביסודיות את התאים ב-1 מ ל של מדיום התרבות החם. תאי הזרע על ידי ליטוף 1 מ ל של התא ההשעיה ישירות לתוך fibronectin מצופה 100 mm החברה המכילה 9 מ ל של מדיום prewarmed (הנפח הכולל של בינונית ותאים הוא 10 mL). הניחו מנות תרבות בחזרה לחממה של CO₂ ב-37 ° c.
. לחדש את המדיום כל יומיים כדי לעשות זאת, בזהירות לחמם את כל אמצעי התקשורת ולהוסיף 10 מ ל של מדיום טרי חם.
בעוד כ -5 ימים, יש לוודא כי התרבויות הן ~ 70 – 80% שוטפת. בצע את העיכול האנזימטי על-ידי החלת התאים עם 3 מ ל של 0.05% טריפסין/EDTA ב-37 ° צ' למשך 5 דקות.
להפסיק את העיכול על ידי הוספת 3 מ ל של PBS חם המכיל 10% FBS.
לאסוף את התאים לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL ו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב-RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
השהה מחדש את הגלולה ב 30 מ ל של בינוני חם ולחלק אותו באופן שווה לתוך שלושה חדש fibronectin מצופה 100 מ"מ מנות תרבות למעבר הבא.
הערה: התאים HPrEC הראשי יכול להיות passaged ~ 3 – 5x מבלי לשנות את המאפיינים הבסיסיים שלהם תאים אפיתל. אפיתל פנוטיפ נבדק על ידי ביטויים של בסיס סמנים תא אפיתל ציטוקרטין 5 ו p63 עם אימונוציטוטוכימיה/מאימונולואווראסאסארהאסלאו (ICC/IF) assays.

2. תווית HPrEC עם BrdU, CFSE, או הרחוק אדום pro-צבעים

הערה: התאים יכולים להמשיך או לשלב 2.1 או צעד 2.2 ואחריו העברה לתרבות prostasphere 3D כמתואר בשלב 3.1.

תיוג יחיד של תאים עם BrdU
1. תרבות 2 x 10⁵ תאים hprec ב fibronectin מצופה 100 מ"מ מנות תרבות עם 10 מ ל של בינוני חם המכיל 1 Μm של brdu. תרבות התאים 10 ימים (מעל שני מעברים) כדי להבטיח תיוג של כל התאים כולל גזע הערמונית ותאים מחולל.
2. לאחר 10 ימים, מטפי בקפידה את המדיום PrEGM המכיל את BrdU ולשטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS חם. חזור על 1x.
3. בצע את העיכול האנזימטי באמצעות 0.05% טריפסין/EDTA כמתואר בשלבים 1.7 – 1.8. צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
4. השהה מחדש את התאים בעלי תווית BrdU (5 x 10⁴) ב 500 μl של ice-קר (1:1) מטריצת קרום המרתף/בינוני והעברה לתרבות prostasphere 3d (המתואר בשלב 3.1) עבור 5 ימים כדי לאפשר כשלון brdu במהלך היווצרות ספרואיד (~ 6 מחזורי תא).
תיוג כפול של תאים עם BrdU ו CFSE או האדום הפרו צבעים
1. אם שיתוף תיוג עבור תאים חיים הוא הרצוי, לקחת התווית מראש תאים מודבטים עם BrdU במשך 10 ימים משלב 2.1 ושיתוף תווית עם 5 μM CFSE או הרחוק אדום חי פלורסנט לחיות עם צבעים עבור 30 דקות. בצע את התיוג המשותף ביום 10.
2. מאחד בזהירות את המדיום המכיל BrdU ו CFSE או האדום הפרו צבעים. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS חם. . חזור על הכביסה 1 x
3. בצע את העיכול האנזימטי באמצעות 0.05% טריפסין/EDTA כמתואר בשלבים 1.7 – 1.8. צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר ולמחוק את הסופרנטאנט.
4. השהה מחדש את התאים המסומנים בתווית (5 x 10⁴) ב 500 μl של קרח קר (1:1) מטריצות קרום מרתף/בינוני והעברה לתרבות prostasphere 3d (המתואר בסעיף 3.1) עבור 5 ימים כדי לאפשר brdu ו cfse או כשלון אדום הרבה במהלך היווצרות ספרואיד (~ 6 מ
בצע זיהוי של תאים התומכים בתוויות בתחומים (יום 5 prostaspheres) כפי שמתואר בשלבים 4.1, 4.2, 4.3, או 5.
הערה: Carboxyfluor, באמצעות הצבע האדום הרחוק הם לאורך זמן לטווח של הפלורסנט pro-צבעים ונשמרים היטב בתוך התאים המסומנים. התאיים אסטראז בתאים חיים קליב את קבוצות אצטט להפעיל את מולקולות פלורסנט ירוק או אדום כי הם כיום ממברנה כאמור.

3. היווצרות prostasphere במרתף הממברנה התלת-ממדית מערכת התרבות

תרבות prostasphere במערכת מטריצות ממברנה תלת-ממדית
1. הפשרת מטריצת הממברנה במרתף ב -4 ° c בלילה ושמרו על קרח לפני השימוש.
2. להוסיף בעדינות 1 מ ל של מטריצת הקרח קר המרתף קרום לתוך נפח שווה של מדיום התרבות קר הקרח. לערבב לאט על ידי ליטוף למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
  הערה: Pre-מעיל התחתון של 12 היטב צלחת החברה בארות עם 100 μL של פתרון זה. זה יהיה למזער את מספר התאים שנופלים דרך המטריצה ולצמוח כמונאולייר.
3. השעיה מחדש 5 x 10⁴ תאים hprec בקרח קר (1:1) מרתף קרום מטריצה/תרבות בינונית לערבב בנפח כולל של 500 μl.
4. פיפטה 500 μL של פתרון תא זה סביב השפה התחתונה של כל טוב.
5. מערבולת את הצלחת כדי לפזר באופן שווה את התערובת סביב שפת הבאר. מניחים את הצלחת בחממה של CO₂ ב 37 ° c עבור 30 דקות כדי לאפשר את המטריצה לגבש.
6. ברגע שהמטריצה הייתה מתמצקת, יש לכסות עם 1 מ ל של מדיום תרבות חמה לכל הטוב. אל תפריע הטבעת מטריצת קרום המרתף. מכוונים בזהירות את טיפ הפיפטה ומחלק את מדיום התרבות למרכז הבאר.
  הערה: המדיום התרבותי חייב להיות מחומם ל-37 ° c כאשר הוסיפו למטריצת הממברנה המותמצנת. מטריצת ממברנה המרתף יאבד את שלמות ולהתמוסס כאשר נחשף מדיה קר/קריר.
7. . לחדש את המדיום כל יומיים בזהירות ומחממים ~ 500 μL של בילה בינונית ולהוסיף 500 μL של מדיום טרי התרבות חם.
8. ניטור היווצרות prostasphere וצמיחה עבור 5 – 7 ימים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
המשך ההתיישנות
1. הקציר של היבול מהמטריצה על ידי בזהירות להדוף כמה שיותר מדיה. להימנע מטרידה או להרים חתיכות צף של המטריצה מתמצפה.
2. הוסף 1 מ ל של הפתרון dispase (ממברדת מרתף: dispase ביחס 1:2). מערבבים ביסודיות על ידי מלטף למעלה ולמטה מספר פעמים.
3. מודטה את לוחיות התרבות בחממה של CO₂ ב-37 ° c עבור 30 דקות.
4. לקחת תמונות של prostas, כי הם בתחתית הצלחת התרבות עבור ספירת מספר כדור וגודל מדידות.
5. לאסוף את תערובת הכדור לתוך שפופרת 15 מ ל. צנטריפוגה את ההשעיה ב 500 x g עבור 5 דקות ב-RT כדי גלולה הספירות. . מנושף ומוותר על הסופרנטאנט
6. פזר את הספירות לתאים בודדים על ידי עיכול עם 500 μL של חם 0.05% טריפסין/EDTA והעברת ההשעיה לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
7. מודרה את צינור המיקרוצנטריפוגה בחממה של CO₂ ב 37 ° c עבור 5 דקות.
8. לעצור את הטריפסין פעולה עם 500 μL של PBS חם המכיל 10% FBS. להעביר את ההשעיה הספירה מתעכל באמצעות מזרק 1 מ ל עם המחט 26 G 5x כדי לנתק את הספירות לתוך תאים בודדים.
9. צנטריפוגה את ההשעיה ב 500 x g עבור 5 דקות כדי לנקב את התאים בשעה RT.. מרוב הסופר ומתעלם
10. להשעות מחדש את הגלולה תא 1 מ ל של בינונית תרבות חמה ולסנן דרך מסננת מ40 יקרומטר בגודל הנקבוביות תא ניילון.
11. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות כדי לנקב את התאים בשעה RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
12. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של קרח קר (1:1) מרתף קרום מטריקס/תרבות בינונית ותת-תרבות בתוך מטריצה 3D קרום המרתף עבור המעבר השני של prostasphere.

4. זיהוי של תאי גזע בלוטת הערמונית שתמך על-ידי כתמים מאימונוללואות1

לאחר שהוא מכתים את ההדמיה המצורפת בעקבות הדמיה של תאי גזע הערמונית 2D.
1. בציר הקציר על ידי העיכול כמתואר בשלבים 3.2.1 – 3.2.3. צנטריפוגה את הספירות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ב 500 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
2. השהה מחדש כדורים ב-1 מ ל של מדיום תרבות חמה.
3. מודטה ~ 50 prostas, בשנת 8 היטב שקופיות קאמרית ב 200 μL של מדיום התרבות ב 37 ° c חממה בלילה כדי לאפשר את ההחזקה ואת הצמיחה של התחומים.
4. ביום 2, מנושף ומתעלם ממדיום התרבות. לשטוף את הספירות בעלי ממון עם 200 μL של PBS עבור 5 דקות.
5. תקן את הספירות ב-200 μL/מתנול קר הקרח ב-20 ° c עבור 20 דקות.
6. לשטוף את הספירות עם 200 μL/טוב של PBS עבור 5 דקות. חזור על 2x.
7. חומצה לשטוף כדורים עם 200 μL/הבאר של 2N HCl עבור 30 דקות ב RT.
8. לשטוף את הספירות עם 200 μL/טוב של PBS עבור 5 דקות. חזור על 3x.
9. הוסף 100 μL של פתרון חסימה המכיל 5% סרום עז רגיל PBST (PBS עם 0.25% טריטון X-100) ו דגירה עבור 30 דקות ב RT.
10. מתיש את פתרון חסימת ולהוסיף 100 μL של PBST המכיל 2% סרום עז נורמלי העכבר הראשי נגד האדם נוגדן BrdU (1:200) לכל היטב, מודדת בתיבה מחולל לחות ב 4 ° c לילה.
  הערה: הנוגדן IgG העכבר משמש כפקד שלילי.
11. מנושף ומסיר את פתרון הנוגדן העיקרי. לשטוף את הספירות עם 200 μL של PBS עבור 5 דקות. חזור על 2x.
12. הוסף 100 μL של PBST המכיל 2% סרום עז רגיל, עז משנית נגד העכבר אלקסה Fluor 488 נוגדן (1:500) לכל היטב, מודדת ב RT בחושך עבור 2 h.
13. מנושף ומסיר את פתרון הנוגדן המשני. לשטוף את הספירות עם 200 μL של PBS עבור 5 דקות. חזור על 3x.
14. טעינת השקופיות עם ~ 25-40 μL של מדיום הרכבה מימית המכילה DAPI.
15. השיגו תמונות של הכדוריות המוכתמות/תאים עם מיקרוסקופ פלורסנט ומצלמה דיגיטלית צבעונית.
הר שלם אם כתמים של הדמיה עבור הדמיית תא גזע הערמונית 3D
הערה: עבור הר שלם אם כתמים, prostas, מטופלים באמצעות 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות.
1. לקצור את ה3.2.1 על ידי העיכול, כפי שמתואר בשלבי שלבים – 3.2.3. צנטריפוגה את הספירות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ב 500 x g עבור 5 דקות. מרוב הסופר ומתעלם.
2. השהה מחדש ותקן את הספירות עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד ב-RT עבור 20 דקות. צנטריפוגה את הספירות ב 500 x g עבור 5 דקות. מרוב הסופרנטאנט ומתעלם.
3. לשטוף את הכדורים על ידי השעיית הגלולה ב 1 מ ל של PBS. צנטריפוגה את הספירות ב 500 x g עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ומתעלם. חזור על 1x.
4. חומצה לשטוף את התחומים על ידי השעיית הגלולה ב 1 מ ל של 2N HCl עבור 30 דקות.
5. לשטוף את הספירות עם 1 מ ל של PBS עבור 5 דקות ו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות. מרוב מנושאת הסופרנטאנט ומתעלם. חזור על 3x.
6. השהה מחדש ~ 15 – 30 כדורים 100 μL של פתרון חוסם המכיל 5% סרום עז רגיל PBST (PBS עם 0.25% טריטון X-100) ו דגירה עבור 30 דקות ב RT.
7. כדי להסיר את הפתרון חסימה, צנטריפוגה את התחומים ב 500 x g עבור 5 דקות. ולהשליך את הסופרנטאנט.
8. להשעות מחדש את הספירות ב-100 μL של PBST המכיל 2% סרום עז נורמלי העכבר הראשי נגד האדם נוגדן BrdU (1:200) ו דגירה ב 4 ° צ' לילה.
9. לשטוף את הכדורים על ידי השעיית הגלולה ב 1 מ ל של PBS. צנטריפוגה את הספירות ב 500 x g עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ומתעלם. חזור על 1x.
10. השהה מחדש את הספירות ב-100 μL של PBST המכיל 2% סרום עז רגיל ומשני עז נגד עכבר אלקסה Fluor 488 נוגדן (1:1000) ו-דגירה ב RT עבור 2 h.
11. לשטוף את הכדורים על ידי השעיית הגלולה ב 1 מ ל של PBS. צנטריפוגה את הספירות ב 500 x g עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ומתעלם. חזור על 1x.
12. השהה מחדש את הספירות ב-30 – 50 μL של מדיום הרכבה מימית המכילה DAPI. כדי למנוע שיטוח התחומים, לחלק אותם היטב נוצר מתוך מאכל התרבות 35 מ"מ בלתי מצופה עם תחתית זכוכית כיסוי. ואז להוסיף שמיכות לצלחת התרבות, המכסה את הבאר.
13. לרכוש כדור שלם Z-מחסנית תמונות באמצעות אור המשודר הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלית וקד פלורסנט. המרת תמונות Z מחסנית אלה לתמונות תלת-ממד באמצעות תוכנת דימות עם יכולות ציור חופשיות.
  הערה: הנוגדן IgG העכבר משמש כפקד שלילי.
ניתוח לשיוך תאים (פרוטוקול 4 ימים)
1. התרבות של הספירות BrdU המסומנות ליום 5.
2. יום 1: לקצור את הספירות מתוך מטריצת קרום מרתף עם 1 מ ל של העיכול dispase. להתפזר לתוך תאים בודדים על ידי 500 μL של חם 0.05% טריפסין/EDTA בצינור מיקרו-מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL כפי שמתואר בשלבים 3.2.1 – 3.2.11.
3. השהה מחדש את התאים באחד מ-mL של מדיום תרבות חמה.
4. צלחת התפזרו תאים בודדים (~ 300 – 500 לכל טוב) ב 8 היטב שקופיות קאמרית ותרבות ב-200 μL/טוב תרבות בינונית ללילה כדי לאפשר מצורף.
5. יום 2: לשנות את התרבות בינונית עם 200 μL של 2 μM ציטוצ'סין D במדיום התרבות ו-הדגירה לילה ב 37 ° צ' כדי לאפשר חלוקת תא אחד הפסקות במטא שלב מאוחר כדי אנאפיום.
6. יום 3 – 4: מנושף ומתעלם מהמדיום. תקן תאים ב-200 μL/היטב של מתנול קר קרח ב-20 ° c עבור 20 דקות. בצע את פרוטוקול הכתמים עבור BrdU כפי שמתואר בשלבים 4.1.5 – 4.1.14.
7. לקחת תמונות של תאים לזווג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית. ודא שהמרחק בין שני הגרעינים הוא פחות מ-30 μm. מבוסס על BrdU-שמירה, לזהות את תאי הגזע לזווג כאשר עוברים חלוקת תא סימטרית או אסימטרי.
  הערה: BrdU שמירת תוויות בתאי גזע הערמונית לעבור חלוקה סימטרית לתת עלייה שתי תאים גזע בת שמירה על כמות שווה של BrdU, בעוד תאי גזע שעברו חלוקה אסימטרית לתת העלייה תא גזע של בת אחת שמירה על כל BrdU ואת תא מחולל ביתי אחר שאיבד את תווית BrdU.

5. בידוד של התווית CFSE התומכים בתאי גזע הערמונית על ידי מיון FACS

יום 5: הקציר היום המסומן CFSE-5 prostas, גדל ב 6 היטב לוחיות התרבות בתרבות התלת-ממדית על ידי החלפת המדיום עם 2 מ ל dispase (מטריצה קרום מרתף: dispase ביחס 1:2). פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב היטב.
מעכלים את הצלחות בחממה של CO₂ ב 37 ° c עבור 30 דקות כדי לעכל את המטריצה.
לאסוף את תערובת הכדור לתוך שפופרת צנטריפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה את הספירות ב 500 x g עבור 5 דקות ב-RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט ולהיפטר
להשעות מחדש את כדור הכדור ב 500 μL של חם 0.05% טריפסין/EDTA, ולהעביר לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
מודפפת את הספירות בחממה CO₂ ב 37 ° c עבור 5 דקות. הוסף 500 μl של PBS חם המכיל 10% fbs.
להעביר את הספירות באמצעות מזרק 1 מ ל עם המחט 26 G 5x כדי לנתק לחלוטין את הספירות לתוך תאים בודדים.
צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
השהה מחדש את התאים ב-1 mL של בינוני תרבותי חם המכיל 1 μg/mL propidium יודיד (PI) כדי להכתים תאים מתים. דגירה עבור 1 דקות ב RT.
צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
השהה מחדש את התאים באחד מ-mL של מדיום תרבות חמה. צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות ב RT.. ולהשליך את הסופרנטאנט
השהה מחדש את התאים ב-500 μl של מדיום תרבות חמה ולאסוף את התאים ב 5 מ ל הצינורות התחתונים העגולים על ידי לסנן אותם דרך 35 יקרומטר בגודל הנקבוביות תא מסננת הצמד כובעים.
בצע את הניתוח של טריפסין-התפזרו CFSE שכותרתו תאים prostasphere עם מנתח FACS ערוץ יחיד.
שער אוכלוסיות משנה של משבר CFSE^Hi, Cfse^מד, ו cfse^Lo תאים. השתמש בפקדים השליליים והחיוביים לשימוש.
הערה: הנוכחות של FACS מיון CFSE תוויות בתאי גזע הערמונית (לראות Hu ואח '¹³) ניתן אישר על ידי מיקרוסקופית זריחה ירוקה וגודל התאים הגדול שלהם לעומת תאים שאינם תומכים. גודל התא גדול יותר הוא תכונה של תאי גזע הערמונית ביחס לאוכלוסיות תאים מחולל קדמון. זה יכול להיות שונה עם סוגים אחרים של רקמות.

תוצאות

בתאי אפיתל הערמונית האנושי העיקרי ממוקמים לתוך מנות התרבות מצופה fibronectin וצמיחת תאים נשמרת בתרבות דו-ממדית (איור 1א). עם העברת לתוך תרבות תלת-ממד עם מטריצה קרום המרתף, הבדיל תאים אפיתל למות לאט החוצה. רק תאים גזע הערמונית יכולים לשרוד בתרבות ללא עוגן ו-spheroids טופס ב 5 י?...

Discussion

הזרמת cy, לנסות באמצעות מספר סמנים פני השטח גזע היא גישה נפוץ עבור מחקר תאי גזע למרות המחסור הן ספציפיות ובסלקטיביות¹^,⁵^,⁶. בעוד היווצרות ספרואיד במערכת תרבות תלת-ממד היא עוד שיטה שימושית בהעשרת האוכלוסיה הנדירה של תאי גזע מתאי האפיתל העיקרי?...

Disclosures

למחברים אין קשרים פיננסיים לגלות.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). אנו מודים לליבת הזרימה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו לסיוע במיון תאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
1 mL tuberculin syringes	Bectin Dickinson	BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes	Corning/Falcon	353003
12-well culture plate	Corning/Falcon	353043
15 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm coverslips, sq	Corning	284522	For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips	Corning	2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle	Monoject	1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom	MatTek Corp	P35G-0-10-C	Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer	Corning	352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C	Forma
50 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap	Corning	352235	35 µm nylon mesh
6-well culture plates	Corning	353046
8-well chamber slides	Millipore Sigma	PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories	H-1200	A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002	1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)	Thermo Fisher Scientific	C34554	5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D	Thermo Fisher Scientific	PHZ1063
Dispase 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera	Carl Zeiss		Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 10⁵ cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free	Corning	356239
Methanol	Corning	A452-4
Mouse anti-BrdU antibody	Cell Signaling	5292S
Mouse IgG antibody (negative control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Propidium Iodide (PI)	R & D Systems	5135/10	10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope

References

Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154 spheroids

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: